Az osteoarthritis kísérleti modelljei

A porc egy magasan specializálódott szövet, amely csak egyféle sejtet (kondrocitákat) tartalmaz, és jellemző rá a vér- és nyirokerek hiánya. A porcot főként az ízületi folyadékból felszívódó anyagok táplálják. A kondrocita-anyagcserét számos oldható faktor szabályozza, amelyeket lokálisan a kondrociták és a környező szövetek termelnek. A kondrocita-funkció az extracelluláris környezet összetételétől (oxigénfeszültség, ionkoncentráció, pH stb.), az ECM összetételétől, a sejtek és a mátrix kölcsönhatásától, valamint a fizikai jelektől is függ. A kísérleti modellezés fő célja tenyészetek létrehozása az extracelluláris környezetben az érett sejtek fenotípusának megváltoztatása nélkül. A második cél olyan tenyészetek létrehozása, amelyekkel tanulmányozható a kondrociták korai, késleltetett, rövid távú vagy elhúzódó válasza a kémiai és/vagy fizikai jelekre. Az in vitro vizsgálatok lehetőséget adnak a kondrociták viselkedésének tanulmányozására oszteoartrózisban is. A harmadik cél olyan kokultúrás rendszerek kifejlesztése, amelyek lehetővé teszik az ízületben lévő különböző szövetek kölcsönhatásainak tanulmányozását. A negyedik feladat a porcimplantátumok előkészítése a későbbi transzplantációhoz. Végül az ötödik feladat a reparációt serkentő és/vagy a porcreszorpciót gátló növekedési faktorok, citokinek vagy terápiás szerek vizsgálata.

Az elmúlt évtizedekben az ízületi porc sejtkultúráinak különféle modelljeit hozták létre, beleértve az egyrétegű tenyészeteket, a szuszpendált tenyészeteket, a kondrontenyészeteket, az explantátumokat, a kokultúrákat és az immortal sejtkultúrákat. Minden kultúrának megvannak a maga előnyei és hátrányai, és mindegyik alkalmas a kondrocita-anyagcsere egy-egy specifikus aspektusának tanulmányozására. Így a porcexplantátumok kiváló modellt jelentenek a mátrixelemek forgalmának tanulmányozására, amelyhez valódi sejtfelszíni receptorok, valamint normál sejt-mátrix és mátrix-sejt kölcsönhatások szükségesek. Ugyanakkor ajánlott a mátrixlerakódásokat vagy a kondrocita-anyagcserét szabályozó mechanizmusokat izolált sejtek kultúráján vizsgálni. A sejtek differenciálódásának folyamatának tanulmányozásához alacsony sűrűségű egyrétegű tenyészet szükséges. A természetes vagy szintetikus mátrixban szuszpendált tenyészetek modellként szolgálnak a kondrociták mechanikai stresszre adott adaptív válaszának elemzésére.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Kondrocita kultúrák

Az in vitro vizsgálatokhoz szükséges porcszövet kiválasztásakor számos fontos szempontot kell figyelembe venni. A kondrociták mátrixösszetétele és metabolikus aktivitása ízületenként változó, ez utóbbi pedig a kondrocita szövetbeli elhelyezkedésének mélységétől is függ. Ezeket az adatokat számos kísérletben szerezték be, amelyekben különböző mélységű porczónákból izolált kondrocita-alpopulációkat vizsgáltak. Számos morfológiai és biokémiai különbséget találtak az ízületi porc felszíni és mély rétegeiben található tenyésztett kondrociták között. A felszíni sejtek ritka, proteoglikánban szegény fibrilláris mátrixot szintetizálnak, míg a mélyebb sejtek fibrillákban és proteoglikánokban gazdag mátrixot termelnek. Ezenkívül a felszíni sejtek viszonylag több apró, nem aggregált proteoglikánt és hialuronsavat, és viszonylag kevesebb aggrekánt és keratán-szulfátot termelnek, mint a mélyebb porcsejtek. A különböző mélységű porczónákból izolált kondrociták anyagcseréjének egy másik fontos megkülönböztető jellemzője az exogén ingerre adott válasz. M. Aydelotte és munkatársai szerint a porc felszíni zónájából származó szarvasmarha-kondrociták érzékenyebbek voltak az IL-1-re, mint a mély zónából származó sejtek.

A sejtek viselkedése a szövetek elhelyezkedésétől is függ. Ugyanazon állat borda- és fülporcából származó porcsejtek eltérően reagálnak olyan növekedési faktorokra, mint a fibroblaszt növekedési faktor (FGF) és a TGF-béta. Az FGF fokozta a timidin, prolin és leucin beépülését a tenyésztett bordaszövetbe, de nem a fülporcsejtekbe. A TGF-béta fokozta a timidin beépülését a bordaszövet és a fülporcsejtekbe, de nem befolyásolta a timidin és a prolin beépülését a fülporcsejtekbe. A nagy terhelésnek kitett területekről származó porcsejtek különböznek a porc alacsony terhelésének kitett területekről származó sejtektől. Így az érett juh térdízületi porcának a sípcsont ízületi felszínének középső régiójából származó, meniszkusz által nem fedett, in vivo legnagyobb terhelést viselő régiójából származó porcsejtek kevesebb aggrekánt, de több dekorint szintetizálnak, mint a meniszkusz által borított zónákból származó sejtek. A szerzők hangsúlyozzák az azonos ízületi zónákból származó porc használatának fontosságát az ízületek szintetikus funkciójának vizsgálatakor.

A porcsejtek anyagcseréje és a szabályozó faktorokra adott válaszuk jelentősen függ a donor életkorától, csontvázfejlődésétől és az ízületek állapotától, amelyekből a sejteket vették. Az emberi porcsejtekben a proliferatív válasz jelentős csökkenése figyelhető meg az életkorral. A legnagyobb csökkenést a 40-50 éves és a 60 év feletti donoroknál figyelték meg. Ezenkívül a növekedési faktorokra (pl. FGF és TGF-béta) adott proliferatív válasz súlyossága az életkorral csökken. A porcsejtek proliferációjának mennyiségi változásai mellett minőségi változások is megfigyelhetők. A fiatal donoroktól (10-20 év) származó sejtek jobban reagálnak a vérlemezke eredetű növekedési faktorra (PDGF), mint a TGF-bétára, míg a felnőtt donoroktól származó sejteknél az ellenkezője figyelhető meg. Számos mechanizmust alkalmaznak a porcsejtek szintetikus funkciójának és a növekedési faktorokra adott válaszának életkorfüggő változásainak magyarázatára. Ezek közé tartozik a felszíni sejtreceptorok számának és affinitásának csökkenése, a növekedési faktorok és citokinek szintézisének és bioaktivitásának változásai, valamint a posztreceptor jelek módosulása.

Az ízületek kóros állapota a porcsejtek morfológiáját és metabolikus aktivitását is megváltoztatja. Így J. Kouri és munkatársai (1996) három porcsejt-alpopulációt azonosítottak oszteoartrózis esetén. A porc felszíni és középső részének felső részéből származó porcsejtek klasztereket alkotnak, és nagyobb mennyiségű proteoglikánt és kollagént szintetizálnak. A TGF-béta és az inzulinszerű növekedési faktor (IGF) képesek stimulálni a porcsejtek proteoglikánok szintézisét, és részben semlegesíteni az IL-1 és a TNF-a hatását. Az oszteoartrózis által érintett porc explantátumai és az oszteoarthrosisos beteg porcából izolált porcsejtek érzékenyebbek a TGF-béta stimulációjára, mint az egészséges porc porcsejtjei. Ezek a különbségek valószínűleg az ízületi porc felső rétegeiben található porcsejtek fenotípusos változásaival kapcsolatosak.

