Embrionális őssejtek

Az embrionális őssejtek felfedezése nem véletlenül történt, hanem a fejlődésbiológia területén végzett tudományos kutatás előkészített talaján jelent meg. Az „őssejt” kifejezést 1908-ban, a berlini hematológiai társaság kongresszusán vezette be az orvostudományba Alekszandr Makszimov a hematopoietikus sejtekkel kapcsolatban. Jóval a pluripotens embrionális őssejtek stabil vonalainak izolálása és előállítása előtt a terato-(embrionális karcinóma) őssejteket a korai fejlődési folyamatok vizsgálatában használták, amelyek segítségével az embriogenezis ismeretlen mechanizmusait vizsgálták, beleértve a korai gének expressziós szekvenciáját és aktivitásuk fehérjetermékeit.

De vajon az emberi genom totipotenciája visszavonhatatlanul elveszett az evolúció folyamatában? Nem, és az embriogenezis erre bizonyíték. Ha ez így van, akkor elvileg mikor valósul meg az evolúciós fejlődés második útja? Valószínűleg akkor, amikor az ember belép az űrbe, ahol a környezeti feltételek viszonylag állandóak lesznek kellően hosszú ideig. A csontszövet elvesztése (a csontok demineralizációja súlytalanság állapotában), amely nagyon lassan alakul át és regenerálódik, az ember, mint faj, űrbeli létezéshez való alkalmazkodásának első lépésének tekinthető. Az evolúciós fejlődés második útjának ára azonban más lesz - a totipotencia és az abszolút plaszticitás minden sejtben való visszatérésének ára a sterilitás lesz. Tehát ebben az „evolúciós kaméleonok” világában meiózis nélkül, rügyezéssel kell szaporodnunk. De sokáig fogunk élni. A telomeráz halhatatlansága az amőba halhatatlansága. Egy többsejtű szervezetben az őssejtek a mennyiségi és minőségi hosszú élettartam szubsztrátjai.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Az embrionális őssejtek forrásai

Napjainkban a laboratóriumi kutatásokhoz használt embrionális őssejtek forrásai az egér teratokarcinóma sejtvonalak (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) és az emberi teratokarcinóma sejtvonalak (NTERA-2, TERA-2, H-9 klón), valamint a Trauneon ESC sejtvonalak. Azonban a részletes sejtútlevél megléte, amely feltünteti az immunfenotípust, a kromoszóma-analízis eredményeit, az mRNS expressziós profilokat, a szabaddá vált receptorokat és az intracelluláris jelátviteli fehérjéket, nem kompenzálja a teratokarcinóma ESC sejtvonalak jelentős hiányosságait - a totipotencia gyors elvesztését és a klinikai vizsgálatokban való alkalmazásuk lehetetlenségét, míg a tenyészetben történő vegyes differenciálódás nagyon megnehezíti egy tiszta, specializált vonal izolálását egy heterogén sejtpopulációból. Ezért a klinikai célokra létrehozott ESC sejtvonalak forrása általában a blasztociszta belső sejttömege, a 8 sejtes stádiumú embriók egyedi blasztomerjei, a későbbi stádiumú morulasejtek, valamint a primordiális csírasejtek.

Meg kell jegyezni, hogy a teratokarcinóma sejtek, bár rendelkeznek a pluripotencia tulajdonságával, lényegesen alacsonyabb pluripotens potenciállal rendelkeznek az ESC-khez képest. Integrációjuk az embrionális sejtekkel ritkán vezet kimérák kialakulásához, amelyek ráadásul soha nem képeznek a teratokarcinóma sejtek genotípusával rendelkező gamétákat. Úgy vélik, hogy ez a teratokarcinóma sejtek tenyésztése során gyakran előforduló kromoszóma-rendellenességeknek köszönhető: az Y-kromoszóma elvesztése, különféle triszómiák, deléciók vagy transzlokációk.

Többször is próbálkoztak már emberi embrionális őssejtvonal (ESC) izolálásával, de ez a feladat nem oldódott meg, mivel a normál emberi blasztocisztákhoz nehéz hozzáférni. Ezenkívül az emberekben a kromoszóma-rendellenességek gyakorisága magasabb, mint az állati embriogenezisben. Az in vitro megtermékenyítés után kapott korai emberi embriók túlnyomó többsége kaotikus kromoszóma-mozaikosságokat mutat, és gyakran számbeli és szerkezeti rendellenességekkel rendelkeznek. Még később, a blasztociszta stádiumban is az emberi embrióknak csak 20-25%-a áll normális kariotípusú sejtekből. Gyakorlatilag lehetetlen volt ilyen embriókat ESC-k létrehozására használni, mivel a zigótákat általában két- vagy négyblasztomer stádiumig tenyésztették, majd a méhbe ültették át. Csak viszonylag nemrégiben fejlesztettek ki megbízható technikát a megtermékenyített emberi petesejtek blasztociszta stádiumig történő tenyésztésére. Ennek a technikának a bevezetése az in vitro megtermékenyítés gyakorlatába nemcsak a sikeres beágyazódási eredmények gyakoriságát növelte, hanem a normál blasztocisztákat is hozzáférhetőbbé tette.

Egy másik pluripotens őssejtforrás a primordiális csírasejtek, amelyek – ellentétben a germinális hám fejlettebb progenitor populációival – nem rendelkeznek béta-integrinnel a felszínükön, de magas aktivitású alkalikus foszfatázt expresszálnak. Meg kell jegyezni, hogy a primordiális csírasejtekből képződő őssejt-populációkat az 1980-as évek óta kísérletileg vizsgálják. Akkoriban fejlesztettek ki egy technikát a primordiális csírasejtek izolálására az egérembrió ivarmirigyének csökevényéből. A primordiális csírasejtek in vitro tenyésztésének első sikertelen eredményei arra utaltak, hogy ezek a kísérletek hiábavalóak, mivel a sejtek, bár túlélték, nem szaporodtak, és az első napon belül elpusztultak. Később megállapították, hogy az egér primordiális csírasejtek in vitro csak oldható és membránhoz kötött specifikus polipeptid növekedési faktorok jelenlétében szaporodnak a táptalajban. Számos tanulmány eredményei kimutatták, hogy a primer csírasejtek túléléséhez és szaporodásához nemcsak a LIF, hanem a membránhoz kötött és oldható Steel faktorok (SIF) jelenléte is szükséges a táptalajban. Ezeket a peptideket a Steel-mutációra homozigóta embriók szomatikus sejtjei termelik, és egyikük a cKit protoonkogén ligandja.

Az emlősök és az emberek primer csírasejtjei extragonadális eredetűek, és a csírasejtvonal klonális fejlődésének forrásai. A primordiális csírasejtvonal, valamint az összes embrionális szövet és az extraembrionális mezoderma eredete a korai embriók epiblasztja (primer ektodermája), amely mozaikos szerkezeti szerveződésű. A korai embrió különböző részeinek mikrosebészeti eltávolításával meghatározták a primordiális csírasejtek elkötelezett prekurzorainak klónjának lokalizációs zónáját az epiblasztban. A rodamin-dextrán, amelyet sejtmarkerként használtak, segítségével megállapították, hogy a primordiális csírasejtek prekurzorai az epiblaszt proximális régiójában, az extraembrionális ektoderma közelében lokalizálódnak. A primordiális csírasejtvonal egy 45 sejtes klónból származik, amelynek eloszlása a gasztruláció legelején történik. Ezután a klón szegregálódik, és a gasztruláció során a primer csírasejtek belépnek az extraembrionális mezodermába, és az allantois rudiment alján találhatók, a primer csík mögött. Innen az elsődleges csírasejtek a hátsóbél endodermájának ventrális része felé vándorolnak, majd aktívan haladnak a bélfodrozódás mentén, a migráció végén benépesítve a nemi szerveket. A migráció során, valamint az ivarmirigy-csíraszövetben való lokalizációjuk első 2-3 napjában az elsődleges csírasejtek aktívan szaporodnak és nyolc replikációs cikluson mennek keresztül. Ha a migráció kezdetén körülbelül 50 elsődleges csírasejt van, akkor a tizenkét napos fejlődésű egérembriók nemi szervi gerinceiben az elsődleges csírasejtek száma meghaladja a 25 000-et.

Az ESC-k és a primordiális csírasejtek funkcionális hasonlóságát bizonyítja az utóbbiak teljes integrációja a blasztocisztába a belső sejttömeg pótlásával, majd az embrió teljes értékű fejlődése, amelynek szövetei csak az primordiális csírasejtek leszármazottaiból állnak. Más tulajdonságokban az egér primordiális csírasejtek is azonosnak bizonyultak az ESC-kkel, demonstrálva a képességüket a különböző irányokba való differenciálódásra, az embrioid testek in vitro képzésére, valamint az immunhiányos egerekbe szubkután beadva in vivo teratómák képzésére, amelyek a 129/ter egerek spontán here teratómáira hasonlítanak.

