Kísérleti munka allogén keratinociták transzplantációjáról fehér patkányok mesterségesen létrehozott hegeire

A sejtekben rejlő lehetőségek kihasználásának vágya és a hegek esztétikai megjelenésének javítására szolgáló új, hatékony módszerek iránti igény vezetett ahhoz az ötlethez, hogy megpróbálják tanulmányozni a keratinociták hegfelszínre történő átültetésének lehetőségét.

Annak bizonyítására, hogy a keratinocita-tenyészet valószínűleg javítja a hegek megjelenését, kísérleti vizsgálatot végeztek fehér laboratóriumi patkányokon, amelyeken hegfelületeket hoztak létre. A patkány hegmodelljét a háton, a gerinc mentén mesterségesen ejtett sebek gyógyulásával állították elő. A patkányokból azonos, 2x3 cm méretű bőrdarabokat vágtak ki. A "hegmodellezési" műtét után 2,5 hónappal a patkányokon dermabráziót (a heg felső rétegeinek eltávolítása termokaustikummal) végeztek, és allogén keratinocitákat ültettek be, amelyeket patkánykölykök bőréből izoláltak a születésük után 2-4 nappal.

A patkány epidermális sejtjeinek izolálását és tenyésztését az Orosz Tudományos Akadémia Citológiai Intézetének sejttechnológiai laboratóriumában végezték a következő technológia alkalmazásával.

A bőrt 200 U/ml gentamicint tartalmazó Hank-féle sóoldatban mostuk, majd 0,2-0,5 cm2-es apró darabokra vágtuk ^. A bőrdarabokat 0,5%-os diszpáz oldatban, kiegyensúlyozott só-foszfátpuffer oldatban inkubáltuk 37°C-on 1 órán át. A darabokat ezután Dulbecco-féle foszfátpuffer sóoldatba helyeztük, és az epidermiszt elválasztottuk a dermisztől. Az epidermiszt 0,125%-os tripszin oldatban inkubáltuk 10-15 percig, 50 fordulat/perc keverés mellett, majd az enzim hatását 5% magzati szarvasmarha-szérum hozzáadásával állítottuk le. A kapott sejtszuszpenzió egyharmadát tiszta formában használtuk fel a hegekre történő átültetés egyik lehetőségéhez, a második harmadát biokompatibilis "Polypor" háztartási filmbevonatokon, a harmadikat pedig szubsztrát nélküli Petri-csészéken növesztettük. A kapott hegek patkányokban történő dermabrázióját, majd a patkány epidermális sejtjeinek rájuk történő átültetését éteres altatásban, hőkauter segítségével végeztük.

Az első patkánycsoportnál a dermabrázió után steril batisztdarabokat helyeztek a heg polírozott, fiziológiás oldattal lemosott és megszárított felületére, amelyre allogén patkány epidermocitákból álló, rázott szuszpenziót vittek fel 1,5 millió sejt/ml koncentrációban (a Citológiai Intézet szerint). A batisztdarabokat a polírozott hegre helyezték úgy, hogy a sejtek a heg felszínén feküdjenek. A tetejére több réteg gézből álló kötést helyeztek, amelyet a heg széleihez varrtak.

A kapott sejtszuszpenzió egy részét Petri-csészékbe oltották, steril, a csészék formájára vágott Polypore fóliákra, a másik részét fólia nélküli Petri-csészékre. A tenyésztést FAD táptalajban végezték, amely DMEM és F12 táptalaj 3:1 arányú keverékéből állt, 10% magzati szarvasmarha-szérum, 5 μg/ml inzulin (Sigma), 0,5 μg/ml hidrokortizon-hemiszukcinát (Sigma) és 10 μg/ml epidermális növekedési faktor EGF (Institute of Citology RAS, Szentpétervár) hozzáadásával. A patkányok második és harmadik csoportját, egyenként 7 egyedből, az első után 6 nappal operálták. Ekkorra a Petri-csészékbe beoltott keratinociták szuszpenziójából többrétegű rétegek alakultak ki, amelyeket a patkányokba ültettek át. A második csoportba fóliára helyezett epidermocitákat, a harmadikba szubsztrát nélküli többrétegű réteget ültettek át. 7 nap elteltével a kapott, „Polypore” filmekre oltott, többrétegű allogén keratinocitákat (MPALK) tenyészetként közvetlenül a seb felületére ültették át. A filmet a szakadásának elkerülése érdekében többrétegű gézkötéssel rögzítették, és a patkányok bőrére varrták.