Az egyes porcsejtek izolálását az ECM proteolitikus enzimekkel történő egymást követő kezelésével érik el. Az ECM-ből való felszabadulásuk után az izolált sejtek ideálisak a mátrixkomponensek de novo szintézisének vizsgálatára. Egyes szerzők csak klostridiális kollagenázt használnak, míg mások tripszinnel, pronázzal, DNázzal és/vagy hialuronidázzal előinkubálják a porcot. Az izolált sejtek száma az alkalmazott enzimektől függ. Így, ha csak kollagenázzal kezelik, 1 g szövetből ^{1,4-106 porcsejt nyerhető, míg pronáz, hialuronidáz és kollagenáz alkalmazásával -4,3-106}. Kollagenázzal kezelve az aggrekán, a fehérjék, az IL-6 és az IL-8 szignifikánsan nagyobb mennyiségben maradnak a sejtkultúrában, mint különböző enzimekkel történő egymást követő kezelés esetén. A két sejtkultúra közötti különbségekre több magyarázat is van:

• A sejtreceptorokat enzimek károsítják vagy gátolják, a TGF-béta frissen izolált porcsejtekben (1. nap) gátolja a DNS és a proteoglikán szintézisét, míg az egyrétegű tenyésztésben (7 nap) lévő porcsejtekben a DNS és a proteoglikán szintézisét a TGF-béta stimulálja. A kísérlet megkezdése előtt azonban megfelelő időre van szükség ezen membránkomponensek újbóli expressziójához.
• Az exogén proteázok megzavarhatják az integrin által közvetített sejt-mátrix kölcsönhatást. Az integrin család elősegíti a porcsejtek ECM-molekulákhoz való kapcsolódását (Shakibaei M. et al., 1997). Ez a zavar befolyásolhatja a mátrixgének expresszióját.
• A mátrixkomponensek maradványai szabályozhatják a kondrociták szintetikus funkcióját. Az integrinek képesek felismerni az ECM lebontásának termékeit, így fontos szerepet játszanak a szövetek regenerálódásában a proteolitikus enzimek hatása után. T. Larsson és munkatársai (1989) arról számoltak be, hogy az ép vagy fragmentált proteoglikánok hozzáadása a sejtkultúrához serkenti a fehérjék és proteoglikánok szintézisét. A hialuronsav magas szintje azonban jelentősen csökkenti a szulfátok beépülését a proteoglikánok szintézisébe csirkeembrió-kondrocitákban, sertés-kondrocitákban és patkány-kondroszarkóma sejtekben. Ezenkívül a hialuronsav gátolja a proteoglikánok felszabadulását a sejtekből még IL-1b, TNF-α és FGF jelenlétében is, ami a növekedési faktorok és citokinek elsődleges biológiai aktivitásának ellensúlyozására utal. A hialuronsav hatásának pontos mechanizmusa továbbra sem tisztázott; ismert, hogy a kondrociták a citoszol aktin filamentumaihoz kapcsolódó hialuronsav-receptort tartalmaznak. A hialuronsav receptorhoz való kötődése serkenti a fehérjefoszforilációt. Így ezek az adatok a kondrocita metabolikus funkciójának modulációját mutatják a mátrixfehérjék fragmentált vagy natív molekulái által a sejtmembrán receptorok aktiválásán keresztül.
• Az enzimek által a porcsejtek által kiváltott mátrixfehérje-szintézis gyors stimulációja a porcsejtek alakjának változásainak és/vagy a citoszkeleton reorganizációjának következménye lehet.
• Néhány citokin (pl. IL-8) és növekedési faktor (pl. IGF-1, TGF-β) az ECM-ben (elektronmag-sejtközépmag-membránban) elkülönül. A legismertebb példa a TGF-β dekorinhoz való kötődése, ami az előbbi sejtnövekedést kiváltó képességének csökkenéséhez vezet kínai hörcsög petefészek sejtekben. Az a megállapítás, hogy a porc dekorintartalma az életkorral növekszik, a TGF-β biohasznosulásának csökkenésére utal az öregedéssel. A növekedési faktorok és citokinek a mátrixtörmelékből szabadulhatnak fel a tenyészet során, és ezt követően modulálhatják a kondrocita-funkciót.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Kondrociták egyrétegű kultúrája

A porcsejtek differenciált fenotípusát elsősorban a II-es típusú kollagén és a szövetspecifikus proteoglikánok szintézise, valamint az alacsony mitotikus aktivitás jellemzi. Bizonyítékok vannak arra, hogy a monorétegben történő hosszan tartó sejtkultúra, valamint több ismételt sejtpasszázs után a porcsejtek elveszítik gömb alakú körvonalaikat, és megnyúlt, fibroblasztszerű alakot vesznek fel. Ilyen fibroblasztikus metaplázia esetén a sejtek szintetikus funkciója is módosul, amelyet a II, IX és XI típusú kollagének szintézisének fokozatos csökkenése, valamint az I, III és Y típusú kollagének szintézisének növekedése jellemez. A funkcionális aggrekán miatt kis, nem aggregált proteoglikánok szintetizálódnak. A katepszin B és L szintézise rendkívül alacsony a differenciált sejtekben, de a differenciálódás elvesztésének folyamatában fokozódik. A kollagenáz-1 expresszálódik a differenciált porcsejtekben; hosszan tartó tenyésztéssel expressziója csökken, míg a metalloproteinázok szöveti inhibitorainak (TIMP) termelése fokozódik.

A differenciált porcossejtek újra expresszálják a differenciált fenotípusú kollagént, amikor egyrétegű tenyészetből szuszpendált tenyészetbe kerülnek. A differenciálódási folyamat valószínűleg a sejt alakjához kapcsolódik. Ezt a tulajdonságot rendszeresen használják a kutatók, akik autológ porcsejtekkel végzett hibás graftokat vizsgálnak. A biopsziás anyagból nyert kis számú sejt egyrétegű tenyészetben szaporítható, majd a transzplantáció előtt visszajuttatható egy háromdimenziós mátrixba. Az agaróz tenyészetbe átvitt dedifferenciált porcossejtek egy specifikus fenotípusának újraexpressziója TGF-β, osszein-hidroxiapatit komplex és aszkorbinsav segítségével stimulálható.

A növekedési faktorokra és citokinekre adott válaszként a porcsejtek módosulnak a differenciálódási folyamat során. A citokinekre és növekedési faktorokra adott sejtes válasz eltérő a differenciálatlan és a differenciálatlan porcsejtek között. Az IL-1 stimulálja a fibroblaszt proliferációt, míg a differenciálatlan porcsejtek növekedését az IL-1 gátolja. A DNS-szintézist az IGF-1 stimulálja a megnyúlt, de nem ellaposodott porcsejtekben. A differenciálódott porcsejtekben az IL-1béta és a TNF-α stimuláló hatása a prokollagenáz termelésre kifejezettebb, mint a differenciálatlan porcsejtekben.