Megállapították, hogy amikor LIF-et, membránhoz kötött és oldható SIF-et adnak a táptalajhoz, a 8 napos egérembriók izolált primer csírasejtjei 4 napig túlélnek és szaporodnak a tenyészetben, de utána elpusztulnak. Ezenkívül az az időszak, amikor a primer csírasejtek pusztulását megfigyelik a tenyészetben, egybeesik az egérembriók fejlődési szakaszával (12,5-13,5 nap), amikor a női primer csírasejtek meiózisba lépnek az ivarmirigyek rudimentumában, és a hím primer csírasejtekben a mitotikus osztódások blokkolódnak. Ha azonban nemcsak a LIF és SIF növekedési faktorokat, hanem az FGF2-t is hozzáadják a táptalajhoz, a primer csírasejtek tovább szaporodnak, és az alkultúrákban olyan sejtkolóniák alakulnak ki, amelyek a növekedési faktorok (SIF és FGF) táptalajból való eltávolítása után is képesek szaporodni. Az ilyen sejtek hosszú ideig tenyészthetők embrionális fibroblasztok szubsztrátján oldható LIF növekedési faktor hozzáadása nélkül. Javasolták, hogy ezeket a primordiális csírasejtekből kapott stabil sejtvonalakat embrionális csírasejteknek nevezzék. Ez a kifejezés egyáltalán nem sikeres, mivel az EG-sejtek tenyésztésével lehetetlen olyan embrionális csírasejteket nyerni, amelyek képesek az oogenezis vagy a spermatogenezis további szakaszainak végrehajtására. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy az EG-sejtvonalak, bár primordiális csírasejtekből származnak, de a tenyészetben embrionális pluripotens őssejtek tulajdonságait elnyerve elveszítik a csíravonalakhoz való elköteleződés képességét. Más szóval, a primordiális csírasejtek tenyésztéskor elveszítik a gaméta prekurzorok tulajdonságait, és ESC-szerű pluripotens sejtekké alakulnak át.

Megfigyelték, hogy teratómák nem alakulnak ki, amikor EG-sejteket juttatnak immunhiányos egerekbe. Feltételezik, hogy az emberi EG-sejtek teratómaképződési képességének elvesztése annak köszönhető, hogy ezeket a vonalakat nem közvetlenül tenyésztett primer csírasejtekből hozták létre, hanem embriótestekből izolált sejtekből. Ezért lehetséges, hogy ezek pluripotens, de már elkötelezett sejtek leszármazottai.

Meg kell jegyezni, hogy alapvető különbségek vannak az EG-sejtek és a primordiális csírasejtek között. Ez utóbbiak nem teszik lehetővé kiméra egérembriók előállítását, ami a primordiális csírasejtek belső sejttömegbe vagy trophektodermába való integrálódásának hiányát jelzi. A primordiális csírasejt-populáció jellemzői jobban hasonlítanak a későbbi embriók szomatikus sejtjeinek elkötelezett vonalaihoz, amelyek blasztocisztába juttatása szintén nem vezet kiméra embriók kialakulásához.

Az EG-sejtek aggregációjával kapott embrioid testek tenyésztési technikájának módosítása lehetővé tette egy másik pluripotens sejtpopuláció, az úgynevezett „embrioid testből származó sejtek” (EBD-sejtek) előállítását szelektív táptalajon történő szelekció alkalmazásával. Az EBD-sejtek hosszú távú tenyészetbeli szaporodási képessége lehetővé tette elkötelezett sejtek stabil sejtvonalainak létrehozását. Olyan sejtklónokat kaptak, amelyek specializált sejtek széles skáláját expresszálják mRNS- és fehérjemarkerekkel. Ez a megközelítés végül bebizonyította, hogy az emberi primer csírasejtek pluripotensek, és in vitro különböző sejttípusokká differenciálódnak: neuronokká, neurogliává, vaszkuláris endotéliummá, hematopoietikus sejtekké, izom- és endodermális sejtekké.

Az embrionális őssejtek alternatív forrásai

Az emberi ESC-vonalak alternatív forrása lehet a hibrid sejtek. Az emberi magzat szomatikus sejtjeinek és egy olyan tehénpetesejtnek az elektroporációval történő fúziójával kapott heterogén konstrukció beültetése álvemhes tehenek méhébe lehetővé teszi belső sejttömeg kinyerését egy preimplantációs fejlődési stádiumú mesterséges embrióból. Erre a célra az első szakaszban blasztocisztát nyernek egy átültetett emberi sejtmaggal rendelkező tehénpetesejtből.

A második szakaszban egy embrioblasztot izolálnak a blasztocisztaból, majd ebből Thomson-módszerrel izolálják az ESC-ket. Érdemes megjegyezni, hogy az ESC-vonalak ezzel a módszerrel történő izolálásával a legjobb eredményeket a follikuláris sejtek vagy az emberi testben hibernált állapotban maradt primer csírasejtek magjaival érték el. Ez annak köszönhető, hogy a tehénpetesejtbe átültetett emberi sejtek magjainak nem rövidült telomerekkel és magas telomeáz aktivitással kell rendelkezniük, ami segít elkerülni a hibrid petesejtből nyert ESC-klónok idő előtti öregedését (Repin, 2001). Ismert, hogy az ESC-k legfontosabb intracelluláris markerfehérjéi az Oct3, Oct4, Tcf és Groucho, amelyek az úgynevezett kromatin-csendesítő fehérjékhez tartoznak. A csendesítők a heterokromatin különösen kompakt csomagját biztosítják, ami megakadályozza az eukromatin-hurkok kialakulását. Ezen fehérjék által közvetített kromatin-csomagolás korrelál az ESC-genom totipotenciájával. A mai napig megállapították, hogy az érett szarvasmarha- és emberi oociták az egyetlen specializált sejttípus, amelyek citoplazmájában nagy koncentrációban tartalmaznak csendesítő fehérjéket. Ennek alapján kidolgoztak egy módszert hibrid ESC-k előállítására szomatikus sejtmagok enukleált szarvasmarha-oocitákba történő átvitelével. Előzetes in vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a szarvasmarha-oociták citoplazmája 12-24 órás tenyésztés után helyreállítja az emberi szomatikus sejtmagok genomjának totipotenciáját.

Különösen érdekesek az emberi embriók preimplantációs fejlődésének sajátosságaira vonatkozó adatok, amelyek a totipotens sejtek pluripotens sejtek populációjával való későbbi helyettesítésére utalnak, mint az egerekben. A sejtes transzformációk vizsgálata kimutatta, hogy az ESC-k mellett a trofoblaszt sejtek az emberi blasztociszták belső sejttömegének sejtjeiből is keletkeznek, ami azok teljes potenciáljára utal.

Ismeretes, hogy a blasztociszta stádiumában két különböző elkötelezettségű sejtpopuláció keletkezik. Az egyik a blasztociszta külső rétegét alkotja - a trophektodermát, amelynek származékai a trofoblaszt sejtek és a méhlepény egyéb embrionális komponensei. A második sejtpopuláció sűrű tömeggé csoportosul, amely érintkezik a trofoktoderma belső felszínével. A belső sejttömeg sejtpopulációjának származékai az embrió szerveinek összes szövete és rudimentuma. A késői blasztociszta stádiumában a belső sejttömegből képződik az extraembrionális endoderma, és létrejön az epiblaszt (primer ektoderma). Ebben az esetben az epiblaszt sejtek megőrzik pluripotenciájukat, míg az extraembrionális endoderma sejtjeinek differenciálódásának képessége korlátozott.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Emberi embrionális őssejtek kinyerése

Egészen a közelmúltig azt hitték, hogy lehetetlen trofoblasztból élő élőlény-őssejteket (ESC-ket) kinyerni. Azonban egy blasztocisztaból izolált diploid trophektoderma őssejtvonal szaporodik és őssejtekké alakul egy olyan táptalajban, amely FGF2-t és heparint tartalmaz LIF helyett. Ha az FGF2-t eltávolítják a táptalajból, a trophektoderma sejtek szaporodása leáll, megkezdődik bennük a kromoszóma endoreduplikáció, és a trophektoderma sejtes elemei fokozatosan óriás trofoblaszt sejtekké alakulnak át. Valószínűleg a LIF nem serkenti a trophektoderma sejtek proliferációját, mivel az FGF2 egy másik transzszignalizációs mechanizmust indít el, mivel az FGF2 a plazmareceptorhoz (FGFR2) kötődve aktiválja a citoplazmában található MAP kinázokat - ERK1-et és ERK2-t. Következésképpen, amikor a blasztociszta sejtekben bekapcsol az egyik jelátviteli útvonal (LIF - gpl30 - JAK kináz - STAT3), a belső sejttömeg sejtjei pluripotens ESC-kké alakulnak át, és amikor a transzmembrán jelátvitel második mechanizmusa (FGF2 - FGFR2 - MAP kináz ERK1/ERK2) aktiválódik, trophektoderma őssejtek képződnek a blasztocisztákban. A jelátviteli útvonal megválasztása viszont az oct4 gén aktivitásától függ. Ez a POU doménhez tartozó gén az autoszóma 17 t lokuszában található, és az oogenezis, a hasítási időszak alatt, valamint a blasztociszta belső sejttömegének sejtjeiben és az elsődleges csírasejtekben expresszálódik. Az oct4 gén funkcionális szerepe egy olyan transzkripciós faktor kódolása, amely a pluripotens sejtek kialakulásához, differenciálódásához és dedifferenciálódásához szükséges.

