Az osteoarthritis kísérletes modelljei
Utolsó ellenőrzés: 18.10.2021
Minden iLive-tartalmat orvosi szempontból felülvizsgáltak vagy tényszerűen ellenőriznek, hogy a lehető legtöbb tényszerű pontosságot biztosítsák.
Szigorú beszerzési iránymutatásunk van, és csak a jó hírű média oldalakhoz, az akadémiai kutatóintézetekhez és, ha lehetséges, orvosilag felülvizsgált tanulmányokhoz kapcsolódik. Ne feledje, hogy a zárójelben ([1], [2] stb.) Szereplő számok ezekre a tanulmányokra kattintható linkek.
Ha úgy érzi, hogy a tartalom bármely pontatlan, elavult vagy más módon megkérdőjelezhető, jelölje ki, és nyomja meg a Ctrl + Enter billentyűt.
A porc nagyon szakosodott szövet, amely csak egyfajta sejtet tartalmaz (chondrocyták), amelyet a vér és nyirokerek hiánya jellemez. A porc táplálkozását elsősorban a szinoviális folyadék abszorpciója végzi. A chondrocyták metabolizmusát számos, a kondrocyták és a környező szövetek által termelt oldható tényezők szabályozzák. A chondrocyták funkciója az extracelluláris táptalaj (oxigénfeszültség, ionkoncentráció, pH stb.), VCM összetétel, sejt- és mátrix kölcsönhatás, fizikai jelek összetételétől is függ. A kísérleti modellezés fő feladata az extracelluláris környezet kultúrájának létrehozása az érett sejtek fenotípusának megváltoztatása nélkül. A második feladat az, hogy olyan kultúrákat hozzanak létre, amelyekkel a kondrociták korai, késleltetett, rövid vagy hosszú távú reakcióját kémiai és / vagy fizikai jelekre lehet vizsgálni. Tanulmányok in vitro is nyújt lehetőséget, hogy tanulmányozza viselkedését porcsejtek osteoarthritis. A harmadik feladat a társ-gyógyító rendszerek kifejlesztése, amelyek lehetővé teszik a különböző szövetek kölcsönhatásainak tanulmányozását az ízületben. A negyedik feladat a porckorongos implantátumok előkészítése a későbbi átültetéshez. Végül az ötödik feladat a növekedési faktorok, a citokinek vagy a terápiás szerek azonosítása, amelyek képesek javítani és / vagy gátolni a porc reszorpcióját.
Az elmúlt évtizedekben különböző izületi porcsejtkultúrákat hoztak létre, köztük egyrétegű kultúrákat, felfüggesztett kultúrákat, chondron kultúrákat, explantákat, kultúrákat, halhatatlan sejtkultúrákat. Mindegyik kultúrának előnyei és hátrányai vannak, és mindegyik alkalmas a kondrocita metabolizmus egy bizonyos aspektusának tanulmányozására. Így a porgás explantok kiváló modell a mátrixelemek forgalmának tanulmányozásához, amelyhez valódi sejtfelszíni receptorok és normál sejtmátrixos és mátrix-sejt kölcsönhatások szükségesek. Ugyanakkor a mátrixban lévő lerakódások vizsgálata vagy a kondrocita metabolizmus szabályozásának mechanizmusa az izolált sejtek tenyészeténél javasolt. A sejtek differenciálódási folyamatának tanulmányozásához egyrétegű, kis sűrűségű tenyészet szükséges. A természetes vagy szintetikus mátrixban szuszpendált kultúrák a kondrociták mechanikai igénybevételre való adaptív válaszának elemzésére szolgáló modell.
Chondrocita kultúrák
A porcszövet kiválasztásához in vitro vizsgálatok során több fontos pontot is figyelembe kell venni. A chondrocyták mátrixösszetétele és metabolikus aktivitása különböző kötésekben változik, ez utóbbi pedig a szövetben található kondrocita mélységétől is függ. Ezeket az adatokat számos kísérletben szereztük be, amelyek során különböző mélységű porczónákból származó chondrocyták izolált szubpopulációit vizsgáltuk. Számos morfológiai és biokémiai különbséget találtunk az ízületi porc felületén és mély rétegeiben található művelt chondrocyták között. A felszíni sejtek egy ritka, kimerült proteoglikán fibrilláris mátrixot szintetizálnak, míg a mélyebb sejtek olyan mátrixot termelnek, amely gazdag fibrillákban és proteoglikánokban gazdag. Sőt, felületi sejtek viszonylag több kis nem aggregált proteoglikánok és a hialuronsav és az aggrekán és a viszonylag kisebb keratán-szulfátot, a mélyebben található porcsejteket. A különböző mélységek porczónáiból izolált chondrocyták metabolizmusának másik fontos megkülönböztető jellemzője az exogén ingerre adott válasz. M. Aydelotte és társaik szerint a porc felszíni zónájából származó bikondrociták érzékenyebbek voltak az IL-1-re, mint a mély zónák sejtjei.
A sejtek viselkedése a szövet helyétől is függ. Porcsejtek porc és a fül élek, vett ugyanazon állatból, hogy különbözőképpen reagálnak a növekedési faktorok, például a fibroblaszt növekedési faktor (FGF), és a TGF-béta. FGF megnövekedett timidin beépülését, prolin és a leucin, hogy a kultúra kondrociták borda, de nem a fül. TGF-P növelte a timidin be porc kondrocitákat borda és a fül, de nem volt hatással a timidin beépülését a kondrociták és a prolin fül. A legnagyobb terhelést viselő zónákból származó porcsejtek különböznek azoktól a helyektől, ahol a porckorongás alacsony. Például, érett porcsejtek a porc a térdízület a központi régió juhok ízületi sípcsont csont felületén nem terjed ki a meniszkusz, amely hordozza a legnagyobb terhelést in vivo, kisebb szintetizált aggrekán, dekorin de nagyobb, mint a sejtek által lefedett területek a meniszkusz. A szerzők hangsúlyozzák annak fontosságát is, hogy az ízületek szintetikus funkciójának vizsgálata során azonos izületekből származó porcot használjanak.
A chondrocyták metabolizmusa és szabályozó faktorokra adott válasz szintén jelentősen függ a donor korától, a csontváz fejlődésétől és az ízületek állapotától, ahonnan a sejteket veszik. Az emberi chondrocytákban jelentősen csökken a proliferatív válasz kora. A legnagyobb csökkenést a 40-50 éves és 60 évnél idősebb donoroknál tapasztalták. Továbbá a növekedési faktorok (pl. FGF és TGF-béta) proliferatív válaszának súlyossága csökken az öregedés során. A chondrocyták proliferációjának mennyiségi változásai mellett minőségi változások is vannak. Fiatal donorsejtek (10-20 évesek) jobban reagálnak a thrombocyta-eredetű növekedési faktorra (PDGF), mint a TGF-béta esetében, míg a felnőtt donorsejtekben az ellentétes. A chondrocyták szintetikus függvényében bekövetkező életkorfüggő változások magyarázata és a növekedési faktorok hatására adott válaszok alapján számos mechanizmust alkalmaznak. Közülük a sejtfelszíni receptorok számának és affinitásának csökkenése, a növekedési faktorok és citokinek szintézisének és bioaktivitásának változása, valamint a posztreceptor jelek módosítása.