Kondrocita-tenyésztés

A porcsejtek folyékony közegben vagy természetes vagy szintetikus háromdimenziós mátrixban történő szuszpenzióban történő tenyésztése stabilizálja a porcsejtek fenotípusát. A sejtek megtartják gömb alakjukat és szövetspecifikus fehérjéket szintetizálnak. A porcsejtek szuszpendált tenyészetét általában az új pericelluláris mátrix kialakulásának vizsgálatára ajánlják. A porcsejtek szintetikus vagy természetes abszorbens polimerekben történő tenyésztését a sejtek porcidózisokba történő beültetésére használják, az ízületi porcszövet regenerációjának serkentésére. A beültetett sejtek szintetikus vagy természetes közegének számos követelménynek kell megfelelnie:

• az implantátumoknak porózus szerkezettel kell rendelkezniük a sejtek tapadásához és növekedéséhez,
• sem maga a polimer, sem bomlástermékei nem okozhatnak gyulladást vagy toxikus reakciókat in vivo beültetéskor,
• a grafthordozónak képesnek kell lennie a szomszédos porchoz vagy porc alatti csonthoz kötődni,
• a természetes vagy szintetikus mátrixnak képesnek kell lennie abszorpcióra, lebomlását szövetregenerációval kell egyensúlyba hozni,
• A porc helyreállításának elősegítése érdekében a mátrix kémiai szerkezetének és pórusszerkezetének elő kell segítenie a sejtes fenotípus fenntartását és a szövetspecifikus fehérjék szintézisét a benne elhelyezett porcsejtek által,
• Az in vivo implantáció során szükséges a szintetikus vagy természetes mátrix mechanikai tulajdonságainak vizsgálata.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Kondrociták szuszpenziója folyékony fázisban

A sejtek műanyag edényekhez való tapadását, amelyekben a kondrocitákat tenyésztik, meg lehet akadályozni, ha a falukat metilcellulóz, agaróz, hidrogel (poli-2-hidroxietil-metakrilát) vagy kollagén-agaróz keverék oldatával vonjuk be. Ilyen körülmények között a kondrociták klasztereket alkotnak, és főként aggrekánt és szövetspecifikus kollagéneket (II, IX, XI típusok) szintetizálnak. Általában kétféle sejt található. A középen elhelyezkedő sejtek gömb alakúak, és jól fejlett ECM veszi körül őket, amit hisztokémiai és ultrastrukturális vizsgálatok is megerősítenek. A periférián a kondrociták korong alakúak, és ritka ECM veszi körül őket; az ilyen sejtek funkcionális jellemzőiről keveset tudunk.

A porcsejtek szuszpenzióban tartott mikrohordozókon tenyészthetők; mikrohordozóként dextrán gyöngyöket (cytodex), kollagénnel bevont dextrán gyöngyöket (cytodex III) és I. típusú kollagén nem porózus mikrogömbjeit (cellagen) használják. Ilyen tenyésztési körülmények között a porcsejtek a mikrohordozó felületéhez tapadnak, megtartják gömb alakjukat, és mátrixszerű anyagot termelnek. Ezenkívül a cellagen alkalmazása elősegíti a porcsejtek proliferációját és a normál fenotípus újbóli expresszióját. Ezért a porcsejtek cellagen mikrogömbökön történő tenyésztése felhasználható a sejtfenotípus helyreállítására a transzplantáció előtt.

^{A kondrocita-szuszpenzió folyékony közegben történő tenyésztésének egy másik módszere a sejtekből álló sűrű golyók (0,5-1 * 10 b} ) formájában történő tenyésztés, amelyeket centrifugálással nyernek. Az ilyen kondrociták képesek nagy mennyiségű proteoglikánt, II-es típusú kollagént, de I-es típusú kollagént nem tartalmazó mátrix előállítására, amit hisztológiai, immunhisztokémiai és kvantitatív módszerekkel is megerősítenek.

Porcsejtek szuszpenziója természetes ECM-ben

A kondrocitákat háromdimenziós mátrixban (lágy agar, agaróz, kollagén gél vagy szivacs, hialuronsav, fibrin ragasztó, alginát gyöngyök) szuszpenzióban lehet tenyészteni.

Az agarózban tenyésztett kondrociták megőrzik normál fenotípusukat, és II-es típusú kollagént, valamint szövetspecifikus aggrekán aggregátumokat szintetizálnak. Agarózban tenyésztve a sejt által szintetizált proteoglikánok 50 napig a táptalajban szabadulnak fel. Összehasonlításképpen, egyrétegű tenyészetben a sejtes fázis már a tenyésztés első 5-6 napjában túltelített glükózaminoglikánokkal; táptalajban tenyésztve, az első 8-10 napban fokozott glikózaminoglikán-szintézis és felszabadulás után időfüggő csökkenés következik be. Mindazonáltal a kondrociták viselkedése agarózban tenyésztve eltér az in vivo viselkedéstől. Az agarózban a szintetizált aggrekán-aggregátumok nagy száma kisebb molekulákat és kevesebb molekulát tartalmaz, mint in vivo. A TGF-β serkenti a proteoglikán-szintézist az explantátumban, de csökkenti az aggrekán-szintézist az agarózban.

^{Az alginát egy barna moszatból származó lineáris poliszacharid. Kétértékű kationok, például Ca2 +} ionok jelenlétében ez a polimer géllé alakul. Az alginátba zárt minden egyes porcsejtet negatív töltésű poliszacharidok mátrixa vesz körül, amelynek pórusai összehasonlíthatók a hialinporc pórusaival. Az alginátgyöngyökben a porcsejtek által alkotott mátrix két rekeszből áll - egy vékony, sejtekhez kapcsolódó mátrixrétegből, amely megfelel az ízületi porc pericelluláris és territoriális mátrixának, és egy távolabbi mátrixból, amely megfelel a natív szövet interterritoriális mátrixának. A tenyésztés 30. napján a sejtek és az alginátgyöngyben lévő két rekesz által elfoglalt relatív és abszolút térfogat szinte teljesen megegyezik a natív porcban található térfogattal. A porcsejtek közel 30 napig megőrzik gömb alakjukat, és aggrekánt termelnek, amelynek hidrodinamikai tulajdonságai hasonlóak az ízületi porc mátrixában található aggrekán molekulákéhoz, valamint II, IX és XI típusú kollagénmolekulákhoz. Ugyanakkor, más szuszpenziós tenyészetekhez hasonlóan, az alginátgyöngyök felületén lapított sejtek találhatók, amelyek kis mennyiségű I. típusú kollagénmolekulát termelnek, amelyek közvetlenül a táptalajba szabadulnak fel, és nem épülnek be az ECM-be. Az alginátgyöngyökben a porcsejtek mérsékelt proliferációja figyelhető meg. 8 hónapos alginát gélben történő tenyésztés után az érett porcsejtek nem veszítik el metabolikus aktivitásukat, és továbbra is szintetizálják a szövetspecifikus II. típusú kollagént és az aggrekánt.

H. Tanaka és munkatársai (1984) alginátban lévő különféle természetes molekulák diffúziós tulajdonságait vizsgálták, és azt találták, hogy a 70 kDa-nál nagyobb molekulák nem diffundáltak át az algináton. Így az alginátban végzett sejtkultúra alkalmas a mátrixbioszintézis és az ECM szerveződésének szabályozásának vizsgálatára. Az alginátban tenyésztett sejtek elérhetősége lehetővé teszi a peptidszabályozó faktorok és farmakológiai ágensek hatásának tanulmányozását transzkripciós, poszttranszkripciós és transzlációs szinten.