Az oct4 gén expressziója az ESC-kben a transzkripciós faktor és a kofaktorok kölcsönhatásától függően változik. Az oct4 expressziójának irányított szabályozása blasztocisztákban kimutatta, hogy amikor aktivitása csökken, a sejtek fele trophektodermát képez, míg amikor az oct4 indukált expressziója fokozódik, túlnyomórészt ESC-k jelennek meg.

A kísérletben az embrionális őssejtek (ESC-k) nem vihetők át sejtvonalba a totipotens blasztomer tenyésztése során a hasítási szakaszban, valamint a gasztrulációs szakaszban és az embrionális fejlődés későbbi szakaszaiban. Az egér ESC-ket általában a terhesség 3,5-4,5. napján izolálják, ami a normális embriogenezis hatodik (egyrétegű blasztociszta) és hetedik szakaszának (kétrétegű blasztociszta - korai petesejt-henger) felel meg. Nyilvánvaló, hogy az egérembriók csak a preimplantációs időszakban tartalmaznak ESC-kké átalakulni képes sejtpopulációkat. Következésképpen az ESC-vonalak izolálása csak az embriogenezis bizonyos szakaszaiban lehetséges. A hasítás során keletkező zigóta és blasztomer totipotens, az életképes embrió embrionális membránokkal és méhlepénynyel való fejlődésének lehetősége szempontjából. A csírasejtek teljes potenciájának elvesztése a késői morula stádiumban kezdődik, amikor a blasztomer további elköteleződése a helyüktől függ. A korai morula blastomerek megtartják a totipotenciát, mivel a lokalizációjukban bekövetkező változásokkal végzett kísérleti manipulációk, például a helyük inverziója, nem akadályozzák meg a teljes értékű embrió fejlődését.

Megállapították, hogy az embrionális őssejt-sejtek (ESC-k) egy sejtvonalba történő izolálásának hatékonyságát befolyásolja a blasztociszták állapota az extraplantációjuk idején. A blasztociszták alkalmazása a vemhesség 3,5. napján ovariektomizált és progeszteronnal kezelt egerek reproduktív traktusában egy hétnapos diapauza modellezése után elősegíti az embrionális őssejtvonalak sikeresebb izolálását. Feltételezik, hogy ilyen körülmények között a belső sejttömeget alkotó blasztomerek száma megnő. Az is lehetséges, hogy a sejtciklus meghosszabbodik, és a legtöbb blasztomer belép a G0 fázisba.

Ezenkívül a stabil pluripotens ESC-vonalak létrehozása az embriók genotípusától is függ: az ESC-k viszonylag könnyen izolálhatók a 129-es egérvonal blasztocisztáiból, sokkal nehezebb CS7BL/6 egerek felhasználásával előállítani őket, és gyakorlatilag lehetetlen ESC-vonalat izolálni CBA/Ca egerek blasztocisztáiból. Nyilvánvaló, hogy a korai embriók rendelkeznek bizonyos genetikai jellemzőkkel, amelyek befolyásolják a pluripotens ESC-vonal fejlődését. Mindazonáltal izolált epiblasztok tenyésztésekor, valamint a differenciálódó sejtek szelektív szelekciójával ESC-vonalakat izoláltak a CBA/Ca egerek korai embrióiból.

A korai embriókkal végzett kísérletek technikáját ismertető laboratóriumi kézikönyvekben bevált standard technikát találhatunk az ESC-vonalak blasztocisztákból történő kinyerésére. Kísérleti ESC-vonalak 4,5 napos egérembriók izolált epiblasztjának (primer ektodermájának) tenyésztésével is előállíthatók egy meglehetősen összetett mikrosebészeti technikával és módosított tenyésztési körülmények között. Az eljárás munkaigénye indokolt, mivel az ESC-vonalak kialakulásának gyakorisága ebben az esetben lényegesen magasabbnak bizonyult, mint a blasztociszta belső sejttömegével végzett munkák során.

Az ESC-vonalak izolálásához minden klónt mikrocellába helyeznek, 40-60 sejtből álló aggregátumot tenyésztenek, majd újra diszpergálják. Az eljárás többszöri ismétlése lehetővé teszi számunkra, hogy olyan halhatatlanná tett ESC-vonalat kapjunk, amely a műanyaghoz rögzített normokariotípusos sejtek maximális proliferációs sebességével rendelkezik, és 50-100 passzázs után is megőrzi totipotenciáját és magas telomeráz aktivitását. Az ESC-vonalak fenntartása során a legnagyobb veszélyt a táptalaj vagy a szérum bakteriális endotoxinokkal való szennyeződése jelenti - az endotoxin már nyomokban is jelen lévő koncentrációja a táptalajban az éretlen csírasejtek tömeges pusztulását okozza. A lineáris növekedés gondos monitorozásával és időben történő diszperzióval a tenyészetben lévő ESC-k képesek szimmetrikus osztódásra, amelyben mindkét leánysejt pluripotens marad, és korlátlan számú sejtciklus végrehajtására képes, megőrizve a diploid kariotípust és a teljes potenciát.

Az emberi ESC-k tiszta populációjának szelekciója elvégezhető a genomjuk olyan rekombináns DNS-molekulákkal történő transzfekciója után, amelyek a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) szintézisét kódoló gént tartalmazzák. A GFP expressziója fokozódik, ha az ESC-ket olyan körülmények között tenyésztik, amelyek elősegítik a proliferációjukat, míg a differenciálódás megkezdésével a gén expressziós szintje csökken, ami lehetővé teszi a tiszta, stabil pluripotens sejtvonalak szelekcióját szelektív táptalajon. A GFP szelekcióval izolált ESC-k tenyésztésekor a telepképződés gyakorisága sokszorosára nő, mivel a differenciált sejtek erős antiproliferatív hatása a szelekciós tenyészetek körülményei között megszűnik.

Az emberi embrionális őssejtek sejtvonallá történő transzlációját a beültetés előtti embriókból (80-120 sejtes stádiumban) történő izolálásuk módszerével végzik, amelyek az in vitro megtermékenyítési eljárás után maradnak vissza. Erre a célra a mesterségesen kapott „felesleges” embriókat mechanikusan diszpergálják Delbecco-Eagle táptalajban. Miután a sejteket szelektív monoklonális antitestekkel és fluoreszcens jelöléssel jelölték, az embrioblaszt sejteket izolálják. Az embrioblasztot diszpáz-kollagenáz keverékkel diszpergálják egyedi sejtekbe. A disszociált sejteket speciális táptalajban (80% Delbecco-táptalaj + 20% magzati borjúszérum 500 μg/ml IL-6, LIF és SCF jelenlétében) tenyésztik az első 3 passzázsból származó embrionális fibroblasztok tápláló monorétegén. Ebben az esetben az ős- és progenitor sejtek túlélése és proliferációja az IL-6, a LIF és az SCF hatására fennmarad. Ilyen táptalajban az ESC-k szabad, gömböcskés sejtek szuszpenziós klónjaiként nőnek, amelyeket lágy, ismételt pipettázással kell disszociálni. Az új klónok az 5-7. napon jelennek meg a szuszpendált tenyészetben. Az ESC-k maximális növekedési sebességét a klónok ismételt disszociációjával érik el 10-15 sejtes stádiumban. Ezután minden klónt mikrocellás lyukba helyeznek, és 40-50 sejtes aggregátummá növesztenek. Az eljárást sokszor megismétlik passzázsokban, a tenyészet térfogatát 5-10 millió sejt/6 cm-es csészére növelve. Ilyen passzázsokkal a Thomson 10 halhatatlan emberi ESC-klónt izolált, amelyek 100 passzázs után is megőrizték a magas telomeráz aktivitást, az erőteljes proliferáció képességét, minimális fenotípusos jellemzőket és teljes hatékonyságot azzal a képességgel, hogy az ekto-, mezo- és endodermából származó 350 specializált sejtvonal bármelyikévé differenciálódjanak. Az emberi ESC-k differenciálódása (táptalajcserére, szérum hozzáadására és a LIF eltávolítására) a sejtek szubsztráthoz való tapadásával kezdődött, ami a citoszkeleton fejlődését és az adhéziós receptorok expresszióját jelzi. Fontos, hogy a korlátlan proliferáció mellett az emberi ESC-k megtartották normális kariotípusukat.

Az emberi ESC-vonalak izolálásának második módszere az elsődleges csírasejtek felhasználásán alapul. Kísérleti vizsgálatok kimutatták, hogy E-sejtvonalak kinyerhetők 12,5 napos egérembriók nemi szervredőiből. Ezekben az esetekben azonban a progenitor sejtvonalak kialakulásának gyakorisága szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a korábbi embriókkal végzett kísérletekben. Ugyanakkor a 13,5 napos terhességi korú egérembriók ivarmirigyeiből származó elsődleges csírasejtek egyáltalán nem képesek vonalakká átalakulni.