Mielőtt a keratinocitákat a szubsztrát nélkül tenyésztett patkányok harmadik csoportjába átültették volna, a PAC-t diszpázzal kezelték a Petri-csésze aljáról, amely képes szelektíven megszakítani a bőr-epidermális kötéseket. A többrétegű rétegre hatva a diszpáz megszakítja a bazális réteg sejtjeinek kapcsolatát a Petri-csésze aljával, és sokkal kisebb hatással van az intercelluláris kapcsolatokra, ami lehetővé teszi a réteg teljes „eltávolítását”. A többrétegű sejtréteg diszpázzal történő leválasztását a következőképpen végezték. A transzportközeget leeresztették a Petri-csészékről, a sejtrétegeket háromszor mosták antibiotikumot, különösen gentamicint (0,2 mg/ml) tartalmazó tápközeggel. A többrétegű rétegeket 0,125%-os diszpáz oldattal („Sigma”) töltötték fel, és termosztátba helyezték, ahol 37°C-on 20-30 percig inkubálták. A réteg kerületén leváló fehér perem megjelenése a Petri-csésze széleitől és aljától való leválás folyamatának kezdetét jelzi. Az elválasztási folyamat kezdete után néhány perccel a diszpáz oldatot leszívtuk, és az epiteliális rétegeket 2-3 alkalommal mostuk a táptalajjal. Az epidermális réteg felületére egy, a csésze méretére vágott steril "Lita-color" sebkötöző darabot vittünk fel, amelyre a diszpázzal elválasztott, a csésze aljáról egy spatulával leválasztott réteget ragasztottuk. Csipesz segítségével a réteget a "Lita-color" (Oroszország) szalvéta bevonatával együtt letéptük a Petri-csésze aljáról, és óvatosan átvittük a heg előkészített felületére. A "Lita-color" szalvéták gentamicint és exolint (kollagén kivonatot) tartalmaznak, amelyek a növekedési táptalaj maradványaival, majd fiziológiás oldattal megnedvesítve megduzzadtak, és modern sebkötözővé váltak, jó védelmet nyújtva a külső fertőzésekkel szemben, és a nedvességet elnyelő szerkezetnek köszönhetően gyors gyógyulást biztosítva.

Többrétegű gézkötéseket helyeztek a Polypore fóliákra és a Lita-color szalvétákra, és a patkányok bőrére varrták az erősebb rögzítés érdekében. Minden patkányt külön ketrecbe helyeztek, hogy optimális feltételeket teremtsenek a fenntartásához és az átültetett keratinociták beágyazódásához. Azoknak a patkányoknak a kötéseit, amelyekbe a szuszpenziót és a diszpázzal eltávolított epidermociták többrétegű rétegét átültették, naponta többször steril sóoldattal nedvesítették, hogy a sejtek beágyazódásához a lehető legkedvezőbb feltételeket teremtsék meg. Figyelembe véve, hogy a Polypore fólia vízzáró volt, a második csoportba tartozó patkányok kötéseit nem nedvesítették meg, ami az egyik előnye volt a fólia nélküli transzplantációval szemben. A kötéseket 10 nap elteltével eltávolították. A sejtátültetés utáni hegek klinikai képe kevéssé különbözött a transzplantáció nélküli hegektől, kivéve a rózsaszínűbb színüket (dermabrázió miatt) és a nagyobb mértékű hámlást. Ez a tény arra utal, hogy közvetlenül a sebkötések MPC-vel történő leesése után a hegben nem történt változás.

Biopsziás anyag vétele patkányokból.

A patkány allogén keratinociták fehér patkányok polírozott hegeibe történő átültetése után 1, 2, 5 és 9 hónappal szövettani, citomorfológiai és elektronmikroszkópos vizsgálatot végeztünk. Kontrollként normál patkánybőrből és sejtátültetés nélküli hegből vettünk mintákat. A patkányok altatását éteranesztéziával végeztük.

Az altatás után a megjelölt területekről hegszövetdarabokat vettünk, amelyekre keratinocitákat ültettünk át egy 2 mm átmérőjű biopsziás lyukasztóval, és 2,5%-os glutaraldehid oldatba helyeztük az anyagot az elektronmikroszkópos vizsgálathoz. A szövettani vizsgálatra vett szövetdarabokat 10%-os semleges formalinoldatba helyeztük, majd alkoholokon átengedtük és paraffinba ágyaztuk, végül ultravékony metszeteket vágtunk és fénymikroszkópban vizsgáltuk meg.

I. kontroll. Normál patkánybőr.

Annak érdekében, hogy látható legyen a különbség a normál, hegekkel módosított patkánybőr mikroszkópos képe és az MPC transzplantációja utáni bizonyos időpontokban keletkezett hegek között, a vizsgálat minden szakaszában fényképeket és leírásokat mutatunk be róluk.

A normál bőr felhámja 7-9 sejtrétegből áll. A stratum corneum közepes vastagságú. Egyes helyeken 6-8 réteg szaruhártya alkotja. A bazális réteget hengeres sejtek képviselik, nagy, világos, szabályos alakú magokkal és számos nukleólusszal. A sejtek közötti és a bazális membránnal való dezmoszomális kapcsolatok egyértelműen kifejeződnek. A jól definiált bazális membrán alatt, amelynek a szubepidermális rétegében kis kinövések vannak, azzal párhuzamosan finom kollagén- és elasztinrostok kötegei helyezkednek el, amelyek között megnyúlt fibroblasztok, kis erek találhatók. A mélyebb rétegekben a kollagén- és elasztinrostok kötegei különböző irányokban helyezkednek el. Ezek között számos, azonos kaliberű vékony falú ér, sejtes elemek (fibroblasztok, hízósejtek, leukociták) található. Nagyszámú szőrtüsző, faggyúmirigy található.