Az ízületek patológiás állapota szintén megváltoztatja a kondrociták morfológiáját és metabolikus aktivitását. Tehát J. Kouri és a szerzők (1996) azonosították a chondrocyták három részpopulációját az osteoarthritisben lévő porcokban. A porcok felületi és felső középső részéből származó kondrociták klasztereket alkotnak, és több proteoglikánt és kollagént szintetizálnak. A TGF-béta és az inzulinszerű növekedési faktor (IGF) képesek stimulálni a proteoglikánok szintézisét kondrocitákon keresztül, és részben semlegesítik az IL-1 és a TNF-a hatásait. A porc-explantátumokat sújtott osteoarthritis, és a porcsejtek izolált porc osteoarthritisben szenvedő betegek, sokkal érzékenyebbek a stimulálása TGF-béta, mint az egészséges porc kondrocitákat. Ezek a különbségek valószínűleg a chondrocyták fenotípusos változásaihoz kapcsolódnak az artikus porc felső rétegeiben.
Az egyes chondrocyták izolálását az ECM proteolitikus enzimjeivel végzett szekvenciális kezeléssel érik el. Az ECM-ből való felszabadulása után az izolált sejtek ideálisan alkalmasak a de novo mátrix komponensek szintézisének tanulmányozására . Egyes szerzők csak klostridium kollagenázt alkalmaznak, mások előinkubálják a porcokat trypsinnal, pronázzal, DNázzal és / vagy hialuronidázzal. Az izolált sejtek száma az alkalmazott enzimektől függ. Így, amikor a feldolgozás egy 1 g kollagenáz szövetet lehet beszerezni 1,4T0 6 kondrociták, míg ha a pronáz, a hialuronidáz és a kollagenáz - 4,3-10 6. Ha a kollagenáz, az aggregátum, a fehérjék, az IL-6, az IL-8 feldolgozása sokkal több a sejtkultúrában, mint a különféle enzimekkel végzett szekvenciális kezelés esetében. Számos magyarázat található a két sejttenyészet közötti különbségekre:
- Celluláris receptorok sérült vagy depressziós Enzimtevékenység, TGF-béta gátolja a DNS szintézist a proteoglikánok az újonnan izolált kondrociták (1. Napon), míg a DNS-t és a proteogiikánszintézis kondrociták tenyésztettük egyrétegű (7 nap) által stimulált TGF-béta. A membránkomponensek újbóli kifejtésére azonban a kísérlet megkezdése előtt megfelelő időtartam szükséges.
- Az exogén proteázok megszakíthatják a sejtek és a mátrix interakcióját, amelyet az integrinok közvetítenek. Az integrin család elősegíti a kondrociták VKM molekulákhoz való kötődését (Shakibaei M. és munkatársai, 1997), amely a mátrix gének expresszióját befolyásolhatja.
- A mátrixkomponensek maradékai szabályozhatják a kondrociták szintetikus funkcióját. Az integrinek képesek felismerni az ECM bomlástermékeit, ezáltal fontos szerepet játszanak a szöveti javításban a proteolitikus enzimek expozíciója után. T. Larsson és szerzők (1989) beszámoltak arról, hogy az ép vagy fragmentált pro-theoglikánok hozzáadása a sejttenyészethez stimulálja a proteinek és proteoglikánok szintézisét. Azonban, a magas hialuronsav jelentős csökkenést okoz a felvételét-szulfát proteoglikánszintézist kondrociták csirkeembrió kondrociták érett sertés és patkány chondroszarkóma sejtek. Azonkívül a hialuronsav - inhibitor proteoglikán a sejtekből történő felszabadulását is jelenlétében IL-lb, a TNF-a, az FGF, amely jelzi, hogy az első, ellensúlyozva a biológiai aktivitását növekedési faktorok és citokinek. A hialuronsav hatásának alapjául szolgáló pontos mechanizmus továbbra sem tisztázott; Ismert, hogy a kondrociták tartalmaznak egy hialuronsav receptort, amely a citoszol aktinszálakhoz kapcsolódik. A hialuronsav receptorhoz való kötődése serkenti a fehérjék foszforilációját. Így ezek az adatok demonstrálják a chondrocyták metabolikus funkciójának modulálását fragmentált vagy natív mátrixfehérjékkel, a membrán receptor sejtek aktiválásával.
- A mátrix fehérjék chondrociták szintézisének enzimek által történő gyors stimulálása a chondrocyták alakváltozásának és / vagy a citoszkeleton átrendeződésének a következménye lehet.
- Bizonyos citokinek (pl. IL-8) és növekedési faktorok (pl. IGF-1, TGF-P) az ECM-ben vannak rögzítve. A legismertebb példa a TGF-béta dekoréteghez való kötődése, ami az előbbi képességének csökkenéséhez vezet a kínai hörcsögben a petefészek sejtekben történő sejtes növekedés indukálására. Az adatok azt mutatják, hogy a porcdíszítés tartalma az életkorral növekszik, a TGF-béta biológiai hozzáférhetőségének csökkenését jelzi az öregedésben. A növekedési faktorok és a citokinek a mátrixmaradványokból a tenyésztés során felszabadulhatnak, majd módosíthatják a kondrocita funkciót.
[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]
A chondrocyták egyrétegű kultúrája
A chondrocyták differenciált fenotípusait elsősorban a II. Típusú kollagén és a szövetspecifikus proteoglikánok szintézise, valamint a mitotikus aktivitás alacsony szintje jellemzi. Bizonyíték van arra, hogy a hosszú távú sejtek tenyésztése egy egyrétegű, és miután több ismételt passzálással sejtek, kondrociták elvesztik gömb alakú, megnyúlnak, fibroblaszt-szerű alak. Ilyen fibroblaszt metaplázia szintetikus funkció is módosított sejtek, azzal jellemezve, hogy egy progresszív csökkenése a szintézis a kollagének II, IX és XI típusú és javított szintézisét a kollagén I, III és Utipov. A kisméretű, nem aggregált proteoglikánokat funkcionális aggregátummal szintetizáljuk. A szintetzatatepin B és L rendkívül alacsony a differenciált sejtekben, de a differenciálódás elvesztésének folyamata nő. A kollagenáz-1 differenciált chondrocytákban expresszálódik, hosszantartó tenyésztéssel, expressziója csökken, míg a metalloproteázok (TIMP) szövetinhibitorok termelése nő.
A differenciált kondrociták újra expresszálják a differenciált fenotípus kollagénjét, amikor azokat egyrétegű tenyészetből szuszpendált állapotba helyezzük. A differenciálódás valószínűleg a sejtek alakjához kapcsolódik. Ezt a tulajdonságot rendszeresen olyan kutatók használják, akik autológ kondrocytákkal foglalkoznak a hibás transzplantációkkal. Egy biopsziás anyagból kapott kis számú sejteket egyrétegű tenyészetben megszorozhatunk, majd ismét áthelyezhetjük egy háromdimenziós mátrixba az átültetés előtt. Re-expressziója egy specifikus fenotípus dedifferenciálódott kondrociták vándoroltak agaróz kultúra, stimulálható a TGF-p-osszein hidroxiapatit komplex és az aszkorbinsav.