Az első stabil pluripotens humán EG-sejtvonalakat 5-9 hetes embriók ivarmirigyeiből izolált primer gonocitákból nyerték. Az izolált sejteket inaktivált egérembrionális fibroblaszt szubsztráton tenyésztették DMEM táptalajban, merkaptoetanollal, forskolinnal és rekombináns humán növekedési faktorokkal (FGF és LIF) kiegészített magzati szérummal. 7-12 nap elteltével többsejtű telepek jelentek meg a tenyészetben, amelyek morfológiai jellemzőik és molekuláris markereik alapján megfeleltek a humán EG-sejteknek. Az aggregáció után ezek a sejtek embrioid testeket képeztek, amelyek további fejlődésével mindhárom csíralemez származékaira jellemző specializált sejtek jelentek meg. 10-20 passzázs során az EG-sejtvonalak megtartották normális kariotípusukat, és nem veszítették el pluripotenciájukat.

Azt is kimutatták, hogy a LIF, a membránhoz kötött és oldható Steel faktorok, valamint a TGF-β együttes hatása megváltoztatja a primordiális csírasejtek fejlődési programját. Ahelyett, hogy a mitotikus osztódások megszűnnének, és elkezdenének differenciálódni az oogenezis vagy a spermatogenezis felé, a primordiális csírasejtek tovább szaporodnak. Több további mitotikus ciklus után hasonlóvá válnak az epiblaszt sejtekhez, és elveszítve a csírasejt-prekurzorok tulajdonságait, pluripotens embrionális őssejtekké alakulnak.

Így 1998-ban elsőként izoláltak halhatatlanná tett primordiális csírasejtvonalakat emberi magzati boncolási szövet nemi szervi rudimentumából. Az emberi embriogenezis során a primordiális csírasejtek a fejlődés 3. hetében jelennek meg a petezsákban, majd a 4-5. héten ezek a sejtek a genitális tuberkulózis zónájába vándorolnak, ahol primer gonociták szunnyadó populációit alkotják. Inaktív állapotban a primordiális csírasejtek a születésig megőrződnek az embrióban. Az 5-9 hetes embriók magzati nemi tuberkulózisából primordiális csírasejtvonalakat izolálnak, amelyekből kivont szövetet ideiglenesen IV-V típusú kollagenázok, hialuronidáz és DNáz keverékével kezelik a sejtek mennyiségi és minőségi hozamának növelése érdekében. A magzati nemi tuberkulózis szövetében lévő primordiális csírasejteket stromális (mezenchimális) Sertoli-sejtek veszik körül. A Sertoli-sejtek funkcionális célja antiapoptotikus faktorok (Fas-ligand), mitogének és immunszuppresszánsok termelése, amelyek megvédik a csírasejteket a szervezet immuntámadásaitól. Ezenkívül a genitális tuberkulózis stromális mikrokörnyezete fontos szerepet játszik az ivarsejtek érésében. Az izolált primer csírasejteket egy tápláló stromális réteg fölé ültetik a tenyészetbe, amely az első három passzázs magzati fibroblasztjaiból áll. A mitogének leghatékonyabb kombinációja egy LIF-ből, FGF-ből és forskolinból (a cAMP képződésének stimulátora) álló komplex. Az primer csírasejtek in vitro proliferációjához magzati szérum hozzáadása szükséges, amelynek jelenlétében a primer gonociták szaporodása a tenyészetben a szubsztráthoz nem kapcsolódó gömb alakú sejtek klónjainak képződésével jár.

Az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézeteiben (National Institutes of Health) az emberi ESC-vonalak blasztocisztákból történő izolálására szolgáló módszerekről szóló meglévő adatok összefoglalása alapján előzetes következtetésre jutottak, hogy az ESC-k sikeres izolálása legvalószínűbb a jól kialakult belső sejttömeggel rendelkező blasztociszták tenyésztése esetén (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Ebből a szempontból az ESC-k optimális forrása a vonalak létrehozásához az 5. napon lévő emberi blasztociszták, amelyekből a trophektodermát gondosan el kell távolítani a belső sejttömeg izolálásakor. Az izolált belső sejttömeget, amely ebben a szakaszban 30-35 sejtből áll, embrionális egérfibroblasztok szubsztrátján kell tenyészteni, ami döntő feltétele az ESC-telepek kialakulásának a tenyészetben.

Az embrionális őssejtek fenotípusos jellemzőinek elemzése

Különösen érdekes az embrionális őssejtek (ESC-k) fenotípusos jellemzőinek fajok közötti összehasonlító elemzése. Megállapították, hogy az emberi ESC-telepek sűrű, lapított, hámszerű sejtekből álló csoportjai, míg az egér embrioid testek lekerekített sejtek laza konglomerátumából állnak. Az emberi ESC-kben a sejtmag-plazma arány index alacsonyabb, mint az egér ESC-kben. A majmok embrionális őssejtjei laposabb, egyenetlen szélű sejtkolóniákat alkotnak. Az egyes sejtek könnyen láthatók a főemlős ESC-k korai klónjaiban. A vizsgált állatfajok proliferáló ESC-i nem expresszálnak I. és II. osztályú MHC molekulákat. Ugyanakkor az emberi ESC-k pozitív reakciót adnak a TERA 1-60 és GCTM-2 antitestekre, ami a keratin/kondroitin-szulfát proteoglikánok jelenlétét jelzi a felületükön, ami az embrió-(terato)karcinóma őssejtekre jellemző. Az oct4 gén expressziója minden állatfaj ESC-iben arra utal, hogy a fenotípusos különbségek ellenére az emberi és egér ESC-kben látszólag ugyanazok a génkészlet aktiválódik, amelyek a pluripotencia fenntartásáért felelősek (Peru, 2001). Ezenkívül a patkány-, sertés-, nyúl-, főemlős- és szarvasmarha-embriókból izolált ESC-vonalak hasonló morfológiai jellemzőkkel, hasonló molekuláris azonosító markerekkel és az embriogenezis programok megvalósításához szinte azonos molekuláris mechanizmussal rendelkeznek, ami lehetővé teszi számunkra, hogy új szemszögből vizsgáljuk a xenotranszplantáció problémáját.

A normál in vivo embriogenezissel ellentétben az ESC-k in vitro proliferációja nem jár csíralemezek kialakulásával, és a homeotikus Hoxgének blokkolásának hátterében történik, azaz organogenezis nélkül. Mivel a szegmentációs gének nem működnek, lehetetlen reprodukálni az embriogenezis olyan időszakait, mint a szomiták lerakása, az embrió szegmentációja, a szikzacskó, az allantois és más ideiglenes szervek és szövetek kialakulása ESC-kultúrában. Úgy tűnik, hogy a tenyésztett ESC-k a specializált sejtek 350 restrikciós vonalának képződési folyamatának kezdetén fagytak meg. Így a lány progenitor sejtek klónja és a centrálisan lokalizált ESC csak egy embriómodellt képvisel, amelynek fejlődése során a specializált sejtek különböző vonalai egyidejűleg alakulnak ki különböző szöveti régiókban, amelyek azonban közös prekurzorokból származnak. Az ESC-k felszínén található receptorok minimális szintje ellenére megtartják a primitív morfogenetikus folyamatok végrehajtásának képességét, utánozva a korai embrió térfogati szerkezeteit: az ESC-k szuszpenziója a tenyészetaggregátumokban blasztocisztákra vagy akár későbbi embriókra (petesejt-hengerek) emlékeztető struktúrákat alkot. Az ilyen szuszpenziós aggregátumokat rendre egyszerű, illetve összetett embrioid testeknek nevezzük.

Vegyes differenciálódás esetén az ektoderma (oct3, fgf-5, nodális), az endoderma (gata-4), a mezoderma (brachyury), a kardiogén mezoderma (pkh-2.5), a velőcső (msx3) és a vérképzés (elkf) korai génjei egyidejűleg expresszálódnak egyazon embriótest különböző sejtjeiben. A növekedési faktorok és citokinek különböző kombinációinak in vitro célzott hatásával a csíralemez sejtek képződésére számos esetben sikerült olyan embriótesteket előállítani, amelyekben az ektoderma vagy a mezoderma génjei preferenciálisan expresszálódtak, ami megnyitja az utat a gasztruláció és az organogenezis kezdeti fázisainak modellezése előtt.