2. kontroll. Patkányheg, 2 hónapos.

Klinikai kép. A hegek halványrózsaszínek, hámlással, helyenként pörkösödés marad vissza. Területük a kollagénrostok összehúzódása miatt csökkent, és körülbelül 3,0-3,5 cm3-re csökkent ^. A bőrfüggelékek hiányoznak.

Mikroszkópos kép. Az epidermisz 3-5 hajtogatott sejtrétegből áll, melyeket lekerekített bazális sejtek, egy sor szubuláris sejt, 1-2 sor granuláris sejt keratohyalin szemcsékkel a felső rétegben, intracelluláris ödéma területek találhatók. A szaruréteg egyenetlenül változik, a nagyon vékonytól a megvastagodottig. A hegszövet (összehúzódása) miatt hegredőzés figyelhető meg. A redők behatolnak a papilláris rétegbe, és papillák benyomását keltik. Az epidermisz és a dermisz közötti határ egyenes vonal. Az alaphártya nem mindenhol követhető nyomon. A szubepidermális alsó és a mélyebb rétegekben vastag, laza falú erek találhatók, sok közülük lakatlan, pangásos. Az erek körül makrofágok, fibroblasztok halmozódnak fel. A makrofágok körülveszik a kapillárisokból felszabaduló eritrocitákat, és fagocitálják azokat. A felületesebb rétegekben apró kapillárisok találhatók. Az epidermisz alatt lazán helyezkednek el a kollagénrostok. A heg mélyebb rétegében durva kollagénrost-kötegek találhatók, amelyek között sok fibroblaszt található.

Patkányheg egy hónappal patkány keratinociták átültetése után.

Klinikai kép. A hegek rózsaszínűek, területük, különösen átmérőjük csökkent, átlagosan 2,5-3 cm2 ^. A haj és a faggyúmirigyek hiányoznak.

Az MPaLK filmre történő, illetve szubsztrát nélküli transzplantációjával kezelt patkányokból nyert anyag mikroszkópos vizsgálatának adatai gyakorlatilag megegyeznek. Tisztán technikailag azonban az MPaLK-val szubsztrát nélkül dolgozni sokkal bonyolultabb és fáradságosabb, mint az MPaLK szubsztráton történő tenyésztése, ezért a keratinociták hegekbe történő átültetésének kérdésének további vizsgálatakor többrétegű kambriumot ("szubsztrátok") használtunk a tenyésztés alapjául.

Mikroszkópos kép. Az epidermisz 15-20 rétegre való megvastagodása figyelhető meg, melynek majdnem közepéig a keratinociták keskeny, hosszúkás, függőleges alakúak és kompakt elrendeződésűek. A bazális sejtek egyenetlen vonalban helyezkednek el. Magjaik világosak, nagyok, lekerekítettek, egy vagy két nukleolusszal, ami magas szintetikus és proliferatív aktivitásukra utal. Az epidermisz és a dermisz közötti határ egyenes vonal. A tövisréteg jól fejlett, 3-5 réteg lekerekített sejtből áll, 2 nukleoláris sejt található benne.

Közvetlenül az alaphártya alatt sűrűn elhelyezkedő vékony kollagénrost-kötegek találhatók, velük párhuzamosan nagyszámú elhagyatott ér található, a mélyebben fekvő kollagénrostok durvábbak, sűrű kötegekben gyűlnek össze. Sok nagy fibroblaszt, hízósejt (2-3 a látómezőben), makrofág, leukocita és elhagyatott ér található, amelyek falai meglazultak, körülöttük lazán elhelyezkedő kollagénrostok találhatók. Egyes erekben pangás, a képződött elemek diapedézise van. Az erek körül fibroblasztok, egyes limfociták találhatók. A bőrfüggelékek hiányoznak.

Amikor egy keratinocita-szuszpenziót polírozott hegre ültetnek át, a mikroszkópos kép eltér az előzőtől. A legtöbb állatnál az epidermisz vékony, és 5-6 sejtrétegből áll. Az alsó réteg szabálytalan, sokszög alakú sejtekből áll, kerek-szabálytalan magokkal. A szubepidermális réteg állapota hasonló az MPALK transzplantáció nélküli állatcsoport állapotához.

Ebben az esetben beszélhetünk a sejtátültetést kísérő folyamatok késedelméről, vagy a szuszpenzió formájában átültetett sejtek jelentős elvesztéséről. Ezért arra a következtetésre jutottak, hogy a keratinociták szuszpenzió formájában történő átültetésével a hegkorrekció nem célszerű.