A növekedési faktorok és a citokinek hatására a differenciálódás során a kondrociták módosulnak. A citokinekre és a növekedési faktorokra adott sejtválasz eltér a differenciálatlan és differenciált kondrociták között. Az IL-1 stimulálja a fibroblasztok proliferációját, miközben az IL-1 gátolja a differenciálatlan kondrociták növekedését. A DNS szintézisét IGF-1 stimulálja a hosszúkás, de nem laposodó kondrocitákban. A differenciált kondrocitákban az IL-1β és a TNF-a stimuláló hatása a procollagenáz termékekre kifejezettebb, mint a nem differenciált.
A kondrociták termesztése
A kondrociták folyékony közegben vagy természetes vagy szintetikus háromdimenziós mátrixban való szuszpenziójának termesztése stabilizálja a kondrocita fenotípusait. A sejtek megtartják gömb alakját, szövetspecifikus fehérjéket szintetizálnak. A súlyozott kondrocita kultúrát rendszerint egy új pericelluláris mátrix kialakulásának vizsgálatára ajánljuk. A szintetikus vagy természetes abszorbens polimerekből származó kondrocita kultúrákat arra használják, hogy implantálják a sejteket a porc defektusaiba, hogy stimulálják az ízület porcszövetének regenerálódását. Az implantálható sejtek szintetikus vagy természetes környezetének számos követelménynek kell megfelelnie:
- Az implantátumoknak porózus szerkezettel kell rendelkezniük az adhézióhoz és a sejtnövekedéshez,
- sem a polimer önmagában, sem a lebomlásának termékei nem okoznak gyulladást vagy toxikus reakciókat in vivo beültetés során ,
- a transzplantációs hordozónak képesnek kell lennie a szomszédos porc vagy szubchondral csonthoz kötődni,
- egy természetes vagy szintetikus mátrixnak képesnek kell lennie a felszívódásra, annak lebomlását ki kell egyensúlyozni a szövetek regenerációjával,
- A porcok javításának megkönnyítése érdekében a mátrix kémiai szerkezete és mátrix-szerkezete segít megőrizni a chondrocyták által kódolt sejtfenotípust és a szövetspecifikus fehérjék szintézisét,
- az in vivo beültetés során meg kell vizsgálni a szintetikus vagy természetes mátrix mechanikai tulajdonságait.
[18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]
A kondrociták folyadékfázisban történő felfüggesztése
Cell kötődés műanyag edények, amelyekben a tenyésztés kondrociták lehet előzni a falak bevonjuk egy olyan oldattal metil-cellulóz, agaróz, hidrogél (poli-2-hidroxi-etil) keveréke vagy a kollagén-agaróz. Ilyen körülmények között, formája klaszterek és kondrociták szintetizálni elsősorban szövet-specifikus aggrekán és kollagén (II, IX, XI típusú). Általában kétféle sejt található. A középen elhelyezkedő sejtek gömb alakú formát öltenek, amelyet jól kifejlesztett ECM veszi körül, amit a hisztokémiai és ultrastrukturális vizsgálatok igazolnak. A perifériás kondrocitákon discoid kontúrok vannak, ritka ECM körül; Az ilyen sejtek funkcionális jellemzőiről kevés ismeretes.
A kondrociták termesztése szuszpenzióban hordozható mikrohordozókon lehetséges; például mikrohordozók használatával dextrán gyöngyök (tsitodeks), kollagénnel bevont dextrán gyöngyök (tsitodeks III), besporovye mikrogömbök I. Típusú kollagén (tsellagen). Ezen tenyésztési körülmények között a kondrociták a mikrohordozó felületéhez kapcsolódnak, megtartják gömb alakját és mátrixszerű anyagot állítanak elő. Ezenkívül a kollagén alkalmazása elősegíti a chondrocyták proliferációját és a normál fenotípus újraexpresszióját. Ezért a chondrocyták kollagén mikrogömbökön való termesztése alkalmazható a sejtfenotípusnak a transzplantáció előtt történő visszaállítására.
A kondrociták folyékony közegben történő szuszpenziójának egy másik módszere a sűrű gyöngyök előállítása centrifugálással kapott sejtekből (0,5-1 x 10 b ). Az ilyen kondrociták képesek arra, hogy nagyszámú proteoglikánt tartalmazó II. Kollagént, de nem I típusú kollagént tartalmazó mátrixot hozzanak létre, amelyet szövettani, immunhisztokémiai és kvantitatív módszerekkel igazolnak.
A kondrociták természetes ECM-ben történő felfüggesztése
A kondrociták lehet tenyészteni szuszpenzióban egy háromdimenziós mátrixot (lágy agar, agaróz, hívja gének gél vagy szivaccsal, hialuronsav, fibrinenyv, alginát gyöngyök).
A tenyésztett agaróz kondrociták megtartják normál fenotípust és szintetizálják a II. Kollagént és a szövetspecifikus aggregátum-új aggregátumokat. Agarózzal tenyésztve a sejtszintetizált proteoglikánok 50 napig szabadulnak fel a tápközegben. Összehasonlításképpen - egyrétegű tenyészetben a sejtfázist a glikozaminoglikánok már túllépik a termesztés első 5-6 napjában; a glikozaminoglikánok szintézisét és felszabadulását követően a tápközegben való tenyésztése fokozódik, a glükózaminoglikánok időbeli függő csökkenése az első 8-10 napban következik be. Mindazonáltal a kondrociták agaróz tenyésztésük során tapasztalt viselkedése eltér az in vivo körülmények között. Agarózban számos szintetizált Aggregan aggregátum kisebb és kisebb molekulát tartalmaz, mint in vivo. A TGF-P stimulálja a proteoglikánok szintézisét az explantumban, de csökkenti az aggregát szintézisét agarózban.
Az alginát egy barna hínárból származó lineáris poliszacharid. Kétértékű kationok, például Ca 2+ ionok jelenlétében ez a polimer gélré válik. Minden kondrocita fogott alginát, mátrix által körülvett negatív töltésű poliszacharidok, amelyek pórusait összehasonlíthatók azokkal a hialinporc. A mátrix, amely képződik kondrociták alginát gyöngyök, amely két szegmens - egy vékony réteg sejt-asszociált mátrix megfelelő pericelluláris és területi mátrixok az ízületi porc és több távoli mátrix területközi egyenértékű natív szövet. A 30. Napon a kultúra, relatív és abszolút mennyisége sejtek által elfoglalt, és mindegyik a két osztályok az alginát gyöngyöt szinte teljesen azonos a natív porc. A közel 30 nap kondrociták megőrzik gömbalakú termelnek aggrekán, hidrodinamikai tulajdonságai, amelyek hasonlóak a aggrekán molekulák a mátrixban az izületi porc és a kollagén molekula a II, IX és XI típusú. Ugyanakkor, mint a más kultúrák, szuszpenziók, alginát gyöngyök felületén a lapos sejtek vannak jelen, hogy létrehoz egy kis mennyiségű I típusú kollagén molekulák, megjelent közvetlenül a környezetbe, és nem épül be a videomagnó. Az alginát gyöngyökben a kondrociták mérsékelt proliferációja figyelhető meg. 8 hónapos termesztés alginát gél érett porcsejtek nem veszít metabolikus aktivitását, és továbbra is szintetizálni szövet-specifikus II típusú kollagén és aggrekán.