A porcsejteket I. és II. típusú kollagénrostok mátrixában is tenyésztik. S. Nehrer és munkatársai (1997) összehasonlították a kutya porcsejtek működését különböző típusú kollagéneket tartalmazó porózus kollagén-proteoglikán polimer mátrixokban. Fontos különbségeket találtak az I. és II. típusú kollagént tartalmazó kollagénmátrixokban tenyésztett porcsejtek bioszintetikus funkciójának morfológiájában. A II. típusú kollagén mátrixában lévő sejtek megtartották gömb alakjukat, míg az I. típusú kollagénben fibroblasztszerű morfológiát mutattak. Ezenkívül a II. típusú kollagén mátrixában a porcsejtek nagyobb mennyiségű glükózaminoglikánt termeltek. J. van Susante és munkatársai (1995) összehasonlították az alginát és a kollagén (I. típusú) gélben tenyésztett porcsejtek tulajdonságait. A szerzők a sejtek számának jelentős növekedését tapasztalták a kollagén gélben, de a tenyésztés 6. napjától kezdve a sejtek elvesztették jellegzetes fenotípusukat, fibroblasztszerű sejtekké alakulva. Az alginát gélben a sejtek számának csökkenését figyelték meg, de a porcsejtek megtartották normál fenotípusukat. A kollagén gélben a proteoglikánok száma sejtenként szignifikánsan magasabb volt, mint az alginátban, de a gélben a mátrixelemek szintézisének csökkenését figyelték meg, a tenyésztés 6. napjától kezdődően, míg az alginátban a szintézis folyamatosan nőtt.

A szilárd, háromdimenziós fibrin mátrix egy természetes anyag, amely differenciált fenotípusban tartja a benne szuszpendált kondrocitákat. A háromdimenziós fibrin mátrix hordozóként is használható a kondrocita-transzplantációban. A fibrin előnyei a citotoxicitás hiánya, a térkitöltő képesség és a tapadóképesség. Hisztológiai és biokémiai vizsgálatok, autoradiográfia és elektronmikroszkópia kimutatták, hogy a fibrin gélben lévő kondrociták még 2 hét tenyésztés után is megőrzik morfológiájukat, szaporodnak és mátrixot termelnek. G. Homminga és munkatársai (1993) azonban arról számoltak be, hogy a fibrin szétesése 3 napos tenyésztés után megkezdődik, és a kondrocita-dedifferenciálódás előrehalad.

Porcsejtek szuszpenziója mesterséges (szintetikus) ECM-ben

A rekonstrukciós vagy ortopédiai sebészethez használt porcimplantátumok izolált porcsejtek szintetikus, biokompatibilis mátrixban történő in vitro tenyésztésével állíthatók elő.

A poliglikolsavban tenyésztett porcsejtek szaporodnak, és 8 hétig megőrzik normál morfológiájukat és fenotípusukat. A porcsejt-poliglikolsav komplex sejtekből, glikozaminoglikánokból, kollagénekből áll, és külső kollagén kapszulával rendelkezik. Az ilyen implantátumok azonban kétféle kollagénmolekulát tartalmaznak - I-et és II-t. A több passzázs sorozatával dedifferenciált porcsejtekből származó implantátumok nagyobb mennyiségű glikozaminoglikánt és kollagént tartalmaznak, mint a primer módon differenciálatlan porcsejtekből származó implantátumok.

L. Freed és munkatársai (1993b) összehasonlították az emberi és szarvasmarha kondrocita-kultúrák viselkedését rostos poliglikolsavban (FPGA) és porózus politejsavban (PPLA). A szarvasmarha kondrociták 6-8 hetes FPGA-ban vagy PPLA-ban történő tenyésztése után a szerzők sejtszaporodást és a porcmátrix regenerálódását figyelték meg. Az FPGA-ban a kondrociták gömb alakúak voltak, és porcmátrixszal körülvett lyukakban helyezkedtek el. 8 hetes in vitro tenyésztés után a regenerált szövet akár 50% szárazanyagot is tartalmazott (4% sejttömeg, 15% glükózaminoglikán és 31% kollagén). A PPLA-ban a sejtek orsó alakúak voltak, és kis mennyiségű glükózaminoglikánt és kollagént tartalmaztak. Az FPGA-ban a sejtnövekedés kétszer intenzívebb volt, mint a PPLA-ban. In vivo a VPGK-ban és PPLC-ben tenyésztett kondrociták 1-6 hónapon belül szövettanilag a porchoz hasonló szövetet hoztak létre. Az implantátumok glükózaminoglikánokat, I. és II. típusú kollagéneket tartalmaztak.

A szarvasmarha magzati porcsejteket porózus, nagy sűrűségű hidrofób és hidrofil polietilénben tenyésztették. Mindkét szubsztrátban 7 napos inkubáció után a sejtek megtartották gömb alakúak, és főként II-es típusú kollagént tartalmaztak. 21 napos tenyésztés után a hidrofil mátrix több II-es típusú kollagént tartalmazott, mint a hidrofób mátrix.

A porcszövet Millicell-CM szűrőkön, monorétegben történő tenyésztéssel is nyerhető. A kondroitinek tapadásához a szűrők kollagénnel történő előzetes bevonása szükséges. A tenyészet szövettani vizsgálata a porcsejtek felhalmozódását mutatja az ECM-ben, amely proteoglikánokat és II-es típusú kollagént tartalmaz. I-es típusú kollagént ilyen tenyészetben nem mutattak ki. A kapott porcszövetben a porcsejtek gömb alakúak, de a szövet felszínén kissé lapítottak. Az újonnan képződött szövet vastagsága idővel növekedett, és a sejtmonoréteg kezdeti sűrűségétől függött. Optimális tenyésztési körülmények között a porcszövet vastagsága elérte a 110 μm-t, sejtjeinek és kollagénjének felületi és mély rétegekbe történő szerveződése hasonló az ízületi porcéhoz. Az ECM körülbelül háromszor annyi kollagént és proteoglikánt tartalmaz. 2 hetes tenyésztés után mátrixfelhalmozódást figyeltek meg, amely lehetővé tette a szövet kinyerését a szűrőből és transzplantációhoz való felhasználását.

Sims és munkatársai (1996) polietilén-oxid gélben, egy kapszulázott polimer mátrixban vizsgálták a porcsejtek tenyésztését, amely lehetővé teszi nagyszámú sejt injekcióval történő bevitelét. Hat héttel az atímiás egerek bőr alatti szövetébe történő injekció beadása után új porc képződött, amelyet morfológiailag a hialinporchoz hasonló fehér opaleszcencia jellemzett. A szövettani és biokémiai adatok aktívan proliferáló, ECM-et termelő porcsejtek jelenlétét mutatták.

Kifejtés

A porcszövet eltávolításával tanulmányozzák az ana- és katabolizmus folyamatait, a homeosztázis fenntartását, a felszívódást és a helyreállítást. A porcszövet eltávolító anyagaiban található kondrociták normális fenotípust és ECM-összetételt tartanak fenn, hasonlóan az ízületi porc in vivo-beli változataihoz. 5 napos szérum jelenlétében történő tenyésztés után állandó szintézisszintet és természetes lebontási folyamatokat érnek el. A szöveti felszívódás a fő tenyészetben és a tenyészetben szérum hozzáadásával felgyorsítható számos szer, például IL-IB, TNF-α, bakteriális lipopoliszacharidok, retinsav-származékok vagy aktív oxigéngyökök alkalmazásával. A porc regenerálódásának vizsgálatához károsodását oldható gyulladásos mediátorok (H2O2 _,IL -1, TNF- α ) vagy a mátrix fizikai repedése indukálja.