Patkányheg 2 hónappal patkány keratinociták transzplantációja után.

Klinikai kép. A heg vékony és érzékeny. Helyenként hámló és pikkelyes foltok figyelhetők meg.

Mikroszkópos kép. A stratum corneum megvastagodott, helyenként hiperkeratózis. Az epidermisz megvastagodott, 12-20 sejtsorból áll. Az epidermisz és a dermis közötti határ egyenes vonal. A epidermisz alatti finom kollagénrostok meglehetősen sűrűn helyezkednek el. A heg mélyebb rétegeiben nagy, durva kötegekben gyűlnek össze. A szubepidermális rétegben új érrendszeri képződmények jelennek meg. A hegszövet alsó rétegeiben számos elhagyatott ér található, amelyek párhuzamosan helyezkednek el az epidermisz felszínével. A nagy fibroblasztok egyenletesen oszlanak el a heg vastagságában, óriási, többágú, sok makrofág található.

Patkányheg 5 hónappal a patkány epidermális sejtjeinek átültetése után.

Klinikai kép. A heg egyenletes, sima, hámlás nélkül, egyes szőrszálak vannak jelen, sűrűségük nagyobb a hegek peremén, ami a szőrtüszők marginális benövésére és új szőrtüszők képződésére utal. A hegek területe folyamatosan csökken.

Mikroszkópos kép. Az epidermisz még vastag (15-20 réteg, néhol akár 30 is lehet), a felső rétegekben keratohyalin szemcsék töltik ki. Az alaphártya jól látható. Alatta lazán fekszenek a kollagénrostok. Az alsó rétegekben a kollagén erősebb és szorosabban illeszkedik. A kollagénkötegek között sok kapilláris található. A felső rétegekben az elhagyatott erek száma csökkent. Az epidermisz és a dermisz találkozási pontja enyhén hullámos. Egyes helyeken mély epidermális kinövések találhatók a hegszövetben. Az újonnan képződött erek láthatók a kollagénrostok között. Megjelennek egyes szőrtüszők és faggyúmirigyek.

Patkányheg 9 hónappal a patkány epidermális MPA sejtjeinek átültetése után.

Klinikai kép. A hegek mérete jelentősen kisebb lett a korábbi időszakokhoz képest, területük átlagosan körülbelül 1,5-2,0 cm2 ^. A hegek egyenetlenül borítottak finom szőrrel, különösen a peremükön. Enyhe finomlemezes hámlás maradt fenn.

Mikroszkopikus kép.

Az epidermisz elvékonyodott, 6-8 sejtsor alkotja, szerkezetében hasonlít a normál patkánybőr epidermiszéhez, csak a sejtsűrűség 1 mm-rel magasabb, és a sejtek kisebbek. Az alapréteg apró, kerek-hengeres sejtekből áll. Az alaphártya jól expresszálódik, a hemidesmoszómák jól láthatóak. Az epidermális kinövések jelenléte megfigyelhető a szubepidermális rétegben. A papilláris réteg a heg teljes hosszában kifejeződik. Ezek a tények arra utalnak, hogy ekkorra az átültetett keratinociták tapadása sokkal erősebbé vált az alatta lévő hegszövetekkel. Ezért az MPALK transzplantáción átesett emberek hegellátása 9 hónappal az MPC transzplantáció után hagyományos lehet. Az epidermisz alatt a kollagénrostok finomabbak, mint a mélyebb rétegekben. Számos ér jelent meg, különösen a felületesek. A nagyobb erek falai megvastagodtak. Nagy mennyiségben vannak szőrtüszők és faggyúmirigyek. A mikroszkópos kép a bőrszerű szövetre hasonlít.

Kísérleti munka eredményei és azok megvitatása.

A munka során különböző formájú keratinocitákat ültettek át mesterségesen létrehozott patkánybőr hegekre dermabráziós műtét után - sebtakarókra, szuszpenzióként batisztonra és többrétegű rétegként szubsztrát nélkül. A munka célja morfológiai adatok szerzése volt a transzplantált allogén keratinociták hegekre gyakorolt hatásáról, valamint az optimális transzplantációs lehetőségek meghatározása.

Megállapították, hogy mindhárom transzplantációs módszer megvalósítható, de az MPAC szubsztrát nélküli átültetése nagyon munkaigényes beavatkozás, amelynek során az MPAC károsodhat, ami befolyásolja a transzplantáció eredményét. Ráadásul ez a transzplantációs módszer kizárja a nagy felületeken végzett munkát.