N. Tanaka és coauthors (1984) az alginát különböző természetes molekuláinak diffúziós tulajdonságait vizsgálta, és megállapította, hogy a 70 kD-nál nagyobb molekulák nem diffundálnak az algináton keresztül. Így az alginátban lévő sejtek tenyésztése alkalmas a mátrix bioszintézisének szabályozására és az ECM szervezésére. Az alginátban termelt sejtek elérhetősége lehetővé teszi a peptid szabályozó faktorok és farmakológiai ágensek hatását transzkripciós, poszttranszkripciós és transzlációs szinten.
A kondrocitákat szintén kollagénszálak I és II típusú mátrixában tenyésztik. S. Nehrer és szerzők (1997) összehasonlították a kutyagyártások működését különböző típusú kollagéneket tartalmazó porózus kollagén-proteoglikán polimer mátrixokban. Az I és II kollagéneket tartalmazó kollagén mátrixokban tenyésztett kondrociták bioszintetikus funkciójának morfológiájában jelentős különbségeket találtak. A II. Típusú kollagén mátrixában lévő sejtek gömb alakúak, míg az I. Típusú kollagénben fibroblasztszerű morfológiájuk volt. Továbbá a II. Típusú kollagén mátrixában a kondrociták több glikozaminoglikánt termeltek. J. Van Susante és munkatársai (1995) összehasonlították az algináttal és az I. Típusú kollagénnel tenyésztett kondrociták tulajdonságait. A szerzők a kollagén gélben a sejtek számának szignifikáns növekedését észlelték, de a termesztés 6. Napjától a sejtek elvesztették a jellegzetes fenotípust, és fibroblasztszerű sejtekké alakultak. Az alginát gélben megfigyelték a sejtek számának csökkenését, de a kondrociták megtartották normál fenotípust. A kollagén mennyisége gél proteoglikánok sejtenként szignifikánsan magasabb volt, mint az alginát, de a csökkenés volt megfigyelhető a gél mátrix elemeinek kiinduló szintézis a 6. Napon a termesztés, míg alginát szintézis tovább nőtt.
Egy szilárd háromdimenziós fibrin mátrix egy természetes anyag, amely támogatja a differenciált fenotípusban kimért kondrocitákat. A 3D fibrin mátrix a kondrocita transzplantáció hordozójaként is alkalmazható. A fibrin előnyei a citotoxicitás hiánya, a tér kitöltésének képessége, a tapadási képesség. Hisztológiai és biokémiai vizsgálatokban az autoradiográfiás, elektronmikroszkópiás, a fibrin-gél kondrocitái a morfológiájukat megtartják, szaporodnak és mátrixot is adnak még 2 hetes tenyésztés után. Azonban G. Homminga és szerzők (1993) beszámoltak arról, hogy 3 nap múlva a fibrin szétesése megkezdődik, a chondrocyták dedifferenciálódása előrehalad.
A kondrociták felfüggesztése mesterséges (szintetikus) ECM-ben
A rekonstruktív vagy ortopédiai műtéti porcimplantátumok izolált porcsejtek in vitro termesztésével állíthatók elő egy szintetikus biokompatibilis mátrixban.
A tenyésztett poliglikolsav kondrociták 8 héten belül proliferálják és fenntartják a normál morfológiát és fenotípust. A kondrocita-poliglikolsav komplex sejtekből, glikozaminoglikánokból, kollagénekből áll, és külső kollagén kapszulával rendelkezik. Az ilyen implantátumokban azonban kétféle kollagén molekula van - I és II. A chondrocyták sorozata által differenciálódott implantátumok nagyobb számban tartalmaznak glikozaminoglikánokat és kollagént, mint az elsősorban differenciálatlan kondrocitákból származó implantátumok.
L. Freed és munkatársai (1 993b) képest a viselkedését kondrocitatenyészetekben Az emberi és szarvasmarha a szálas poliglikolsav (EQAP) és a széthúzás polilaktilovoy sav (pPLcHFIF). A bikárondrociták HSVG-ben vagy PPLC-ben való 6-8 hetes termesztése után a szerzők megfigyelték a sejtproliferációt és a porc mátrix regenerálódását. A HSBC-ben a kondrociták gömb alakúak voltak, feküdtek a porcokban, porcsi mátrix körül. 8 hetes in vitro tenyésztés után a regenerált szövet 50% szárazanyagot tartalmazott (4% sejttömeg, 15% glikozaminoglikánok és 31% kollagén). A PPLK sejtek orsó alakúak, kis mennyiségű glikozaminoglikánok és kollagén. A HSBC-ben a sejtnövekedés 2-szer intenzívebb volt, mint a PTCA-ban. In vivo körülmények között a HPVC-ben és PPLC-ben termesztett kondrociták 1-6 hónapig szövettanilag szövettani szövetet termeltek, mint a porc. Az implantátumok tartalmaztak glikozaminoglikánokat, I. és II. Típusú kollagéneket.
A sertés bikárondrocitákat porózus nagy sűrűségű hidrofób és hidrofil polietilénben tenyésztettük. Mindkét szubsztrátumban 7 napos inkubálás után a sejtek gömb alakúak, elsősorban II típusú kollagént tartalmazva. 21 napos tenyésztés után kiderült, hogy a hidrofil mátrix több II típusú kollagént tartalmaz, mint a hidrofób mátrix.
A porcszöveteket a Millicell-CM szűrők egyrétegű tenyésztésével is elő lehet állítani. A szűrők kollagénnel történõ bevonása szükséges a hüvelyek rögzítéséhez. A tenyészet szövettani vizsgálata mutatja a kondrociták felhalmozódását a proteoglikánokat és a II. Típusú kollagént tartalmazó ECM-ben. Az I. Típusú kollagén ilyen kultúrában nem mutatható ki. A keletkezett porcszövetben lévő kondrociták gömb alakúak, de a szövet felületén kissé laposodnak. Az újonnan kialakult szövet vastagsága idővel növekedett és a sejtek egyrétegű sejt kezdeti sűrűségétől függött. Az optimális tenyésztési körülmények között a porcszövet vastagsága elérte a 110 μm-t, a sejtek és a kollagén felszíni és mély rétegekben való szervezése hasonló az ízületi porchoz. A VKM körülbelül 3-szor több kollagént és proteoglikánt tartalmaz. Kéthetes tenyésztés után meghatároztuk a mátrix-sa felhalmozódását, ami lehetővé tette a szövet kivonását a szűrőből és transzplantálásra.
Sims és munkatársai (1996) tanulmányozták a kondrociták termesztését egy polietilén-oxid-gél kapszulázott polimer mátrixban, amely lehetővé teszi, hogy nagy számú sejtet injektálással szállítsanak. Az athymikus egerek szubkután szövetében való beinjektálás után hat héttel új porcot alakítottak ki, amelyet morfológiailag a hialin porcénál hasonló fehér opaleszcencia jellemez. A hisztológiai és biokémiai vizsgálatokból származó adatok kimutatták, hogy aktív proliferáló kondrociták vannak, amelyek ECM-et termelnek.