Az ESC-k klonális növekedése az aszimmetrikus sejtosztódás bizonyítéka, amelyben a klón közepén csak egy ESC rendelkezik korlátlan proliferációs potenciállal, míg a második leánysejt olyan progenitor sejtek generációját generálja, amelyek már differenciálódáson mennek keresztül. Ezért a klón proliferációs rátája az embrioid test perifériáján magasabb, mint a középpontban. A növekvő klón marginális sejtjei spontán rendezetlen differenciálódáson mennek keresztül, migrálnak, vagy apoptotikus mechanizmusok révén elpusztulnak. Ezek az események határozzák meg a klón sorsát: ha a proliferációs ráta meghaladja a migráció és az apoptotikus sejthalál sebességét, a klón mérete tovább növekszik, stabilizálódás következik be, amikor az apoptózis ráta és az új sejtek képződésének sebessége egyenlő, és regresszió következik be, amikor ezeknek a folyamatoknak az aránya fordított. A progenitor sejtek szimmetrikusan osztódnak, azaz mindkét leánysejt később érett, specializált sejtvonalakká differenciálódik. Az ESC-k és a progenitor sejtek aránya változó, de az ESC-k száma mindig csak a progenitor sejtpopuláció töredéke. Ezért csak a klónok gondos pipettázása és időben történő szétválasztása növelheti az ESC-k számát a tenyészetben. A klónok 10-12 sejtes stádiumban történő szétválasztása bizonyult a leghatékonyabbnak az ESC-k maximális hozamának eléréséhez. Az embrioid testben a sejtek differenciálódásának iránya és mértéke azok elhelyezkedésétől függ. Az embrioid test külső sejtjei nem expresszálják az oct4 gént, és az elsődleges endoderma sejtjeivé differenciálódnak, amelyekből később a parietális és zsigeri extraembrionális endoderma epiteliális-szerű sejtjei alakulnak ki. Az embrioid test belső sejtjei expresszálják az oct4 gént, és 48 órás tenyésztésig megőrzik pluripotenciájukat. A tenyészet azonban ezután morfológiailag átstrukturálódik egy epiteliális monoréteggé, és megkezdődik az elsődleges ektoderma fejlődését szabályozó gének expressziója. Ezután megkezdődik a teljes rendezetlen citodifferenciálódás folyamata, amely mindhárom csíralemezből származó különféle sejttípusok megjelenésével kezdődik. Az embrioid test sejtjeinek spontán differenciálódása során először a szikzacskó fragmentumainak (ciszták) formájában lévő endoderma markerekkel rendelkező aggregátumok jelennek meg. Ezután a növekvő kapillárisok angioblasztjai és endotélsejtjei jelennek meg ezekben a struktúrákban. A spontán differenciálódás utolsó szakaszában az embriótest belső sejtjeiből különféle terminálisan differenciált sejtek fejlődnek, beleértve a neuronokat, a gliaelemeket, a szívizomsejteket, a makrofágokat és az eritrocitákat. Bizonyos mértékig (figyelembe véve a germinális szövetrétegek kialakulásának térbeli inverzióját) az embriótestek segítségével in vitro vizsgálhatók a morfogenetikai folyamatok, és elemezhetők az embrionális citodifferenciálódás kezdeti időszakainak molekuláris mechanizmusai.valamint megállapítani az egyes gének szerepét e folyamatok megvalósításában.

Így a klónon belül vannak olyan sejtek, amelyekben különböző genetikai fejlődési programokat fedeztek fel - embrionális őssejtek (ESC-k), korai progenitorok és differenciálódó progenitor populációk. Az ESC-k függőcsepp vagy tömegkultúra módszerekkel történő tenyésztése táplálóréteg és LIF hozzáadása nélkül elkerülhetetlenül embrioid testek kialakulásához vezet. Az embrioid testek külső és belső rétegeinek sejtjeinek morfológiája eltérő. A külső réteg nagy, elágazó sejtekből áll. A környezet felé néző felületüket számos mikrobolyh borítja. A sejtek külső rétegét a belső rétegtől egy Reichert-membránra emlékeztető bazális membrán választja el, míg az embrioid testek belső rétegének sejtjei oszlopos hámsejtek. Morfológiailag a belső réteg, bár sok osztódó sejtet tartalmaz, inkább a differenciálatlan ESC-telepekre hasonlít.

Az emberi embrionális őssejtek jellemzői

A parenchimális-mezenchimális jelátviteli kölcsönhatások hiánya a homeózis gén blokkolásának hátterében az ESC-k rendezetlen növekedéséhez vezet a tenyészetben, mivel ez megzavarja az ideiglenes szervek infrastruktúrájának kialakulását és fejlődését. Az ESC-k rendezetlen növekedése és rendezetlen spontán differenciálódása a tenyészetben a jövőbeli szervek stromális vázának mezenchimális jelölődésének hiányából ered: in vitro teljesen lehetséges több millió hepatocita képződése, de lehetetlen egyetlen májlebenyke előállítása, amely olyan szerkezeti és funkcionális elemeket tartalmaz, mint az orrmelléküregek, a Disse-terek és a Kupffer-sejtek.

Úgy vélik, hogy az ESC-k pluripotenciája kizárólag az embriogenezis során, az embrió szöveteinek és szerveinek kialakulásával valósul meg, míg a méhlepény és a köldökzsinór a trofoblaszt származékai. A trophektodermális membránba zárt ESC-k egymást követően létrehozzák az ideiglenes sejtek klónjait, amelyek a Nohtejov-féle volumetrikus topográfiai mátrix kombinatorikus mRNS-én keresztül valósítják meg a fejlesztési programot, amely előre meghatározza az ideiglenes és végleges szervek térbeli elrendezését, alakját és méretét, sejtjeinek számát, valamint a parenchima szerkezeti és funkcionális egységekbe való összeszerelését. Ugyanakkor az ESC-k továbbra is az egyetlen olyan sejttípus, amelyben a potenciáljuk megvalósításának molekuláris mechanizmusa teljesen elszakad a genetikai fejlődési programtól, és maguk az ESC-k megfosztva vannak attól a képességtől, hogy más sejtekkel kölcsönhatásba lépjenek mind a receptorérzékelés, mind a transzjelző rendszerek blokkolása miatt. Az ESC-k megfelelő aktiválása azonban az embriogenezis programjának fokozatos fejlődéséhez vezet, amely egy teljesen kialakult, milliárdnyi sejtből álló, méhen kívüli életre kész szervezet születésével zárul. Ezen a rövid távú, de elképzelhetetlenül hosszú távú úton a sejttérben elkerülhetetlenül hibák merülnek fel mind a sejtek létfontosságú aktivitását biztosító molekuláris mechanizmusokban, mind a proliferációjukat, differenciálódásukat és specializációjukat szabályozó programokban. Ezért a modern farmakogenomikában a molekuláris szerkezet és a sejtprogramozás betegségeit külön kezelik. Ezenkívül a legtöbb új gyógyszer hatása a differenciálódás, a proliferáció és az organogenezis programjainak korrekciójára, valamint a szervek és szövetek regenerációjára irányul. Egy felnőtt szervezetben az ESC-k lehetővé teszik az agyba, májba, lépbe, csontvelőbe és más emberi szervekbe átültetett ős-/progenitor sejtek viselkedésének szabályozását a recipiens szerveinek sérült parenchymájának helyreállítása érdekében azáltal, hogy a donorsejteket a megőrzött mezenchimális mátrixon differenciálják és specializálják. Lényegében a totipotencia program a petesejt, a zigóta és a blasztomer genomok szintjén kezd megvalósulni; ezeket a sejteket azonban még nem klónozták és passzálták a kísérleti és gyakorlati orvoslás igényeihez szükséges mennyiségben. Ezért az ESC-k továbbra is egyedülálló genetikai információforrást jelentenek, amelyek kódokat tartalmaznak az embrió háromdimenziós térképéhez, valamint kódokat a specializált sejtvonalak lineáris korlátozásához a gasztruláció során.

Az ESC-k gyakorlatilag korlátlan regeneratív potenciálja annak köszönhető, hogy genomjuk, ellentétben a differenciált szomatikus sejtek genetikai apparátusával, megőrzi pluripotenciáját. Az ESC-kbe ágyazott genetikai információ szunnyadó állapotának egyik megnyilvánulása az úgynevezett minimális fenotípus - az ESC-k felszínén korlátozott számú receptor expresszálódik, és ennek megfelelően nagyon kevés transzjelátviteli program működik a sejt nukleáris apparátusának és a mikro-környezetének kölcsönhatására. A specializált sejtvonalak korlátozásáért és a sejtek differenciálódásának korlátozásáért felelős gének hibernálásának hátterében az 500 génből csak körülbelül 30 aktiválódik, amelyek termékei biztosítják a sejt kapcsolódását a környező mikro-környezettel. A génexpresszió sorozatanalízisének módszerével kimutatták, hogy a genom fő funkcionális dobozainak közös munkájával, amelyek szabályozzák az energetikát és az anyagcserét a szomatikus sejtekben és az ESC-kben, az utóbbiakban nagyon alacsony a receptorok, G-fehérjék, másodlagos hírvivők, transzkriptázok, expressziós és repressziós kofaktorok mRNS-szintje, azaz a szabályozó jel sejtbe történő transzmembrán átvitelének teljes rendszere. Ez a transzszignálozó gének hiányának vagy nagyon alacsony expressziójának köszönhető. Az ESC genomban indukált differenciálódás időszakában 18 működő gén szinkron módon leáll, miközben 61 transzszignálozó gén aktiválódik, amelyek a sejtadhéziós receptorok, az extracelluláris mátrix komponensei, a restrikciós transzkriptázok és a jelátviteli rendszer hírvivő elemeinek szintézisét szabályozzák a sejtplazmamembrán receptoraiból a nukleáris apparátusba. Ugyanakkor blokkolódik a csendesítő fehérjék szintéziséért felelős gének expressziója, valamint a génexpresszió koinhibitorai, amelyek biztosítják az ESC genom totipotenciáját.