A keratinocita szuszpenziós transzplantáció sokkal költséghatékonyabb módszer, nem igényel hosszú távú sejttenyésztést, és az általunk javasolt változatban egyszerű, steril batiszt mintákat használva, amelyek méretei megfelelnek a hegek méretének. A sejtszuszpenzió átültetése esetén a terápiás hatás körülbelül egy hónappal később jelentkezik, mint a sebbevonatra helyezett MPC esetében, ami nem jelentős szempont a több hónapos kezelési időtartam mellett. Ismert, hogy égési sérült betegeknél az MPC átültetése során a bőr szerkezetének átalakulása fokozatosan és több év alatt történik. A sebbevonatokra történő keratinocita tenyészet átültetése a legkényelmesebb és legígéretesebb módszer, de jelentősen drágább is. Ezenkívül jelenleg fejlettebb bevonási lehetőségek keresését igényli, amelyek rugalmasak, higroszkóposak, bakteriosztatikus vagy baktericid tulajdonságokkal rendelkeznek, és biológiailag semlegesek a sejtekre nézve. A "Polypor" fólia - a háztartási fóliás sebbevonat köztes változata - néhány tökéletlensége ellenére lehetővé tette számunkra, hogy kísérletben tanulmányozzuk a patkány keratinociták hegekre történő átültetését, és következtetéseket vonjunk le a hegkezelés ezen irányának hatékonyságáról.

Az égési sebekre MPC-t átültető szerzők megjegyezték, hogy a fertőtlenített sebekre többrétegű keratinocita-réteg átültetése utáni első héten a felhám megvastagodott és rétegződött. Az felhám minden rétege jól látható volt. Érdekes módon a transzplantátumokban a sejtrétegek száma 10-30%-kal nagyobb volt, mint a bőrbiopsziákban. A szerzők megjegyezték, hogy a keratohyalin granulátumok az MPC-transzplantáció utáni 5. napon, a bazális membrán és a hemidesmoszómák pedig már a 3. napon megjelentek.

J.Rives és munkatársai (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM és munkatársai (1998) kimutatták, hogy az égési sérülések utáni teljes vastagságú bőrhibákkal küzdő betegeknél az MPC transzplantációjának korai szakaszában a dermisz és a hámréteg közötti kapcsolat nagyon gyenge és egyenes vonalú, a papilláris réteg hiányzik. A 2. hónap végére sekély papillák és bőrfüggelékek kezdenek kialakulni, a dermisz és a hámréteg közötti kapcsolat megerősödik. Az irodalmi adatok azt mutatják, hogy az allogén keratinociták égési betegek sebeire történő átültetése ígéretes módszer. Annak ellenére, hogy az allogén keratinociták kilökődése – különböző szerzők szerint – 10 napon és 3 hónapon belül megtörténik, ennek ellenére szerepet játszanak a sebfelszín gyógyulásában, növekedési faktorok kiválasztásában és a hiba mechanikus lezárásában. Úgy vélik, hogy az MPALC-k csökkent antigén aktivitással rendelkeznek, mivel in vitro tenyésztés során elveszítik Langerhans-sejteket, ami lehetővé teszi számukra, hogy hosszú ideig létezzenek a recipiens szervezetében. Ezenkívül a fiatal, egészséges emberek bőréből nyert allogén tenyészet összehasonlíthatatlanul nagyobb biológiai potenciállal rendelkezik, mint a sérülés utáni betegek autológ tenyészete.

Tanulmányunk fő célja annak kiderítése volt, hogy az allogén keratinociták megtelepednek-e a hegekben, és milyen változások mennek végbe a hegszövetben egy ilyen biológiailag aktív "sebbevonat" hatására. Pozitív eredmény esetén a rehabilitációs orvoslás ezen területének leghatékonyabb és legkevésbé munkaigényes technológiáját fejleszteni.

Az általunk kapott adatok sok tekintetben hasonlóak voltak az irodalmi adatokhoz az emberi felhámban bekövetkező morfológiai változásokról, allogén keratinociták égési sebekbe történő átültetése után. Vannak azonban jelentős különbségek is, mind a transzplantáció morfológiai szubsztrátját, mind a technológiát tekintve. Így az alaphártya és a dermális-epidermális kapcsolatok (hemideszmoszómák, papillák) kialakulásának folyamata későbbi stádiumban történik, mint a keratinociták sebfelszínekre történő átültetése hegesedés nélküli átültetésekor. Nyilvánvalóan ez a hegszövet gyengébb tápanyag-ellátottsága miatt következik be a dermishez vagy az izomfasciához képest. A heg, különösen egy régi, egy sűrű kötőszövet, nagyon kevés érrel, míg az égési seb alja érben gazdag granulációs szövet. Így nyilvánvaló, hogy a keratinociták átültetésének és beágyazódásának feltételei teljesen eltérőek. Minél vaszkularizáltabb a sejtátültetési terület, annál könnyebb a beágyazódásuk folyamata. Ebből a posztulátumból következik az a következtetés, hogy előnyben részesítjük a fiatal hegekkel való munkát, amelyekben a kötőszövet még meglehetősen laza és érben gazdag.