Explantáció
A porcszövet vizsgálata az ana- és katabolizmus folyamatainak, a homeosztázis, a reszorpció és a javítás folyamatainak tanulmányozására szolgál. A porcszövet-explantátumokban lévő chondrocyták az ECM normál fenotípusait és összetételét támogatják, hasonlóan az in vivo articuláris porcokhoz. A szérum jelenlétében 5 napos tenyésztés után szintetikus szintet és természetes lebomlást érünk el. A reszorpciót felgyorsíthatja szövettenyészetben, és a fő tenyészet hozzáadásával szérum alkalmazásával számos ágenssel, például IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, származékai retinsav vagy aktív oxigéngyökök. A porc javításának tanulmányozása során a károsodást gyulladás (H 2 O 2, IL-1, TNF-a) oldható mediátorai vagy a mátrix fizikai szakadása indukálja .
A szervtípusos kultúrák módszere az izolált külső tényezők in vitro hatásainak tanulmányozására a chondrocytákra és a környező mátrixra. In vivo a kondrociták ritkán találhatók az ECM-ben, és nem érintkeznek egymással. Az explantus ízületi porc kultúrája megtartja ezt a szerkezeti szervezetet, valamint a chondrocyták és a környező extracelluláris környezetük közötti kölcsönhatásokat. Ez a modell a mechanikai stressz, a farmakológiai ágensek, a növekedési faktorok, a citokinek és a hormonok hatásának tanulmányozására is alkalmas a porc anyagcseréjén.
A porcszövet-explantáció másik előnye a kondrocita károsodás hiánya proteolitikus enzimekkel vagy mechanikai faktorral, amely elkerülhetetlen a sejtek izolálásakor. A receptorok és más membránfehérjék és glikoproteinek védettek a károsító tényezőktől.
Kondronok kultúrája
Hondron - strukturális, funkcionális és metabolikus ízületi porc álló egység kondrocita pericelluláris mátrix és a kompakt izzószál kapszula, és felelős a homeosztázis a mátrix. A chondronokat mechanikusan extrahálják a porcból, és több egymást követő alacsony sebességű homogenizálással gyűjtik össze őket. Izoláljuk a zónák különböző mélységű hondrony porc lehet négy kategóriába sorolhatók: egy hondron, iker hondrony, több (három vagy több) lineárisan elrendezett hondrony (oszlop hondronov) hondronov torlódások.
Egyetlen kondrór általában az érintetlen porc középső rétegeiben található, párosítva - a középső és mély rétegek határán, lineárisan elhelyezkedő több kondronok jellemzőek az ép pórus mély rétegeihez. Végül a chondron klaszterek véletlenszerűen szervezett csoportokból állnak, amelyek egy- és páros kondronokból állnak, amelyek megőrzik az aggregált állapotot a homogenizálás után. A chondronok akkumulációi nagy porcszemcsék, általában több kondront és radiálisan elhelyezkedő kollagén fibrillákat, vagyis egy tipikus szervezetet, amely a mátrix mély rétegeit jellemzi. A kondronok átlátszó agarózban immobilizálódnak, ami lehetővé teszi szerkezetük, molekuláris összetételük és metabolikus aktivitásuk tanulmányozását. Hondron rendszer - agaróz tekinthető mikro-modell a porc, amely eltér a hagyományos rendszer kondrocita - agaróz, amely megőrzi a természetes mikrokörnyezet, nincs szükség elvégzéséhez szintézisét és összeállását. A kondronok kultúrája modell a sejtek és mátrixok ízületi porcuk interakcióinak tanulmányozására normális és patológiás körülmények között.
[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]
Halhatatlan chondrocyták kultúrája
Állandó sejtvonalak létrehozásához rekombináns DNS-t vagy onkogén vírusokat használnak, amelyek a sejtet "halhatatlanokká teszik". Az halhatatlan hondrociták képesek a végtelen proliferációra, fenntartva a stabil fenotípust. F. Intradermális takonykór-Gerin és munkatársai (1995) azt mutatták, hogy az onkogén SV40T-indukált proliferációja egér kondrociták, amelyek ily módon továbbra is stabilan expresszálják a kollagének II, IX és XI típusú, valamint a közös és aggrekán kötőfehérje. Azonban egy ilyen sejtvonal megszerzi az I típusú kollagén szintézisének képességét egyrétegű tenyészetben vagy agarózgélben tenyésztve.
W. Horton és szerzők (1988) egy halhatatlan sejtvonalat írtak le alacsony kollagén II típusú mRNS expresszióval. Ezeket a sejteket az I-myc- és y-ra-onkogéneket tartalmazó egér retrovírussal történő transzformálással nyertük. Ez a típusú sejt egyedülálló modell az ízületi mátrix kölcsönhatásainak tanulmányozásához II típusú kollagén hiányában, valamint a II. Típusú kollagén szintézisének szabályozásában.
A kondropiák kultúrája mutált vagy törölt génekkel kényelmes modell a fiziológiai funkció tanulmányozásához. Ez a modell különösen alkalmas tanulmányozására a szerepe a specifikus molekulák porc mátrix szervezetek vagy hatásainak tanulmányozására különböző szabályozási tényezők porcanyagcsere. Kondrociták távoli szintetizált gén típusú kollagén IX kollagén szálak szélesebb, mint a normális, jelezve, hogy a kollagén IX típusú szabályozza az átmérője fibrillumok. Ahogy megjegyezte az 1. Fejezetben, az újonnan talált génmutáció COLAI kódoló típusú kollagén családok primer generalizált osteoarthritis. Ahhoz, hogy tanulmányozzuk a hatását mutáns II típusú kollagén az izületi mátrixban R. Dharmrvaram és munkatársai (1997) végzett transzfekció ( „szennyeződés” idegen nukleinsavat) hibás COL 2 AI (pozícióban lévő arginin 519 helyébe cisztein) humán magzati kondrociták in vitro.
Kultúrák rendszere. Az ízületben a porcok a szinoviális membránban, a szinoviális folyadékban, az ínszalagokban, a szubchondralis csontokban lévő egyéb sejtekkel kölcsönhatásba lépnek. A kondrociták metabolizmusát befolyásolhatják az ilyen sejtek által szintetizált különböző oldható faktorok. Így az arthritis ízületi porcokat a proteolítikus enzimek és a szabadgyökök szétroncsolják, amelyeket szinoviális sejtek termelnek. Ezért kifejlesztettek modelleket a porc és a környező szövetek közötti komplex kölcsönhatások tanulmányozására, amelyeket kolloktúrának neveznek.
S. Lacombe-Gleise és munkatársai (1995) tenyésztettünk nyúl ossein a tenyésztőrendszer (Costar), amelyben a sejteket elválasztjuk a mikroporózus membránrétegek (0,4 mikron) lehetővé teszi, hogy a csere a két sejttípus nem érintkeznek közvetlenül. Ez a vizsgálat demonstrálta, hogy a csontképző sejtek stimulálására kondrocita növekedést oldható mediátorok.
AM Malfait és szerzők (1994) a perifériás vér és a chondrocyták monocitái közötti összefüggést vizsgálták. Ez a modell alkalmas citokinek, gyulladásos ízületi gyulladások (reumatoid arthritis, szeronegatív spondylitis, stb.) Által közvetített folyamatok tanulmányozására. A modell szerzői a sejteket egy 0,4 μm átmérőjű pórusméretű fehérje-kötő membránnal elválasztották. A tanulmány megállapította, hogy a lipopoliszachariddal stimulált monociták kidolgozott iFNO IL-1-a, amely gátolja a szintézist a kondrociták aggrekán és hozzájárult a bomlás már szintetizált aggrekán aggregátumok.