Mindhárom csíralemez sejtjei esetében találtak génmarkereket. Az ektodermális sejtréteg azonosítását a nodális, az oct3 és az fgf-5 gének, a mezoderma sejtek azonosítását a brachyury, a zeta-globin gének, az endoderma azonosítását pedig a gata-4 gén expressziója végzi. Normális embriogenezis során a gasztrulációs időszakban az ős- és progenitor sejtek éretlen populációinak aktív migrációja figyelhető meg, amely lokálisan jelöli a koponya arccsontjainak, az agy egyes részeinek, a perifériás idegrendszernek, a szívvezetési rendszernek és a csecsemőmirigynek a fejlődési zónáit, amelyek szövetei a migráns sejtek klónjaiból képződnek. A sejtek jelölése a csíralemezek korai génjeivel megkönnyíti a prekurzor sejtek migrációs folyamatainak topográfiai elemzését a fejlődő embrióban. Megállapították különösen, hogy a P19 embriokarcinóma sejtek aggregátumaiban az első mezoderma gén brachyury expressziója a szöveti plazminogén aktivátor, az a-fetoprotein, a keratin 8 és a keratin 19 génjeinek csökkent expressziója alatt kezdődik, amelyek az első vándorló mezoderma populációk markerei. Következésképpen a mezodermális eredetű szövetek kialakulása csak a pontmigráció és a mezodermális progenitor sejtek szétszóródásának befejeződése után kezdődik.

A rendkívül korlátozott fenotípusos jellemzők és a legtöbb transzjelző egység hiánya ellenére az ESC-k továbbra is expresszálnak néhány receptormolekulát, amelyek felhasználhatók azonosításukhoz. Figyelemre méltó, hogy az ESC marker antigének emberekben és főemlősökben gyakorinak bizonyultak. Az ESC-jelöléshez leggyakrabban a membránhoz kötött SSEA-3, SSEA-4 (egyedi lipid antigének, amelyek a GL7 glikolipid és a szialinsav komplexét képviselik) elleni jelölt antitesteket, valamint a TRA-1-81, TRA-1-60 nagy polimertartalmú glikoproteinek ellen jelölt antitesteket használják. Ezenkívül az ESC-k expresszálják a specifikus embrionális SSEA-1 antigént és az endogén alkalikus foszfatázt, valamint a specifikus Oct4 transzkripciós faktort. Ez utóbbi szükséges az ESC-proliferáció mechanizmusainak fenntartásához - a specifikus Oct4 transzkripciós faktor aktiválja a fibroblaszt növekedési faktor 4 gén expresszióját, és stabilizálja az éretlen sejtekben a korlátlan DNS-replikációért felelős gének dobozának expresszióját. A legfontosabb intracelluláris marker fehérjék az Oct3, Oct4, Tcf és Groucho, amelyek a kromatin csendesítő fehérjékkel állnak rokonságban.

Szinte azonnal azután, hogy évekig tartó, a testen kívüli tenyésztésre irányuló kísérletek sikeresek voltak, és létrejöttek az egér blasztocisztákból izolált őssejtek első kultúrái, valamint az elsődleges csírasejtek kultúrái, megkezdődött az ESC-k pluripotens potenciáljának kutatása, amikor azokat a fejlődés korai szakaszában embriókba juttatták. Kimutatták, hogy a morula és a blasztociszta stádiumban az ESC-k képesek kiméra embriók létrehozására, amelyekben a donor ESC-k leszármazottai minden szomatikus szövetben, sőt az ivarsejtekben is kimutathatók. Így a fejlődésbiológiában az ESC-k segítségével „hidat” hoztak létre az in vivo és az in vitro kísérleti vizsgálatok között, ami jelentősen kibővítette az elsődleges szövetek és szervek lerakódási folyamatainak, differenciálódásuknak és embrionális organogenezisüknek a tanulmányozásának lehetőségeit.

Egyértelműen megállapították, hogy in vivo az embriogenezis során az embrionális őssejtek (ESC-k) beépülnek a korai embrió sejttömegébe, és származékaik minden szervben és szövetben megtalálhatók. Az ESC-k kolonizálják a kiméra embrió csírasejtvonalát, amelynek leszármazottai teljes értékű petesejteket és spermiumokat képeznek. Az embrionális őssejtek klonogén tulajdonságúak – egyetlen ESC képes genetikailag azonos, molekuláris markerekkel rendelkező sejtekből álló kolónia létrehozására, amelyek magukban foglalják az oct4 gén és az alkalikus foszfatáz expresszióját, a magas telomeráz aktivitást és bizonyos embrionális antigének expresszióját.

Az embriogenezis mechanizmusainak vizsgálatára ESC-k segítségével kidolgozták a morula kimerizációs módszerét egy biológiai konstrukció létrehozásával, amelyen kívül egy recipiens tetraploid blasztomer réteg található, és belül donor ESC-ket juttatnak be. Így a trofoblaszt a recipiens tetraploid blasztomerjeinek leszármazottaiból képződik, amely biztosítja a beágyazódást és a placentációt, és a donor ESC-k belső sejttömegként működnek, amelyből az életképes embrió teste és az elsődleges progenitor csírasejtek vonala képződik. Az ESC-k kutatási értéke nemcsak abban rejlik, hogy a genomjukkal végzett in vitro manipulációk során megőrzik a pluripotenciát, hanem abban is, hogy az ESC-k képesek részt venni a kiméra embrió primer csírasejtjeinek kialakulásában. Kimutatták, hogy egyetlen genetikailag módosított ESC leszármazottai benépesítik a kiméra embrió összes primer rudimentjét és fejlődő szövetét, amelyeket e sejt és egy 8-sejtes embrió aggregációjával vagy kokultivációjával nyernek. Amikor a zöld fluoreszcens fehérje génjével transzfektált ESC-ket egerek morulájába ültettek be, a sejt fluoreszcens leszármazottait megtalálták a fejlődő embrió összes vizsgált szövetében (Shimada, 1999). Az ESC-k morulába történő beültetése lehetővé teszi életképes egerek létrehozását, amelyek szervezete kizárólag a donor ESC leszármazottaiból áll, ami megnyitja a lehetőségeket a terápiás klónozásra. Ezt a módszertani megközelítést ma már sikeresen alkalmazzák a fejlődésbiológiai problémák tanulmányozására, különösen az X-kromoszóma genetikai inaktivációjának vagy az ESC-k epigenetikus instabilitásának mechanizmusainak elemzésére. Az ESC-k korai embrióba történő beültetését a mezőgazdasági biotechnológiában, valamint a génterápiás kísérletekben is alkalmazzák.

A genetikailag módosított embrionális őssejtek (ESC-k) transzplantációját mutáns gének célsejtjeinek tesztelésére használják. Az in vitro tenyésztett ESC-ket a biotechnológiában knockout egerek létrehozására használják. Erre a célra a vizsgálandó gént homológ rekombinációval (knockout) eltávolítják az ESC-kből, és az ezt a gént nem tartalmazó sejteket szelektív táptalajon izolálják. A knockout ESC-ket ezután a blasztocisztaba juttatják, vagy morula blasztomerekkel aggregálják. Az így kapott kiméra korai embriókat recipiens nőstényekbe ültetik át, és az újszülött egerek közül kiválasztják azokat az egyedeket, amelyek gamétái egy adott génre nullizigotaak. Ezt a technológiát számos knockout egérvonal létrehozására használták, amelyeket széles körben használnak a kísérleti biológiában és a kísérleti orvostudományban. Az ilyen biológiai modelleket bizonyos gének embrionális fejlődésben betöltött jelentőségének, valamint az emberi betegségek és kóros állapotok mechanizmusaiban betöltött szerepüknek tanulmányozására használják. Ezenkívül a knockout állatvonalakat új génterápiás módszerek preklinikai tesztelésében is alkalmazzák. Például egy mutáns gén normál alléljának az ESC genomba történő transzfektálásával hatékonyan korrigálható egy, a vérképző rendszert érintő mutáció. Az idegen gének bejuttatása az ESC-kbe lehetővé teszi homozigóta transzgénikus laboratóriumi állatvonalak gyors létrehozását. Meg kell azonban jegyezni, hogy a célzott rekombinációs géndeléció technikáját eddig csak egér ESC-kkel kapcsolatban fejlesztették ki megbízhatóan. Kettős knockout egér ESC-k segítségével megállapították a 7. kromoszómán található génklaszter régió (az emberi 19. kromoszómán található genomiális régió másolata) és a 11. kromoszóma proximális régiójának (az emberi 5g kromoszóma másolata) funkcionális szerepét - ezen gének deléciója egér ESC-kben lehetővé tette analógjaik funkciójának értékelését emberekben.