Az organotípusos tenyésztési módszer egy modell az izolált külső tényezők porcsejtekre és a környező mátrixra gyakorolt hatásának in vitro vizsgálatára. In vivo a porcsejtek ritkán helyezkednek el az explantátum mátrixban (ECM), és nem érintkeznek egymással. Az ízületi porc explantátum tenyészet megőrzi ezt a szerkezeti szerveződést, valamint a porcsejtek és a környező extracelluláris környezet közötti specifikus kölcsönhatásokat. Ezt a modellt a mechanikai stressz, farmakológiai ágensek, növekedési faktorok, citokinek és hormonok porcanyagcserére gyakorolt hatásának vizsgálatára is használják.

A porcszövet eltávolításának további előnye, hogy a porcsejtek nem károsodnak proteolitikus enzimek vagy mechanikai tényezők hatására, ami elkerülhetetlen a sejtek izolálásakor. A receptorok és más membránfehérjék, valamint glikoproteinek védve vannak a káros tényezőktől.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Chondron kultúra

A kondron az ízületi porc szerkezeti, funkcionális és metabolikus egysége, amely egy kondrocitából, annak pericelluláris mátrixából és kompakt fonalas tokjából áll, és felelős a mátrix homeosztázisáért. A kondronokat mechanikusan vonják ki a porcból, és több egymást követő alacsony sebességű homogenizálással gyűjtik össze. A különböző porcmélységű zónákból izolált kondronok négy kategóriába sorolhatók: egyetlen kondron, párosított kondron, többszörös (három vagy több) lineárisan elrendezett kondron (kondronoszlopok) és kondroncsoportok.

Az egyes kondronok általában az ép porc középső rétegeiben találhatók, a párosított kondronok a középső és a mély rétegek határán, a lineárisan elrendezett többszörös kondronok pedig az ép porc mély rétegeire jellemzőek. Végül a kondronklasterek véletlenszerűen elrendezett egyes és párosított kondronok csoportjaiból állnak, amelyek homogenizálás után is megtartják aggregált állapotukat. A kondronklasterek nagy porctöredékek, amelyek általában több kondront és sugárirányban elrendezett kollagénfibrillákat tartalmaznak, azaz a mátrix mély rétegeire jellemző tipikus szerveződést. A kondronok átlátszó agarózban vannak rögzítve, ami lehetővé teszi szerkezetük, molekuláris összetételük és metabolikus aktivitásuk vizsgálatát. A kondron-agaróz rendszert a porc mikromodelljének tekintik, amely abban különbözik a hagyományos kondrocita-agaróz rendszertől, hogy a természetes mikrokörnyezet megmarad, és nincs szükség szintetizálásra és összeszerelésre. A kondrontenyészet egy modell a sejtek és a mátrix kölcsönhatásainak vizsgálatára az ízületi porcban normál és kóros körülmények között.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Halhatatlan porcsejtek tenyésztése

A sejteket „halhatatlanná” tenni képes rekombináns DNS-t vagy onkogént tartalmazó vírusokat állandó sejtvonalak létrehozására használják. A halhatatlan porcsejtek képesek végtelenül szaporodni, miközben stabil fenotípust tartanak fenn. F. Mallein-Gerin és munkatársai (1995) kimutatták, hogy az SV40T onkogén egér porcsejtek proliferációját indukálja, amelyek továbbra is stabilan expresszálják a II., IX. és XI. típusú kollagént, valamint az ízületi aggrekánt és a kötőfehérjét. Egy ilyen sejtvonal azonban képessé válik az I. típusú kollagén szintézisére, ha egyrétegű tenyészetben vagy agaróz gélben tenyésztik.

W. Horton és munkatársai (1988) leírtak egy halhatatlan sejtvonalat, amely alacsony szintű II-es típusú kollagén mRNS expressziót mutatott. Ezeket a sejteket I-myc- és y-ra-onkogéneket tartalmazó egér retrovírussal történő transzformációval nyerték. Ez a sejttípus egyedülálló modellt képvisel az ízületi mátrix kölcsönhatásainak vizsgálatára II-es típusú kollagén hiányában, valamint a II-es típusú kollagén szintézis szabályozásának vizsgálatára.

A mutált vagy deléciós génekkel rendelkező kondropritok tenyésztése kényelmes modell fiziológiai funkcióik tanulmányozására. Ez a modell különösen alkalmas specifikus molekulák porcmátrix szerveződésében betöltött szerepének tanulmányozására, vagy különböző szabályozó tényezők porcanyagcserére gyakorolt hatásának vizsgálatára. A IX-es típusú kollagén deléciós génjével rendelkező kondrociták a normálisnál szélesebb kollagénfibrillákat szintetizálnak, ami arra utal, hogy a IX-es típusú kollagén szabályozza a fibrillumok átmérőjét. Amint az 1. fejezetben említettük, a II-es típusú kollagént kódoló COLAI gén mutációját nemrégiben fedezték fel primer generalizált osteoarthritisben szenvedő családokban. A mutáns II-es típusú kollagén ízületi mátrixra gyakorolt hatásának vizsgálata érdekében R. Dharmrvaram és munkatársai (1997) hibás COL ₂ AI-t (az 519-es pozícióban lévő arginint cisztein helyettesíti) transzfektáltak (idegen nukleinsavval fertőzték meg) emberi magzati kondrocitákba in vitro.

Kokultúra rendszer. Az ízületben a porc kölcsönhatásba lép más típusú sejtekkel, amelyek az ízületi membránban, az ízületi folyadékban, a szalagokban és a porc alatti csontban találhatók. A porcsejtek anyagcseréjét befolyásolhatják a felsorolt sejtek által szintetizált különféle oldható faktorok. Így ízületi gyulladás esetén az ízületi porcot a szinoviális sejtek által termelt proteolitikus enzimek és szabad gyökök pusztítják el. Ezért modelleket fejlesztettek ki a porc és a környező szövetek közötti komplex kölcsönhatások tanulmányozására, amelyeket kokultúráknak neveznek.

S. Lacombe-Gleise és munkatársai (1995) nyúl kondrocitákat és oszteoblasztokat tenyésztettek egy kokultúra rendszerben (COSTAR), amelyben a sejteket egy mikroporózus membrán (0,4 μm) választotta el, lehetővé téve a két sejttípus közötti cserét közvetlen érintkezés nélkül. Ez a tanulmány igazolta az oszteoblasztok azon képességét, hogy oldható mediátorokon keresztül stimulálják a kondrocita-növekedést.

AM Malfait és munkatársai (1994) a perifériás vér monocitái és a porcsejtek közötti kapcsolatot vizsgálták. Ez a modell alkalmas citokin-közvetített folyamatok vizsgálatára gyulladásos ízületi betegségekben (reumatoid artritisz, szeronegatív spondyloarthritis stb.). A modell szerzői egy 0,4 μm átmérőjű pórusú fehérjekötő membránnal választották el a sejteket. A tanulmány kimutatta, hogy a lipopoliszachariddal stimulált monociták IL-1-et és TNF-α-t termeltek, amelyek gátolták az aggrekán szintézisét a porcsejtek által, és hozzájárultak a már szintetizált aggrekán aggregátumok lebomlásához.