K. Tada és munkatársai (1994) létrehozott egy közös tenyészetben modell, amelyben endotél sejtek kollagén (I-típusú) gél kerültek be a belső kamrába a külső kamrából elválasztva azt a porcsejtek elhelyezett szűrőn pórusméretű 0,4 mikron. A teljes szigetelés állapotban a külső kamrából a humán endoteliális sejtek csövet kialakított kollagén gél jelenlétében EGF vagy TGF-a. A TGF-sejtek mindkét típusának egyidejű termesztésével a csövek endoteliális sejtek általi függő képződését gátoltuk. Ennek a folyamatnak a kondrocita gátlását részben megakadályozták anti-TGF-béta antitestekkel. Feltételezhető, hogy a chondrocyták által termelt TGF-béta csökkenti a porc vaszkularizációját.
S. Groot és szerzők (1994) egyidejűleg termesztették a 16 napos magzati egér csontból származó hypertrophiás és proliferatív zónákból származó chondrocytákat agyszövetdarabokkal. Négy napi tenyésztés után a chondrocyták osteoblasztokba történő transzdifferenciálódását és az osteoidképződés kialakulását figyelték meg. A tenyésztés 11 napja után a porc egy részét csontszövet váltotta fel, és a csontmátrixot részben meszesették. Egyes agyszövet által termelt neuropeptidek és neurotranszmitterek befolyásolják az oszteoblasztok anyagcseréjét, vagy receptorok vannak rájuk. Ezek közül a norepinefrin, vasoaktív bél peptid, a kalcitonin génhez társuló peptid, a P anyag és a szomatosztatin izolálható . A chondrocytákkal tenyésztve agyszövet darabjai képesek ezeknek a tényezőknek, amelyek a kondrocita transzdifferenciálódás folyamatát indukálják osteoblasztokká.
[42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49]
A külső tényezők hatása a kondrociták kultúrájára
Az oxigénfeszültség hatása a kondrociták metabolizmusára
A legtöbb esetben a kondrocita kultúrák atmoszférikus oxigénfeszültség alatt alakulnak ki. Mindazonáltal jól ismert, hogy az in vivo kondrociták hipoxiás körülmények között léteznek, és az oxigén feszültség különböző patológiás körülmények között változik. Az érlelési folyamat során jelentős változások figyelhetők meg az epifízis vérellátásában. Mivel a vascularisation a növekvő lemez különböző területein változik, az oxigén-feszültség is változik. Brighton és S. R. Heppenstall (1971) kimutatták, hogy a lemez a sípcsont nyulak oxigén nyomás a hipertrófiás zónában kisebb, mint a környező porc. Egyes metabolikus paraméterek mérései azt mutatták, hogy a chondrocyták gyorsan képesek reagálni az oxigén koncentráció helyi változásaira. Először is, alacsony oxigén feszültség mellett, a kondrociták fogyasztása csökken. Az oxigénfeszülés 21-ről 0,04% -ra való csökkenésével nő a glükózhasznosítás, nő a glikolízis enzimaktivitása és a tejsavszintézis. Még alacsony oxigénfeszültség mellett az ATP, az ADP és az AMP abszolút mennyisége is stabil marad. Ezek az adatok jelzik a kondrocita metabolizmus irányát az energiatakarékosság maximalizálása érdekében. Mindazonáltal a szintetikus aktivitás, és ezáltal a javítási folyamatok hipoxiás körülmények között változnak.
A magas oxigénfeszültség a kondrociták metabolizmusát is befolyásolja, ami a proteoglikánok és a DNS szintézisének csökkenését, a porc mátrixának lebomlását okozza. Ezeket a hatásokat általában szabad oxigéngyökök termelése kísérte.
A környezet ionkoncentrációjának és ozmotikus nyomásának befolyásolása a kondrociták működésére
A natív porc ionkoncentráció jelentősen eltér, hogy más szövetek: nátrium-tartalmát az extracelluláris közegben 250-350 mmól, és annak ozmolaritása - 350-450 mOsm. Ha elkülönítjük porcsejtek egy videomagnó és inkubáljuk őket egy szabványos közegben (DMEM (Dulbecco minimális esszenciális táptalaj - Dulbecco minimum alap közegben) ozmolaritása - 250-280,7 mOsm) élesen változik környezetnek a sejt. Ezenkívül a kalcium és a kálium koncentrációja a standard médiumokban sokkal alacsonyabb, mint a natív szövetekben, és az anion koncentrációja sokkal magasabb.
A szacharóz hozzáadása a közeghez az ozmolaritás növekedéséhez vezet, és a citoszolban a H + és a kalcium-anionok koncentrációjának tranziens intracelluláris növekedését idézi elő . Az ilyen intracelluláris változások befolyásolhatják a kondrocita differenciálódás folyamatát és metabolikus aktivitását. J. Urban és munkatársai (1993) megállapította, hogy a felvétel a 35 8-szulfáton szárítjuk, és 3 H-prolin izolált kondrociták inkubáljuk DMEM alkalmazott standard tápközegben 2-4 óra hosszat, csak 10% volt az, hogy a natív szövet. A szintézis intenzitása maximálisan elérte a 350-400 mosmol extracelluláris közeg ozmolaritását, mind az újonnan izolált kondrocitákban, mind a porcszövetben. Ezenkívül a kondrociták térfogata 30-40% -kal nőtt, miután az izolált sejteket az ozmolaritás standard DMEM közegébe helyeztük. Azonban, amikor a tenyésztett porcsejteket alatt nem-fiziológiás ozmolaritás 12-16 órán át, a sejtek alkalmazkodik az új környezetbe azáltal, hogy csökkenti a intenzitása nyírási arányos bioszintézis ozmolaritása az extracelluláris tápközegben.
P. Borgetti és munkatársai (1995) vizsgálták a hatását ozmolaritása az extracelluláris tápközegben a növekedés, a morfológia és a bioszintézis sertés kondrociták. A szerzők kimutatták, hasonló biokémiai és morfológiai jellemzőinek kondrociták közegben tenyésztjük, egy ozmolaritás mOsm 0,28 és 0,38. Amikor 0,48 mOsm a közeg ozmolaritása az első 4-6 órás tenyésztés volt megfigyelhető a sejtburjánzás csökkenése és a fehérje szintézist, de később történt vissza ezeket a paramétereket, hogy végül elérte a kontroll értékeket. Amikor tenyésztjük kondrocitákat tartalmazó közegben 0,58 mOsm ozmolaritás sejtjei elvesztik azon képességüket, hogy támogassák fiziológiás intenzitása proliferatív folyamatok és 6 nap után a kondrociták száma jelentősen csökken. Amikor 0,58 mOsm ozmolaritás táptalajt megfigyelt erős fehérjeszintézis gátlása. Ezen túlmenően, amikor közegben tenyésztjük, egy ozmolaritás mOsm 0,28-0,38 kondrociták megőrzik fiziológiai fenotípusát nagyobb ozmolaritású (mOsm 0,48-0,58) jelentős változásokat a sejtek morfológiai, mint megnyilvánult elvesztése jellemző fenotípust kondrociták konverziós a fibroblaszt-szerű sejtek, és a veszteség a cella kapacitásának összeszereléséhez mátrix proteoglikánok. A vizsgálat eredményeit a porcsejtek jelzik fogékonyság ingadozások a korlátozott ozmolalitása kívüli környezetben.