E kísérleti munka eredményeként bebizonyosodott, hogy:

1. Az MPALK hegekre történő átültetése lehetséges.
2. A transzplantáció optimális módszere a keratinociták átültetése a sebfedőre.
3. A hegfelszínt sebészeti lézeres dermabrázióval vagy Schumann-csiszolóval kell polírozni.
4. Az MPALK hatása alatt a heg polírozott felületének gyors hámlása következik be.
5. Minél jobban vaszkularizált a hegszövet, azaz minél fiatalabb a heg, annál jobb eredményeket érhet el a keratinocita-transzplantáció során.
6. Az átültetett keratinociták hatására a hegszövet fokozatosan átalakul, és bőrszerűvé (lazább hegszövetté, bőrfüggelékekkel) alakul.
7. A hegszövet fokozatos fellazulása, kezdve a szubepidermális réteggel. Javul az érhálózata, a heg felső és alsó részén található kollagénrostok lazább elrendeződéssel rendelkeznek, mint a sejtátültetés nélküli hegszövetben. Megjelennek a szőrtüszők és a faggyúmirigyek. A felhám, miután átesett a hipertrófia fázisán, szerkezetében megközelíti a normál bőr felhámját.
8. A megfigyelt változások a keratinociták által kiválasztott növekedési faktorokhoz és citokinekhez kapcsolódnak, amelyek a hegszövet trofizmusának javításával elősegítik annak átalakulását a durva rostos szövetből lazább szövetté, ami a heg megjelenésének javulásához vezet.

Így ezen tanulmány alapján arra a következtetésre juthatunk, hogy az átültetett keratinociták jótékony hatással vannak a hegszövetre, aminek gyakorlati következményei lehetnek a különféle hegekkel küzdő betegek rehabilitációja szempontjából.

Ez a patkányokon végzett munka lehetővé tette számunkra, hogy megfogalmazzuk a keratinocitákat tenyésztő sebfedők követelményeit.

A sebkötszereknek a következőnek kell lenniük:

• sejtekkel biokompatibilis,
• lélegző,
• rugalmas, formázó alappal rendelkezik,
• hidrofil legyen,
• mivel a gyógyászati adalékanyagok antibakteriális gyógyszereket és antioxidánsokat tartalmaznak, amelyek nem toxikusak a tenyésztett sejtekre.

A hegek biotechnológiai kezelésének klinikai eredményei.

Korábban N. Carver és munkatársai (1993) megállapították, hogy az okklúziós kötszerek a legjobban elősegítik a sebhez való tapadást és a keratinociták túlélését, de nem teszik lehetővé a rétegzett (érett) epidermisz kialakulását. A rétegzett epidermisz kialakulásához levegős környezet szükséges. Ezért a többrétegű réteg felvitele után javasolták az okklúziós sebkötés 7-10 nap elteltével történő eltávolítását, és a sebek száraz kötszerekkel vagy vízben oldódó kenőcsökkel történő kezelését. Elmondható, hogy a sejtek tenyésztésére szolgáló "szubsztrát" minősége és tulajdonságai nagyon fontos szempontok a sejtes anyagátültetés hatékonysága, és ezáltal az orvosok munkájának eredménye szempontjából. De ma már nincs ideális sebkötöző, a javasolt lehetőségek bősége ellenére (műbőr, karboximetil-cellulózból készült nemszőtt szövet, fibrinbevonatok, féligáteresztő poliuretán filmek). Fontos szempont ebben a kérdésben a "szubsztrátok" (speciális sebtakarók) költsége, mivel magas költségük növeli a biotechnológiai kezelés összköltségét.

A sejttechnológiák hatékonysága a mai napig bizonyított, de sajnos ezek a technológiák nagyon drágák, különösen azokban az országokban, ahol a sejtösszetételek ipari termelése még nem alakult ki. Azonban olyan országok, mint az Egyesült Államok, már régóta kiépítették az égési transzplantációhoz szükséges sejtanyagok előállításának iparágát. Különösen a BioSurface Technology Inc. vállalat 1989 óta 37 000 többrétegű keratinocita réteget növesztett, amelyeket a világ 79 országában 240 beteg kezelésére használtak (R. Odessey, 1992), miközben 1 cm2 ^sejtkultúra körülbelül 7-8 amerikai dollárba kerül.

A különféle bőrbetegségek és -problémák kezelésének technológiája számos különbséggel rendelkezik, de minden sejtkezelés a kiváló minőségű sejtanyag megszerzésén és átültetésén alapul.

Ez a folyamat a következő lépésekből áll:

• bőr eltávolítása áldozatoktól (vagy donoroktól),
• bőrlebenyek szállítása egy biotechnológiai központba,
• a bazális réteg sejtjeinek izolálása és proliferációja,
• többrétegű keratinocita rétegek (MLK) növekedése.
• sejtkultúra-transzplantáció.