K. Tada és munkatársai (1994) egy olyan kokultúra-modellt hoztak létre, amelyben az I. típusú kollagén gélben lévő endotélsejteket egy belső kamrába helyezték, amelyet egy 0,4 μm pórusméretű szűrő választott el a külső kamrától, amelyben porcsejtek voltak. A külső kamrától teljesen elkülönítve az emberi endotélsejtek csöveket képeztek a kollagén gélben EGF vagy TGF-α jelenlétében. Amikor mindkét sejttípust egyidejűleg tenyésztették, az endotélsejtek TGF-α-függő csőképződése gátolt volt. A porcsejtek általi gátlást részben kiküszöbölték az anti-TGF-béta antitestek. Feltételezhető, hogy a porcsejtek által termelt TGF-béta gátolja magának a porcnak a vaszkularizációját.

S. Groot és munkatársai (1994) egy 16 napos egérmagzat csontjának hipertrófiás és proliferatív zónáiból származó porcsejteket tenyésztettek agyszövetdarabokkal egyidejűleg. 4 napos tenyésztés után a porcsejtek oszteoblasztokká történő transzdifferenciálódását és az osteoidképződés kezdetét figyelték meg. 11 napos tenyésztés után a porc egy részét csontszövet váltotta fel, és a csontmátrix részben meszesedett. Egyes, az agyszövet által termelt neuropeptidek és neurotranszmitterek befolyásolják az oszteoblasztok anyagcseréjét, vagy receptorokkal rendelkeznek azokhoz. Ezek közé tartozik a norepinefrin, a vazoaktív intesztinális peptid, a kalcitonin génhez kapcsolódó peptid, a P-anyag és a szomatosztatin. A porcsejtekkel együtt tenyésztett agyszövetdarabok a felsorolt faktorok némelyikét termelhetik, amelyek képesek a porcsejtek oszteoblasztokká történő transzdifferenciálódásának folyamatát indukálni.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Külső tényezők hatása a kondrocita-tenyészetre

Az oxigénnyomás hatása a kondrocita-anyagcserére

A legtöbb esetben a kondrocita-kultúrák a légköri oxigénnyomás körülményei között fejlődnek. Köztudott azonban, hogy in vivo a kondrociták hipoxiás körülmények között léteznek, és az oxigénnyomás a különböző kóros állapotok függvényében változik. Az érési folyamat során jelentős változások figyelhetők meg az epifízisek vérellátásában. Mivel az érhálózat a növekedési lemez különböző zónáiban változik, az oxigénnyomás is változik bennük. C. Brighton és R. Heppenstall (1971) kimutatták, hogy nyulak sípcsontlemezében a hipertrófiai zónában az oxigénnyomás alacsonyabb, mint a környező porcban. Egyes metabolikus paraméterek mérése azt mutatta, hogy a kondrociták képesek gyorsan reagálni a lokális oxigénkoncentráció-változásokra. Először is, alacsony oxigénnyomás esetén a kondrociták általi fogyasztás csökken. Az oxigénnyomás 21%-ról 0,04%-ra csökkenésével a glükózhasznosítás nő, a glikolitikus enzimek aktivitása és a tejsavszintézis fokozódik. Még alacsony oxigénnyomás esetén is stabil marad az ATP, ADP és AMP abszolút mennyisége. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a kondrocita-anyagcsere a maximális energiamegtakarításra törekszik. A szintetikus aktivitás, és így a reparációs folyamatok azonban hipoxiás körülmények között megváltoznak.

A magas oxigénnyomás a porcsejtek anyagcseréjét is befolyásolja, ami a proteoglikán- és DNS-szintézis csökkenését, valamint a porcmátrix lebomlását okozza. Ezeket a hatásokat általában szabad oxigéngyökök termelődése kíséri.

A környezet ionkoncentrációjának és ozmotikus nyomásának hatása a porcsejtek működésére

A natív porcban az ionok koncentrációja jelentősen eltér más szövetekben található ionoktól: az extracelluláris közeg nátriumtartalma 250-350 mmol, ozmolaritása pedig 350-450 mosmol. Amikor a porcsejteket az ECM-ből izoláljuk és standard táptalajban (DMEM (Dulbecco-féle minimális esszenciális közeg), ozmolaritása 250-280,7 mosmol) inkubáljuk, a sejteket körülvevő környezet drámaian megváltozik. Ezenkívül a standard táptalajban a kalcium és a kálium koncentrációja jelentősen alacsonyabb, mint a natív szövetben, az anionok koncentrációja pedig jelentősen magasabb.

^{A szacharóz hozzáadása a táptalajhoz növeli annak ozmolaritását, és átmeneti intracelluláris növekedést idéz elő a H +} és kalciumionok koncentrációjában a citoszolban. Az ilyen intracelluláris változások befolyásolhatják a kondrocita-differenciálódási folyamatokat és metabolikus aktivitásukat. J. Urban és munkatársai (1993) kimutatták, hogy a standard DMEM-ben 2-4 órán át inkubált izolált kondrocitákban ^{a 358} -szulfát és ^{a 3H} -prolin beépülése a natív szövetben mért értéknek mindössze 10%-a volt. A szintézis intenzitása az extracelluláris táptalaj 350-400 mosmol ozmolaritásánál érte el a maximumát mind a frissen izolált kondrocitákban, mind a porcszövet-explantátumokban. Ezenkívül a kondrociták térfogata 30-40%-kal nőtt, miután az izolált sejteket a megadott ozmolaritású standard DMEM-be helyezték. Azonban, amikor a kondrocitákat nem fiziológiás ozmolaritású körülmények között 12-16 órán át tenyésztik, a sejtek alkalmazkodnak az új körülményekhez, a bioszintézis intenzitása az extracelluláris környezet ozmolaritásának eltolódásával arányosan csökken.

P. Borgetti és munkatársai (1995) a sertés porcsejtek növekedésére, morfológiájára és bioszintézisére gyakorolt extracelluláris táptalaj ozmolaritás hatását vizsgálták. A szerzők hasonló biokémiai és morfológiai jellemzőket mutattak ki a 0,28 és 0,38 mosmol ozmolaritású táptalajban tenyésztett porcsejtek esetében. 0,48 mosmol közepes ozmolaritásnál a tenyésztés első 4-6 órájában a sejtszaporodás és a fehérjeszintézis csökkenését figyelték meg, de ezek a paraméterek később helyreálltak, és végül elérték a kontrollértékeket. Amikor a porcsejteket 0,58 mosmol ozmolaritású táptalajban tenyésztették, a sejtek elvesztették a proliferatív folyamatok fiziológiai intenzitásának fenntartásának képességét, és 6 nap elteltével a porcsejtek száma jelentősen csökkent. 0,58 mosmol közepes ozmolaritásnál a fehérjeszintézis jelentős gátlását figyelték meg. Ezenkívül 0,28-0,38 mOsm ozmolaritású táptalajban tenyésztve a porcsejtek megtartják fiziológiai fenotípusukat; Magasabb ozmolaritásnál (0,48-0,58 mOsm) jelentős változások következnek be a sejtek morfológiájában, ami a jellegzetes fenotípus elvesztésében, a porcsejtek fibroblasztszerű sejtekké történő átalakulásában és a sejtek mátrix proteoglikánok összeállítására való képességének elvesztésében nyilvánul meg. A vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a porcsejtek képesek reagálni az extracelluláris környezet ozmolaritásának korlátozott ingadozásaira.