Más ionok koncentrációjának megváltozása szintén befolyásolhatja a bioszintézis folyamatát a kondrocitákban. Így a beépülés mértéke a 35 S (szulfát) növeljük a felére növekvő kálium-ion koncentráció 5 mmol (a koncentráció a szokásos környezetben a DM EM) és 10 mM közötti (a koncentráció a ECM in vivo). A kalcium-koncentrációja kisebb, mint 0,5 mmol támogatott kollagén termelést az érett szarvasmarha kondrociták, míg a koncentráció 1-2 mM (koncentrációnak felel meg a szabványos környezetben DM EM) szignifikáns mértékben csökkentette a kollagén szintézis. A bioszintézis mérsékelt növekedését figyelték meg magas kalciumszint (2-10 mmol) mellett. Különböző kationok vesznek részt a kondrociták VKM fehérjékhez való kötődésében. Így a magnézium- és mangánionok kapcsolódnak a fibronektinhez és a II típusú kollagénhez, míg a kalciumionok nem járulnak hozzá a kondrociták fehérjékhez való kötődéséhez. Így a leírt vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a táptalaj kálium, nátrium, kalcium és ozmolaritásának extracelluláris ionjainak változása befolyásolja a standard médiumokban inkubált kondrociták bioszintetikus funkcióját.
Mechanikus stressz hatása a kondrociták metabolizmusára
A kötés immobilizációja a porc reverzibilis atrófiáját okozza, ami jelzi a mechanikai ingerek szükségességét az ECM metabolikus folyamatok normális lefolyásához. A legtöbb esetben a használt sejttenyésztési modellek normál atmoszférikus nyomás alatt állnak fenn. M. Wright és szerzők (1996) kimutatták, hogy a mechanikai környezet befolyásolja a kondrociták anyagcseréjét, a sejtek reakciója a sűrítési terhelés intenzitásától és gyakoriságától függ. Kísérletek a terhelés a intakt explantátumokat az izületi porc in vitro csökkenést mutatnak a fehérjék szintézisének és proteoglikánok statikus terhelés alatti, a dinamikus terhelés míg stimulálja ezeket a folyamatokat. A pontos végrehajtási mechanizmusait mechanikai terhelést hatások porc összetett, és valószínűleg kapcsolatban törzs sejtek, a hidrosztatikai nyomás, ozmotikus nyomás, elektromos potenciál és a sejtfelszíni receptorokat a mátrix molekulákhoz. E paraméterek hatásának tanulmányozásához olyan rendszert kell létrehozni, amelyben egy paraméter egymástól függetlenül változik. Például egy explant tenyészet nem alkalmas a sejtek deformációjának tanulmányozására, de használható arra, hogy tanulmányozza a nyomás hatását a kondrociták metabolikus aktivitására. Tömörítés a porc vezet a sejt-alakváltozás, és is kíséri előfordulása hidrosztatikus nyomás gradiens, elektromos potenciál, és a folyadék áramlási változást fizikokémiai olyan tényezőket, mint a víztartalom a mátrixban, a sűrűsége elektromos töltés, a szint az ozmózisnyomás. A sejtek alakváltozását tanulmányozhatjuk izolált kondrociták segítségével, amelyeket agaróz vagy kollagén gélbe merítünk.
Számos rendszert fejlesztettek ki a mechanikus stimulációnak a chondrocyták kultúrájára gyakorolt hatásának tanulmányozására. Egyes kutatók olyan rendszert használnak erre a célra, amelyben a nyomást a gázfázison keresztül a sejtkultúrára alkalmazzák. Például, a JP Veldhuijzen és munkatársai (1979) segítségével légköri nyomás feletti nyomás 13 kPa alacsony frekvenciájú (0,3 Hz) 15 perc alatt, megfigyelt növekszik a cAMP-szintézis és proteoglikánokat és DNS-szintézis csökkenését. R. Smith és munkatársai (1996) kimutatta, hogy a szakaszos besugárzás primer kultúrájának kondrociták Bull hidrosztatikus nyomás (10 MPa) 1 Hz-nél 4 órán növekedését okozta a szintézisének aggrekán és kollagén II típusú, míg az állandó nyomás nem volt hatása a ezeket a folyamatokat. Egy hasonló rendszert M. Wright és munkatársai (1996) számolt be, hogy a ciklikus nyomást a sejttenyészet társul hiperpolarizációja a sejtmembrán a kondrociták és aktiválását Ca 2+ -függő káliumcsatornák. Így a ciklikus nyomás hatásait ioncsatornák közvetítik, melyeket a kondrocícium membránban nyújtanak. A kondrociták hidrosztatikus nyomásra gyakorolt hatása a sejtkultúra körülményeitől és az alkalmazott terhelés gyakoriságától függ. Így, ciklikus hidrosztatikus nyomás (5 MPa) csökkenti a beépítése szulfát beépülését kondrocita egyrétegű frekvencián 0,05, 0,25 és 0,5 Hz, míg a feletti frekvenciákon 0,5 Hz felvételét szulfát porc explantum növekszik.
Bushmann M. és munkatársai (1992) számolt be, hogy a kondrociták agarózgélben Mr. Változtatja bioszintézis válaszul a statikus és dinamikus mechanikai terhelések, valamint a termesztett intakt szerv. A szerzők azt találták, hogy a mechanikai terhelés hiperozmotikus ingereket eredményez, amit a kondrociták pH-jának csökkenése követ.
A mechanikus nyújtás hatása a gélbe merített sejtek tenyészetén tanulmányozható. A nyújtóerő számítógépes vezérlésű vákuum segítségével hozható létre. Amikor a rendszer egy bizonyos fokú vákuum, az alján egy Petri-csészében egy sejttenyészetet meghosszabbodik ismert mennyiségű, egy maximális deformáció a széleken a csésze alján, és minimális a központban. A nyúlást továbbítják és tenyésztik egy petri-csészében a kondrocitákban. Ezzel a módszerrel, Holm-Vall K. és munkatársai (1995) kimutatták, hogy tenyésztett kollagén (II típus) gél chondrosarcoma sejtek megnövekedett expresszióját mRNS és 2 -integrina. Egy 2 p r integrin képes kötődni II típusú kollagén. Ezt mechanoreceptornak tekintjük, mivel kölcsönhatásban van az aktin-kötő fehérjékkel, ezáltal összekapcsolva az ECM-et és a citoszkeletont.
A pH hatása a kondrocitás anyagcserére
A porcszövet ECM intersticiális folyadékának pH-ja savasabb, mint más szövetekben. A. Maroudas (1980) meghatározta az ízületi porc pH-ját 6,9-nél. W. Diamant és társtulajdonosok (1966) patológiás körülmények között 5,5 értéket talált. Ismeretes, hogy a chondrocyták alacsony PO2-szinten élnek, ami jelzi a glikolízis (a teljes glükóz metabolizmus 95% -a) fontos szerepét ezen sejtek metabolizmusában; A glikolízishez nagy mennyiségű tejsav keletkezik.