Az emberi embriogenezis génjeinek funkciójának tanulmányozásának lehetőségei kibővültek, amelyeknek laboratóriumi állatok ESC-inek genomjába történő transzfekciója lehetővé tette különösen a kriptogén szerepének tisztázását a kardiogén mezoderma, a pax-6 gén kialakulásában és fejlődésében a szem embriogenezisében. Összeállítják az egerek teratokarcinómájának és blasztocisztáinak éretlen, proliferáló ESC-iben lévő génexpresszió első térképeit, és megerősítették a transzjeladó gének szuppresszív represszióját az ESC-kben. 60-80 mutáns ESC és 20-30 normál preimplantációs egérembrió sejt kombinációja kiméra embriók kialakulásához vezet, amelyekben a szerv primordiumok donor és recipiens sejtekből állnak, ami lehetővé teszi ismeretlen gének szerepének tisztázását a gasztrulációban és az organogenezisben. A fejlődő egérembriók génjeinek funkcionális térképét kiegészítették az sf-1 gén szerepével a mellékvese és az ivarmirigyek kialakulásában, a wt-1 gén szerepével a vese kialakulásában, a myoD család génjeivel a vázizomzat kialakulásában, valamint a gata-1-4 család génjeivel az eritropoézis és limfopoézis rudimentumok restrikciós érésében.

Az ESC-kben található anyai és apai gének alléljeinek irányított kikapcsolása vektor rekombinázok segítségével lehetővé tette a különböző gének funkcióinak tisztázását az embriogenezis korai szakaszában, és az ismeretlen emberi gének egér ESC-kbe történő irányított átvitelének technológiája hozzájárul új mutáns gének felfedezéséhez, amelyek a súlyos örökletes patológia kialakulásáért felelősek. A knockout módszerrel meghatározták egyes gének kötelező jelentőségét az embrionális szövetek kialakulásában: gata-4 - a szívizomhoz, gata-1 - a hematopoietikus szövet eritroid vonalához, myoD - a vázizomzathoz, brachyury - a mezodermához, hnf3 és hnf4 restrikciós transzkriptázok - a máj őssejtekhez, rag-2 - a T- és B-limfocita klónok kialakulásához (Repin, 2001). Az ESC-kben lévő gének kettős deléciója megnyitotta a hozzáférést a csíralemez gének funkcionális szerepének, a szegmentációnak és a homeózisnak a tanulmányozásához, és az ESC-transzplantáció lehetővé tette életképes fajok közötti hibrid embriók előállítását. Egyetlen donor embrionális őssejt 8-sejtes embrióba történő átültetésének továbbfejlesztett technikájával bebizonyosodott a recipiens embrió számos szervének sejtszintű kimerizációja. Megjegyzendő, hogy emberi szöveti sejtcsírákat találtak a recipiens egerek szerveiben, miután emberi hematopoietikus őssejteket juttattak a blasztocisztájába. Megállapították, hogy a pluripotens ESC-k keringenek az egérembriók vérében a szervképződés időszakában. Lehetséges, hogy biológiai funkciójuk a jövőbeli immunrendszer embrionális szerveződésében rejlik. Az ESC-k segítségével laboratóriumi körülmények között reprodukálták az emberi genetikai patológia megfelelő modelljeit: a disztrofin gén kettős kiütése a Duchenne-izomdisztrófiát modellezi egerekben, és az atm gén (a kromatin szignál kináz szintézisének szabályozása) leállása - ataxia-telangektázia. Ebben a gyermekeknél jelentkező halálos örökletes betegségben a kisagy Purkinje-sejtjeinek degenerációja alakul ki a DNS-reparáció hibái miatt, amelyet a csecsemőmirigy involúciója kísér a proliferáló sejtek pusztulása miatt. Az ataxia-telangektázia klinikai képe, patofiziológiája és patomorfológiája, melyet a patológiás genetikai információk ESC-kbe juttatásával reprodukálnak, kiméra egerekben megfelel az emberekben tapasztaltaknak. Az ataxia-telangektázia mellett ESC-k és knockout egerek felhasználásával kísérleti modelleket fejlesztettek ki néhány örökletes homozigóta emberi betegségre, amelyek a szénhidrát- és lipid-anyagcsere patológiájával, az aminosav-katabolizmussal, valamint a réz- és bilirubin kiválasztással járnak, ami jelentősen kibővítette a kísérleti orvoslás képességeit a megfelelő emberi betegségek kezelésére szolgáló új módszerek preklinikai tesztelésének szakaszában.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Őssejt-citohibridek alkalmazása

Az ESC-k és a szomatikus sejtek fúziójával kapott hibrid sejtek megfelelő és ígéretes modellt jelentenek az őssejtek pluripotenciájának vizsgálatára és a differenciálódott sejtek kromoszómáinak újraprogramozására. Az ESC-k és egy felnőtt állat differenciálódott sejtjeinek fúziójával kapott citohibridek lehetővé teszik a különböző „korú” genomok közötti kapcsolatok tanulmányozását: egyedülálló helyzet áll elő, amikor a differenciálódás különböző szakaszaiban lévő és eltérő érettségi fokú sejtekből származó homológ kromoszómák ugyanabban a sejtmagban helyezkednek el, ahol könnyen kicserélhetik a transz-ható szabályozó jeleket. Nehéz megjósolni, hogy az egyedfejlődés során kialakult homológ kromoszómák ciszszabályozó epigenetikai rendszerei hogyan reagálnak az embrionális rokon genomokból kiinduló transz-ható jelek hatására. Ezenkívül a hibrid sejtekben a szülői kromoszómák szegregációja is bekövetkezik, ami lehetővé teszi a genomok kölcsönhatásának tanulmányozását az egyes kromoszómák szintjén, azaz potenciálisan azonosítani az egyes kromoszómák részvételét a pluripotencia fenntartásában, vagy éppen ellenkezőleg, a differenciálódásba való kilépésben.

A pluripotens teratokarcinóma és differenciált szomatikus sejtek fúziójával kapott citohibrideket használták első kísérleti modellként a különböző „fejlődési előzményekkel” rendelkező genomok kölcsönhatásának vizsgálatára. Bizonyos esetekben az ilyen hibrid sejtek meglehetősen magas szinten megőrizték pluripotens tulajdonságaikat. Különösen az in vivo teratokarcinóma-szomatikus hibrid sejtek indukálták mindhárom csíralemez származékait tartalmazó valódi teratómák fejlődését, és in vitro szuszpenziós tenyészetekben embrioid testeket képeztek. Még az ilyen típusú interspecifikus citohibridekben is megfigyelték az embrionális antigének jelenlétét azokban az esetekben, amikor a teratokarcinóma sejtekkel való fúzió szomatikus partnerei limfociták vagy timociták voltak. Figyelemre méltó, hogy a teratokarcinóma sejtek fibroblasztokkal való fúziójával létrehozott citohibridek fenotípusukban megfeleltek a fibroblasztoknak.

A legfontosabb megállapított tény, hogy a teratokarcinóma-szomatikus hibrid sejtekben a differenciált sejtgenom átprogramozásának jelei jelentek meg, amelyet az egyes gének vagy a szomatikus partner inaktív X kromoszómájának újraaktiválódása jellemzett. Így a teratokarcinóma-szomatikus sejttípusú citohibridekkel végzett vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a hibrid sejtekben gyakran megmarad a pluripotencia, és a szomatikus partner genomjának átprogramozásának jelei mutatkoznak.

Az intraspecifikus embrionális hibrid sejtek egér ESC-k és felnőtt lépsejtek fúziójával történő előállítására irányuló kísérletekben tanulmányozták az ilyen citohibridek jellemzőit, elemezték a szülői kromoszómák szegregációját, és értékelték a hibrid genom pluripotenciáját. A teratokarcinóma sejtek szomatikus sejtekkel történő fúziójával kapott intraspecifikus hibrid sejteket általában alacsony szintű kromoszóma-szegregáció jellemzi tetraploid vagy közel tetraploid kariotípussal. Hasonló kromoszóma-összetételt figyeltek meg a citohibridekben az elsődleges csírasejtek limfocitákkal történő fúziója során. Ugyanakkor az egér teratokarcinóma sejtek nerc limfocitákkal történő fúziójával kapott interspecifikus hibrid sejtek a szomatikus partner kromoszómáinak intenzív szegregációját mutatták.

A szülői kromoszómák szegregációjának vizsgálatában a fajon belüli hibridekben kvalitatívan új szakasz kezdődött a mikroszatellitek polimeráz láncreakcióval történő elemzésére szolgáló módszer kidolgozása után, amelynek köszönhetően minden egérkromoszómára több száz markert találtak, lehetővé téve a hibrid sejtekben bármely homológ kromoszómapár megbízható megkülönböztetését.