A többrétegű keratinocita lemezek transzplantációjával végzett kezelés fő problémája az életképes sejtek szükségessége a sejttranszplantáció minden szakaszában. Az autológ vagy allogén sejtek izolálásához használt bőrdaraboknak a lehető legvékonyabbaknak kell lenniük, mivel ebben az esetben könnyebb mechanikai és enzimatikus módszerekkel elválasztani őket, és élő sejtek szuszpenzióját nyerni a tenyésztéshez. Ezeket dermatómmal történő vágással vagy a szemhéjak, a fityma és a váll belső felületének felhasználásával lehet kinyerni. Mivel a sejtek érzékenyek a halogénekre (klór, jód), a hidrogén-peroxidra, nem használhatók fel a bőr feldolgozása során az anyaggyűjtés során.

A bőrátültetésekből származó sejtek mennyiségi és minőségi hozama, valamint tenyésztésük hatékonysága a donor egészségi állapotától és életkorától is függ. Ezenkívül a bőrbiopsziákat a lehető leggyorsabban és megfelelő körülmények között (környezet, hőmérséklet) kell eljuttatni egy erre a célra hitelesített és akkreditált laboratóriumba.

A bőrlebenyek tárolására és szállítására 10% marhaszérumot tartalmazó Eagle-féle vagy 199-es táptalaj, 5% magzati marhaszérumot tartalmazó DMEM táptalaj és antibiotikumok használhatók.

A citológiai laboratóriumban a bőrbiopsziát először mechanikusan apró darabokra osztják, majd a bőrdarabokat enzimek segítségével dolgozzák fel: tripszin, kollagenáz, diszpáz stb.

Az enzimek hatására a dezmoszómák elpusztulnak, és a keratinociták egyedi sejtek vagy különböző számú sejtből álló aggregátumok formájában kerülnek a táptalajba. A tenyésztéshez csak bazális keratinocitákat használnak, amelyeket speciális táptalajon, 5% CO2-t tartalmazó termosztátokban, Petri-csészékben vagy lombikokban tenyésztenek tenyésztve t = 37 °C-on. Már 48 óra elteltével megfigyelhető a keratinocita-telepek képződése, amelyek fokozatosan egyesülnek, és monoréteggé alakulnak. Miután elegendő számú sejtet kaptak, a kapott szuszpenziót erre a célra előkészített sebkötözőkre helyezik, és Petri-csészékbe helyezik. A szuszpenzióból először egy, majd egy többrétegű keratinocita-réteg alakul ki. A keratinocita-tenyésztési folyamat szakaszait a 12. ábra vázlatosan mutatja (33,43,54,65).

A transzplantációra alkalmas többrétegű keratinocita réteg kialakulása általában 7-10 napot vesz igénybe. Ez az időszak néha hosszabb is lehet, ami a forrásanyag minőségétől (a donor kora, egészségi állapota, az anyaggyűjtés helyessége, a használt táptalaj minősége stb.) függ. Ha a többrétegű réteg túlnő, akkor a felszínén olyan sejtek jelenhetnek meg, amelyekben az apoptózis jelensége nem megfelelő a transzplantációra. A sebtakarón tenyésztett többrétegű keratinocita rétegekkel (MLK) ellátott Petri-csészéket speciális tartályokban, legalább +15°C hőmérsékleten szállítják a klinikára.

Módosított Green-módszer az MPC termesztésére

Munkánkban többrétegű batisztot használtunk sebfedőként, elhagyva a patkánykísérletekben használt „Polypor” fóliákat. Így előzsírtalanított és steril batiszton növesztettünk többrétegű keratinocita rétegeket, bár ez sem optimális sebfedő.

A klinikai vizsgálatokat önkénteseken végezték a szükséges etikai normák betartásával: megállapodás aláírása és tájékoztatáson alapuló beleegyezés.

1. A beteg saját (autológ) és bankolt (allogén) keratinocitáinak tenyészetét használták.
2. A betegek saját keratinocitáit a felkarjuk belsejéből kivágott bőrdarabból nyerték.
3. A hegdermabráziós műtétet termokauterrel, forgókorongokkal és erbiumlézerrel végezték.
4. Normotróf, hipotróf és hipertróf hegekkel rendelkező betegek csoportjait vizsgálták.

A bőrhegek megjelenésének javítására szolgáló sejttechnológia alkalmazásának technológiai folyamata a következő szakaszokból állt:

1. Betegkiválasztás.
2. A kezelés lényegének magyarázata, a várható eredmények eléréséhez szükséges időkeret, a szerződés aláírása és a tájékoztatáson alapuló beleegyezés.
3. A műtét előtt 2-3 héttel a betegeknek selmevit 1 tablettát naponta 3-szor, zinctheral 1 tablettát naponta 3-szor kell felírni.
4. 2,0 cm hosszú és 0,7-1,0 cm széles bőrdarabot véve a váll belső felszínéről, magasan, majdnem az axilláris régió alsó részén, autológ keratinociták kinyerése céljából.
5. Azokban az esetekben, amikor a betegek a váll belső felszínén található lineáris heg lehetősége miatt nem voltak hajlandók saját keratinocitáikat izolálni, sejtes anyagot vettek egy sejtbankból (allogén keratinocitákból).
6. A keratinocitákat izolálták és egy erre a célra hitelesített laboratóriumban tenyésztették.
7. Miután elegendő mennyiségű MPC-t nyertek a hegekre történő átültetéshez, kitűzték a műtét napját a klinikán, ahol az anyagot speciális tartályokban, Petri-csészékben hozták be.
8. Hegdermabráziós műtétet végeztek, vérzéscsillapítást végeztek, a polírozott felületet steril sóoldattal mosták, szárították, majd az MPC-ket steril kambrikus "sejtekre lefelé" ültették rá. Vagyis az MPC-ben felül lévő sejtek alacsonyabbnak bizonyultak, a polírozott felület mellett.
9. Egy steril fóliát helyeztek a tetejére, amelyet rugalmas pólyával vagy rugalmas Omnifix ragtapasszal rögzítettek a bőrhöz. A fólia helyett szilikont tartalmazó indifferens sebkötszerek is használhatók, például Mepitel, Mepiform, szilikon géllapok.

5-7 nap elteltével a fóliát vagy szilikonbevonatot eltávolítják. Ekkorra az összes keratinocitáknak fel kellett mászniuk a polírozott hegre és hozzá kellett tapadniuk a felületéhez.

10. A fólia és a szilikonbevonat alatt létrejövő nedves környezet aktívan hozzájárul ehhez. A hegen ettől a ponttól kezdve visszamaradt batisztot curiosinnal vagy kitin géllel lehet áztatni. Ennek eredményeként a 2. napon sűrű kéreg keletkezik, amelyet a beteg kényelme érdekében érdemes egy rugalmas, lélegző tapasszal, például Omnifixszel rögzíteni. A lélegző kéreg lehetővé teszi a kialakult hám differenciálódását és érett bőrré alakulását.

A heg típusától és a csiszolás mélységétől függően a kötés 8-10 nap után kilökődik. Ekkor a felhám 30-40%-kal több sejtréteggel rendelkezik, mint a normál bőrben. Az alaphártya nem alakul ki. A megvastagodott felhám keratinocitái sok biológiailag aktív molekulát választanak ki a hegszövetbe.

A biotechnológiai hegkezelés sikere nagymértékben függ a posztoperatív időszakban alkalmazott ápolási módszertől. A sejtkultúrák a sebek „gyengéd” kezelésének egyik fajtája, és a transzplantáció utáni korai szakaszban az IPC-k könnyen leválaszthatók az alatta lévő szövetekről. Ezért a betegeknek azt tanácsoljuk, hogy a műtét után óvatosan kezeljék a heget. 8-9 hónapig ne dörzsölje, és hideg, forralt vízzel óvatosan kezelje, hogy elkerülje a vékony, újonnan képződött hámréteg leszakadását, amely nem rendelkezik szoros kötést az alatta lévő szövetekkel.

Jegyzet.

Műtét előtt és dermabrázió során halogénezett antiszeptikumok és oxidálószerek (jódpiron, szuliodpiron, jodinol, jódát, klórhexidin, hidrogén-peroxid) használata megengedett, sejtátültetés előtt - citotoxikus hatásuk miatt szigorúan ellenjavallt. A metilénkék és a briliánszöld szintén mérgező a sejtekre.

A fertőzés elkerülése érdekében, különösen hipertrófiás hegek esetén, a műtéti területet neomicin-szulfáttal, polimixinnel vagy gentamicinnel lehet kezelni. Ezeknek nincs citotoxikus hatásuk a keratinocitákra.

Az ilyen kezelés eredményeként hármas hatás érhető el.

1. A heg felületének kiegyenlítése.
2. Egy új, normál vastagságú epidermiszréteg kialakulása felette.
3. A hegszövet átalakulása bőrszerű szövetté a transzplantált sejtek által kiválasztott citokinek, növekedési faktorok és más biológiailag aktív molekulák – keratinociták, fibroblasztok és makrofágok – általuk stimulált hatására.

A heg kevésbé észrevehetővé, rugalmasabbá válik, pórusok és vellusz szőrzet jelenik meg benne, és a pigmentáció helyreállhat az IPC-ben található melanociták jelenléte miatt.

A heg ezen pozitív aspektusai azonban nem jelentkeznek azonnal. E tekintetben figyelmeztetni kell a betegeket, hogy a hegszövet bőrszövetté alakulásának folyamata lassan zajlik le, és az ilyen kezelés optimális eredménye legkorábban 10-14 hónap múlva várható. Közvetlenül a kötszerek elutasítása után a polírozott felületek kifejezett polikrómiával rendelkeznek, minél világosabb, annál mélyebbre polírozták. A bőrt a normotróf hegek erbiumlézerrel történő polírozása károsítja a legkevésbé. A hegek és a környező bőr színe 3-8 héten belül helyreállt. Az ilyen óvintézkedések ellenére néha előfordulhat posztoperatív hiperpigmentáció, amely néhány hónapon belül magától eltűnhet.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]