Más ionok koncentrációjának változása is befolyásolhatja a kondrociták bioszintézis folyamatait. Így a ^35S (szulfát) beépülésének mértéke a felére nő, ha a káliumionok koncentrációja 5 mmol-ról (a standard DM EM táptalaj koncentrációja) 10 mmol-ra (a koncentráció az ECM-ben in vivo) növekszik. A 0,5 mmol alatti kalciumkoncentráció elősegítette a kollagéntermelést az érett szarvasmarha-kondrocitákban, míg az 1-2 mmol koncentráció (ami megfelel a standard DM EM táptalaj koncentrációjának) a kollagénszintézis jelentős csökkenését okozta. Magas kalciumszintnél (2-10 mmol) a bioszintézis mérsékelt növekedését figyelték meg. Különböző kationok vesznek részt a kondrociták ECM fehérjékhez való kapcsolódásában. Így a magnézium- és mangánionok biztosítják a fibronektinhez és a II. típusú kollagénhez való kötődést, míg a kalciumionok nem vesznek részt a kondrociták fehérjékhez való kapcsolódásában. Így a leírt vizsgálatok eredményei a kálium-, nátrium-, kalciumionok és a táptalaj ozmolaritása extracelluláris ionjainak változásainak és a táptalaj ozmolaritásának a standard táptalajban inkubált kondrociták bioszintetikus funkciójára gyakorolt hatását jelzik.

A mechanikai stressz hatása a kondrocita-anyagcserére

Az ízületi immobilizáció reverzibilis porcsatrófiát okoz, ami a normális anyagcsere-folyamatokhoz mechanikai ingerekre van szükség az ECM-ben. A legtöbb esetben az alkalmazott sejtkultúra-modellek normál légköri nyomáson léteznek. M. Wright és munkatársai (1996) kimutatták, hogy a mechanikai környezet befolyásolja a kondrocita-anyagcserét, a sejtválasz a kompressziós terhelés intenzitásától és gyakoriságától függ. Az ép ízületi porc explantátumain végzett in vitro terhelési kísérletek a fehérjék és proteoglikánok szintézisének csökkenését mutatták ki statikus terhelés hatására, míg a dinamikus terhelés stimulálja ezeket a folyamatokat. A mechanikai terhelés porcra gyakorolt hatásának pontos mechanizmusai összetettek, és valószínűleg a sejtek deformációjával, a hidrosztatikai nyomással, az ozmotikus nyomással, az elektromos potenciállal és a mátrixmolekulák felszíni sejtreceptoraival kapcsolatosak. Ezen paraméterek hatásának tanulmányozásához olyan rendszert kell létrehozni, amelyben az egyik paraméter függetlenül változtatható. Például az explantátum-tenyészet nem alkalmas a sejtek deformációjának vizsgálatára, de felhasználható a nyomás általános hatásának vizsgálatára a kondrocita-anyagcsere-aktivitásra. A porc összenyomódása sejtek deformációjához vezet, és hidrosztatikai nyomásgradiens, elektromos potenciál, folyadékáramlás, valamint olyan fizikai-kémiai paraméterek változásával is jár, mint a mátrix víztartalma, elektromos töltéssűrűség és ozmotikus nyomásszint. A sejtek deformációját agarózba vagy kollagén gélbe merített izolált porcsejtekkel lehet vizsgálni.

Számos rendszert fejlesztettek ki a mechanikai stimuláció kondrocita-tenyészetre gyakorolt hatásának vizsgálatára. Egyes kutatók olyan rendszereket alkalmaznak, amelyekben a nyomást a sejtkultúrára gázfázison keresztül alkalmazzák. Így JP Veldhuijzen és munkatársai (1979) 15 percig tartó, a légköri nyomásnál 13 kPa-val nagyobb nyomáson, alacsony frekvenciával (0,3 Hz) végzett kezelés során a cAMP és a proteoglikánok szintézisének növekedését, valamint a DNS-szintézis csökkenését figyelték meg. R. Smith és munkatársai (1996) kimutatták, hogy primer szarvasmarha-kondrocita-tenyészet szakaszos hidrosztatikai nyomásnak (10 MPa) való kitétele 1 Hz frekvenciával 4 órán át az aggrekán és a II-es típusú kollagén szintézisének növekedését okozta, míg az állandó nyomás nem befolyásolta ezeket a folyamatokat. Hasonló rendszert alkalmazva Wright és munkatársai (1996) arról számoltak be, hogy a sejtkultúrára gyakorolt ciklikus nyomás a kondrocita-sejtmembrán hiperpolarizációjával és a Ca2 ⁺ -függő káliumcsatornák aktiválódásával jár. Így a ciklikus nyomás hatásait a kondrocita-membránban lévő nyújtás-aktivált ioncsatornák közvetítik. A porcsejtek hidrosztatikai nyomásra adott válasza a sejtkultúra körülményeitől és az alkalmazott terhelés frekvenciájától függ. Így a ciklikus hidrosztatikai nyomás (5 MPa) 0,05, 0,25 és 0,5 Hz frekvencián csökkenti a szulfát beépülését a porcsejtek monorétegébe, míg 0,5 Hz-nél nagyobb frekvencián a szulfát beépülése a porcszövetbe növekszik.

M. Bushmann és munkatársai (1992) arról számoltak be, hogy az agaróz gélekben lévő porcsejtek ugyanúgy megváltoztatják a bioszintézist statikus és dinamikus mechanikai terhelésre válaszul, mint a tenyésztett ép szerv. A szerzők azt találták, hogy a mechanikai terhelés hiperozmotikus ingert generál, ami a porcsejtek pH-értékének csökkenéséhez vezet.

A mechanikai nyújtás hatása gélbe merített sejtkultúrán vizsgálható. A nyújtóerő számítógéppel vezérelt vákuum segítségével hozható létre. Amikor a rendszer bizonyos fokú vákuum alatt van, a sejtkultúrát tartalmazó Petri-csésze alja ismert mértékben megnyúlik, a deformáció a csésze aljának szélein maximális, a közepén pedig minimális. A nyújtás a Petri-csészében tenyésztett porcsejtekre is átterjed. Ezzel a módszerrel K. Holmvall és munkatársai (1995) kimutatták, hogy kollagén (II. típusú) gélben tenyésztett kondroszarkóma sejtekben fokozódik a 2β-integrin mRNS-ének expressziója _{. A 2β-integrin} képes _kötődni a II. típusú kollagénhez. Mechanoreceptornak tekintik, mivel kölcsönhatásba lép az aktin-kötő fehérjékkel, így összekapcsolva az ECM-et és a citoszkeletont.

A pH hatása a kondrocita-anyagcserére

A porcszövet ECM-jének intersticiális folyadékának pH-ja savasabb, mint más szövetekben. A. Maroudas (1980) az ízületi porcmátrix pH-ját 6,9-nek határozta meg. B. Diamant és munkatársai (1966) kóros körülmények között 5,5-ös pH-értéket találtak. Ismert, hogy a porcsejtek alacsony PO2-szinten élnek, ami a glikolízis (az összes glükóz-anyagcsere 95%-a) fontos szerepére utal ezen sejtek anyagcseréjében; a glikolízist nagy mennyiségű tejsav termelődése kíséri.