A környezet glikolízis termékeinek savasodása mellett a mátrix komponensek is nagy jelentőséggel bírnak. Számos rögzített negatív töltés az extracelluláris proteoglikánok módosítja az ionos összetétele: van egy nagy koncentrációjú szabad kationokat (például H +, Na +, K + ) és alacsony koncentrációjú anionok (például, O2, NPHS). Továbbá, az intézkedés alapján a mechanikai terhelés lép fel kiűzése víz az ECM, amely fokozott koncentrációjú fix negatív töltések és minél több kationok a mátrixban. Ennek oka az extracelluláris tápközeg pH-értékének csökkenése, amely befolyásolja az intracelluláris pH-t, ezáltal módosítva a kondrociták anyagcseréjét. R. Wilkin és A. Hall (1995) vizsgálták a hatását a pH-ja az extracelluláris és intracelluláris környezet mátrix bioszintézis izolált szarvasmarha kondrociták. Megfigyelték a mátrixszintézis kettős módosítását a pH csökkenésével. Egy enyhe csökkenése pH (7,4
[50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]
A táptalaj összetételének hatása a termesztésre a chondrocyták metabolizmusára
A kondrociták tenyésztéséhez használt táptalajnak meg kell felelnie a kísérleti körülményeknek. Az utóbbi években a borjúszérumot alkalmazták a tenyésztési körülmények optimalizálására. Szérum alkalmazása során azonban számos fontos szempontot kell figyelembe venni:
- a szövetek perifériájából származó sejtek külső növekedése a szervtenyészetekben,
- a különböző sorozatú szérumok összetételének változékonyságát,
- ismeretlen elemek jelenléte bennük,
- fokozott interferencia kockázata, a különböző biológiai faktorok sejtek metabolikus aktivitásának befolyásolásában való tanulmányozásában.
Ez utóbbi példája az EGF hatása a patkányok porcszondóztáinak hatására. EGF stimulált beépülését 3 H-timidin és növeli a DNS-tartalom a tenyészetben. Ez a hatás alacsonyabb szérumkoncentrációknál (<1%) volt kifejezettebb, azonban nagy koncentrációkban (> 7,5%) a hatás eltűnt.
Ismeretes, hogy a borjúszérummal dúsított DMEM szintézis és degradáció szintje szignifikánsan megnövekedett az in vivo körülményekhez képest . Az in vivo és az in vitro metabolizmus közötti különbségeket a szinoviális folyadék és a sejtek tenyésztésének környezete közötti különbségek okozhatják. D. Lee és munkatársai (1997) tenyésztettünk kondrociták növendékbikák agaróz alkalmazásával tartalmazó tápközegben DMEM, dúsított 20% borjúszérummal és nagyszámú allogén normális ízületi folyadék. A szinoviális folyadék jelenléte a táptalajban indukálta a proteoglikánok számának növekedését, a szinoviális folyadék teljes mennyiségének 80% -áig. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a szinoviális folyadék a tenyészetben olyan metabolikus sebességet indukál, mint az in vivo, a magas glikozaminoglikánszintézis és a sejtosztódás alacsony szintje.
G. Verbruggen és munkatársai (1995) azt mutatták, hogy a szintézis 35 S-arrpeKaHa humán kondrociták tenyésztjük agaróz szérum nélküli DMEM tápközeggel 20-30% volt a szint szintézis megfigyelt DMEM, kiegészítve 10% borjúszérummal. A szerzők mértékének meghatározására, amelynél az IGF-1, IGF-2, TGF-P vagy csökkent inzulintermelés aggrekán a szérum nélküli tápközeggel. A szerzők arra a következtetésre jutott, hogy a 100 ng / ml inzulint, IGF-1, vagy az IGF-2, részben a csökkent szintézisét aggrekán, hogy 39-53% a kontroll szintek. Ezen tényezők kombinációjával szinergista vagy kumulatív jelenségeket nem találtunk. Ugyanakkor, 10 ng / ml TGF-P jelenlétében 100 ng / ml inzulinnal stimulált szintézisét aggrekán 90% vagy több, a referencia szintet. Végül, a szérum transferrin önmagában vagy inzulinnal kombinálva nem befolyásolta az aggregre szintézisét. Amikor a borjúszérumot szarvasmarha-szérumalbuminnal helyettesítjük, az aggregátum tartalma szignifikánsan csökkent. Dúsítás táptalajt inzulin, IGF, vagy TGF-P részben felújított a sejtek azon képességét, hogy készítsen aggrekán aggregátumok. Ebben az esetben az IGF-1 és az inzulin képes fenntartani a homeosztázis sejtkultúrákban. 40 nap után a tenyészet kiegészített tápközegben 10-20 ng / ml IGF-1, a proteoglikánszintézist tartottuk ugyanazon a szinten, vagy még ennél is magasabb, összehasonlítva tápközeg, amely 20% borjúszérumot. Katabolikus folyamatok lassan haladt kiegészített tápközegben az IGF-1, mint a tápközegben, melyet 0,1% -os albumin oldattal, de valamivel gyorsabb kiegészített tápközegben 20% szérumot. A hosszú élettartamú kultúrákban a 20 ng / ml IGF-1 fenntartja a sejtek stabil állapotát.
D. Lee és munkatársai (1993) összehasonlították a jelen találmány szerinti készítmény táptalajt (DMEM, DMEM + 20% borjú szérummal, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) a DNS-szintézis egy kultúra explantátum porc, egyrétegű kultúrát és szuszpenzióban agaróz . Amikor tenyésztjük agaróz jelenlétében szérum szerzők megfigyelhető a tendencia, hogy csoportosítása kondrociták nagy koncentrációban. A sejteket tenyésztettük szérum nélkül és IGF1, megtartják kör alakúak agaróz, gyűjtöttünk kis csoportokban, de nem nagy aggregátumokat képeznek. A monoréteg DNS-szintézis szignifikánsan magasabb volt a szérum-tartalmú tápközegben, mint a kiegészített táptalajon IGF-1; A DNS szintézise az utóbbiban sokkal magasabb volt, mint a nem feljavított környezetben. Amikor tenyésztjük kondrociták szuszpenzióban agarózt nem koncentrált tápközeg, és egy olyan közeget IGF-1, nincs különbség a DNS-szintézist. Ugyanakkor a zagy tenyésztünk kondrociták agaróz kiegészített tápközegben a szérum, kísérte beépülésének megnövekedését radionukleotid 3 H-timidin, mint más környezetekben.
A C-vitamin szükséges a kollagén fibrillák stabil spirálszerkezetének kialakulásában részt vevő enzimek aktiválásához. Az aszkorbinsav tekintetében hiányos kondrociták szintetizálják a kollagén nem hidroxilált, nem spirális elővegyületeit, amelyek lassan szekretálódnak. Az aszkorbinsav bevezetése (50 μg / ml) a II. És a IX. Kollagén típus hidroxilációját és normál mennyiségben történő szekrécióját idézi elő. A C-vitamin hozzáadása nem befolyásolta a proteoglikánok szintézisét. Következésképpen a kollagén szekréciója a proteoglikánok szekréciójától függetlenül szabályozódik.