A glikolízis termékei általi környezeti savasodás mellett maguk a mátrixkomponensek is nagy jelentőséggel bírnak. A proteoglikánokon lévő nagy mennyiségű fix negatív töltés módosítja az extracelluláris ionösszetételt: magas szabad kationkoncentráció (pl. H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) és alacsony anionkoncentráció (pl. O2, HCO3) figyelhető meg. Ezenkívül mechanikai terhelés hatására víz távozik az ECM-ből, ami a fix negatív töltések koncentrációjának növekedéséhez és több kation mátrixba történő vonzásához vezet. Ezt az extracelluláris környezet pH-értékének csökkenése kíséri, ami befolyásolja az intracelluláris pH-értéket, ezáltal módosítva a porcsejtek anyagcseréjét. R. Wilkin és A. Hall (1995) vizsgálták az extracelluláris és intracelluláris környezet pH-jának hatását a mátrix bioszintézisére izolált szarvasmarha-kondrocitákban. A mátrixszintézis kettős módosulását figyelték meg a pH csökkenésével. A pH enyhe, 50%-os csökkenése (7,4és a _3H^- prolin beépülését a porcsejtekbe, míg a táptalaj mélyebb savasítása (pH<7,1) 75%-kal gátolta a szintézist a kontrollhoz képest. Az alacsony pH (6,65) létrehozása ammóniumionokkal a mátrixszintézis mindössze 20%-os csökkenését okozta. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a mátrixszintézis extracelluláris közegének pH-értékének módosulása nem magyarázható kizárólag az intracelluláris közeg pH-értékének változásával. Ezenkívül a porcsejtek képesek szabályozni az intracelluláris pH-t a Na ⁺, H ⁺ -cserélő, a Ka ⁺ -függő Cl_ ^- НСОС3-transzporter és a H ⁺ /ATPáz segítségével.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

A táptalaj összetételének hatása a porcsejtek anyagcseréjére

A porcsejtek tenyésztésére szolgáló táptalajnak meg kell felelnie a kísérleti körülményeknek. Az utóbbi években borjúszérumot használtak a tenyésztési körülmények optimalizálására. Szérum használatakor azonban számos fontos szempontot figyelembe kell venni:

• a sejtek kifelé irányuló növekedése a szövet perifériájáról szervkultúrákban,
• a különböző sorozatú szérumok összetételének változékonysága,
• ismeretlen összetevők jelenléte bennük,
• fokozott interferencia és műtermékek kockázata a különböző biológiai tényezők sejtek metabolikus aktivitására gyakorolt hatásának vizsgálatakor.

Ez utóbbira példa az EGF porcszövetre gyakorolt hatásának vizsgálata patkányokban. Az EGF serkenti a 3H-timidin beépülését ^és a DNS-tartalom növekedését a tenyészetben. Ez a hatás alacsony szérumkoncentrációknál (<1%) kifejezettebb volt, de magas koncentrációknál (>7,5%) a hatás eltűnt.

Közismert, hogy a borjúszérummal kiegészített DMEM táptalajban a szintézis és a lebomlás szintje jelentősen megnő az in vivo körülményekhez képest. Az in vivo és az in vitro metabolizmus közötti különbségek az ízületi folyadék és a sejtek tenyésztésére használt közeg közötti különbségeknek tudhatók be. Lee és munkatársai (1997) fiatal szarvasmarha-kondrocitákat tenyésztettek agarózban, olyan táptalajban, amely 20% borjúszérummal kiegészített DMEM-et és nagy mennyiségű normál allogén ízületi folyadékot tartalmazott. Az ízületi folyadék jelenléte a táptalajban a proteoglikánok mennyiségének növekedését idézte elő, az ízületi folyadék teljes mennyiségének akár 80%-áig. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a tenyészetben lévő ízületi folyadék az in vivo-hoz hasonló szintű metabolizmust indukál, magas glükózaminoglikán szintézissel és alacsony sejtosztódási szinttel.

G. Verbruggen és munkatársai (1995) kimutatták, hogy az agarózban, szérummentes DMEM táptalajban tenyésztett humán porcsejtek ^35S -arrpeKaHa szintézise a 10% borjúszérummal kiegészített DMEM táptalajban megfigyelt szintézisszint 20-30%-a volt. A szerzők meghatározták, hogy az IGF-1, IGF-2, TGF-R vagy inzulin milyen mértékben állította vissza az aggrekán termelést szérummentes táptalajban. A szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy 100 ng/ml inzulin, IGF-1 vagy IGF-2 részlegesen visszaállította az aggrekán szintézist a kontroll szint 39-53%-ára. A felsorolt tényezők kombinációjával nem figyeltek meg szinergizmust vagy kumulációt. Ugyanakkor 10 ng/ml TGF-R 100 ng/ml inzulin jelenlétében az aggrekán szintézist a referencia szint 90%-ára vagy annál nagyobb mértékben stimulálta. Végül, az emberi szérum transzferrin, önmagában vagy inzulinnal kombinálva, nem befolyásolta az aggrekán szintézist. Amikor a borjúszérumot marhaszérumalbuminnal helyettesítették, az aggrekán aggregátumok tartalma jelentősen csökkent. A táptalaj inzulinnal, IGF-fel vagy TGF-R-rel való dúsítása részben helyreállította a sejtek aggrekán aggregátumok termelésére való képességét. Ezenkívül az IGF-1 és az inzulin képes fenntartani a homeosztázist a sejtkultúrákban. 40 napos, 10-20 ng/ml IGF-1-gyel dúsított táptalajban történő tenyésztés után a proteoglikán szintézis ugyanazon a szinten vagy akár magasabb szinten is maradt, mint a 20% borjúszérumot tartalmazó táptalajban. A katabolikus folyamatok lassabban mentek végbe az IGF-1-gyel dúsított táptalajban, mint a 0,1%-os albuminoldattal dúsított táptalajban, de valamivel gyorsabban a 20%-os szérummal dúsított táptalajban. Hosszú élettartamú tenyészetekben a 20 ng/ml IGF-1 stabil állapotot tart fenn a sejtekben.

D. Lee és munkatársai (1993) összehasonlították a táptalaj összetételének (DMEM, DMEM+20% borjúszérum, DMEM+20 ng/ml IGF-1) hatását a DNS-szintézisre porcszövet explantátum kultúrában, egyrétegű kultúrában és agaróz szuszpenzióban. Agarózban, szérum jelenlétében tenyésztve a szerzők megfigyelték, hogy a kondrociták hajlamosak nagy klaszterekbe csoportosulni. A szérum nélkül vagy IGF-1-gyel tenyésztett sejtek agarózban megtartották kerek alakjukat, kis csoportokba gyűjtötték őket, de nem képeztek nagy aggregátumokat. Egyrétegű kultúrában a DNS-szintézis szignifikánsan magasabb volt a szérumot tartalmazó táptalajban, mint az IGF-1-gyel dúsított táptalajban; az utóbbiban a DNS-szintézis szignifikánsan magasabb volt, mint a dúsítatlan táptalajban. Nem találtak különbséget a DNS-szintézisben, amikor a kondrocitákat agaróz szuszpenzióban, nem dúsított táptalajban és IGF-1-gyel dúsított táptalajban tenyésztették. Ugyanakkor a kondrocita-szuszpenziók agarózban, szérumdúsított táptalajban történő tenyésztése a radionukleotid ^3H -timidin fokozott beépülésével járt más táptalajokhoz képest.

A C-vitamin szükséges a kollagénfibrillumok stabil helikális szerkezetének kialakításában részt vevő enzimek aktiválásához. Az aszkorbinsavhiányos kondrociták alulhidroxilált, nem helikális kollagén prekurzorokat szintetizálnak, amelyek lassan szekréciójukat okozzák. Az aszkorbinsav (50 μg/ml) adagolása a II-es és IX-es típusú kollagén hidroxilációját és normál mennyiségű szekrécióját okozza. A C-vitamin hozzáadása nem befolyásolta a proteoglikán szintézis szintjét. Ezért a kollagén szekrécióját a proteoglikán szekréciótól függetlenül szabályozzák.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]