Az ESC-k (hipoxantin-foszforiboziltranszferáz aktivitásban hiányos HM-1 sejtek, 2n = 40, XY, 129/01a egerek blasztocisztáiból izolálva) és a kongenikus DD/c egerek lépsejtjeinek fúziójával lehetővé vált az ESC-khez morfológiailag hasonló hibrid klónok előállítására. Minden klónt szelektív táptalajon izoláltak, amelyben csak az aktív hipoxantin-foszforiboziltranszferázzal rendelkező sejtek tudnak növekedni. Az elektroforetikus analízis kimutatta, hogy minden klón a DD/c egerekre jellemző hipoxantin-foszforiboziltranszferáz allélvariánssal rendelkezett. A citogenetikai analízis kimutatta, hogy a négy hibrid klón közül három közel diploid kromoszómakészlettel rendelkezett. Egy közel tetraploid klón két hibrid sejtpopulációt tartalmazott, amelyek közül az egyik tetraploid, a második, kisebb pedig diploid volt.

A mikroszatellit analízis, amely lehetővé teszi a 129/01a és DD/c egerek bármely homológ kromoszómapárjának megkülönböztetését közel diploid készlettel rendelkező hibrid klónokban, kimutatta, hogy két klónban a szomatikus partner autoszómáinak egyértelmű preferenciális eliminációja volt megfigyelhető. A HESS2 és HESS3 klónok legtöbb autoszómájában a 129/01a vonal, azaz a pluripotens partner markerei voltak jelen. Kivételt képeztek az 1. és I. kromoszóma: a HESS2 és HESS3 klónokban a HM-1 sejtek markerei mellett kis mennyiségben a szomatikus partner markerei is jelen voltak. Az ilyen eredmények a szomatikus partner 1. és I. kromoszómájának hiányos szegregációját tükrözhetik, és összhangban vannak a citogenetikai adatokkal, amelyek szerint ezen kromoszómák triszómiája a HESS2 és HESS3 klónok sejtjeinek 30-40%-ában figyelhető meg. A HESS4 klón kromoszóma-összetételében jelentősen eltért: ebben a klónban számos autoszóma az ESC genomból származott (2., 3., 4., 5., 6., 7., 10., 13., 14. és 17. kromoszóma), de az 1., 9., 11., 12., 15., 16., 18. és 19. kromoszómákat mindkét szülő homológjai képviselték. Az ezeket a homológ kromoszómákat jelölő mikroszatellitek mennyiségi aránya körülbelül 1:1 volt. Ez lehetővé tette a szerzők számára annak feltételezését, hogy az egyik homológ az ESC genomból, a másik pedig differenciálódott sejtekből származik. A HESS4 klón egyes szubklónjaiban csak a szomatikus partner 18. és 19. kromoszómájának markerei voltak jelen. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a HESS4 klón sejtjeiben a szomatikus partner kromoszómáinak szegregációja mellett a pluripotens genom fent felsorolt kromoszómáinak egyik vagy mindkét homológjának eliminációja is bekövetkezett, azaz mindkét szülő kromoszómáinak kétoldali szegregációja történt - ez egy nagyon szokatlan jelenség, mivel a citohibridekre jellemző, hogy csak az egyik szülő kromoszómái szegregálódtak.

Ezenkívül a 20. passzázs után a hibrid sejtek összes klónja már csak a szomatikus partner X kromoszómájának markereit tartalmazta, azaz az ESC X kromoszómáját a klónokban a szomatikus partner X kromoszómája helyettesítette. Ezt a fontos tényt az egér X kromoszómájára specifikus FITC-vel jelölt próbával végzett in situ hibridizációs adatok is megerősítik: pozitív jelet csak egy kromoszómán detektáltak. Meg kell jegyezni, hogy a tenyésztés korábbi szakaszaiban (a 15. passzázs előtt) a citogenetikai adatok szerint sok sejt két X kromoszómát tartalmazott. Ezért a szelektív táptalajok használata lehetővé teszi a hibrid sejtek kromoszómális összetételének manipulálását és a szomatikus partner egyetlen kromoszómáját hordozó klónok szelektív kiválasztását az ESC genom hátterében.

Mivel a citohibrid genom egyedülálló jellemzője a szülői genomok egyetlen sejtmagban való lokalizációja, természetesen felmerül a kérdés az embrionális genom pluripotens tulajdonságainak megőrzéséről az ESC-szomatikus sejthibridekben, a differenciált sejt genomjával való szoros kapcsolat körülményei között. Morfológiailag az ESC-k és a szomatikus sejtek citohibridjei hasonlóak voltak a szülői ESC-vonalhoz. A pluripotencia értékelése azt mutatta, hogy minden közel diploid kromoszómakészlettel rendelkező klón képes volt embrioid testek létrehozására szuszpenziós tenyészetekben, amelyekben három csíralemez származékai voltak jelen.

A legtöbb hibrid sejt tartalmazta az ECMA-7 antigént, a korai egérembriókra jellemző markert, és magas alkalikus foszfatáz aktivitással is rendelkezett. A hibrid sejtek magas pluripotens tulajdonságaira vonatkozó legmeggyőzőbb adatokat a HESS2 klón hibrid sejtjeit magában foglaló injekciós kimérák sorozatának előállítására irányuló kísérletek során kaptuk. A biokémiai markerek elemzése azt mutatta, hogy a donor hibrid sejtek leszármazottai a kimérák legtöbb szövetében jelen voltak. Ezért az ESC-k és a szomatikus differenciált sejtek fúziójával kapott hibrid sejtek magas szinten megtartják a pluripotenciát, beleértve a kimérák képzésének képességét is, amikor a blasztociszta üregébe injektálják őket.

A HESS2 és HESS4 klónok szignifikánsan különböztek a szülői kromoszómák összetételében, de hasonló pluripotens tulajdonságokkal rendelkeztek. Feltételezhető lenne, hogy a pluripotencia a hibrid genomban domináns tulajdonságként nyilvánul meg, de lehetséges, hogy az embrionális genom nem minden kromoszómája vesz részt a pluripotencia fenntartásának folyamatában. Ha ez a feltételezés helyes, akkor várható, hogy a pluripotens partner egyes kromoszómáinak eltávolítása a hibrid sejtek genomjából nem jár együtt a pluripotens státuszuk megváltozásával. Ebben az esetben a szülői kromoszómák szegregációjának elemzése az embrionális hibrid sejtekben lehetővé tenné számunkra, hogy közelebbről megvizsgáljuk az embrionális sejtek pluripotenciájának szabályozásáért felelős kromoszómák azonosítását.

O. Serov és munkatársai (2001) nem találtak utódokat az 50 olyan utód között, akiket kimérák és normál egerek keresztezésével kaptak, amelyek 129/01a egér genotípussal rendelkeztek és a DD egerek X kromoszómáját hordozták. A szerzők úgy vélik, hogy ez a hibrid sejtek pluripotenciájának csökkenésének köszönhető a szomatikus genom hatására. Alternatív magyarázat lehet a triszómia negatív hatása egyes autoszómákra és a nemi kromoszómák egyensúlyhiánya (XXY kromoszómákat figyeltek meg a sejtekben a 15. passzázsig) a hibrid sejtekben a meiózis során. Ismert, hogy az XXY sejtek nem képesek meiózison átesni és ivarsejteket képezni. A triszómia a hibrid sejtek proliferatív aktivitásának csökkenését is okozhatja, aminek következtében a kimérák fejlődésében a szelekciós előny a recipiens embrió sejtjeihez tartozhat. Ebből következik, hogy a hibrid sejtek pluripotens potenciáljának megfelelő felméréséhez normál diploid kromoszómakészlettel rendelkező hibrid klónokat kell előállítani.

O. Serov és munkatársai (2001) kísérleteiben elsőként igazolták a szomatikus sejt X kromoszómájának újraprogramozásának lehetőségét a hibrid sejtek genomjában. A szerzők ezen következtetése a hprt gén (egy X kromoszóma marker) kimérákban történő expressziójának elemzéséből következik: a DD/c egerek hprt allélikus variánsának jelenlétét minden elemzett kiméra szövetben kimutatták. Fontos hangsúlyozni, hogy a hibrid sejtek blasztociszta üregébe történő bejuttatása után a citohibridek nem szelektív körülményekbe kerülnek, és az X kromoszóma megőrzése a hibrid sejtek genomjában azt jelenti, hogy az obligát komponensévé vált, és a genom nem különbözteti meg a pluripotens partner Y kromoszómájától.

Összefoglalva a szomatikus és pluripotens genomok hibrid embrionális sejtekben való kölcsönhatásának elemzésének eredményeit, a szerzők arra a következtetésre jutnak, hogy egyes citohibridekben a pluripotencia domináns tulajdonságként nyilvánul meg. A hibrid genom képes a differenciálódott sejtek egyes kromoszómáinak átprogramozására, ami azonban nem zárja ki a szomatikus genomnak az embrionális genom pluripotenciájára gyakorolt fordított hatásának lehetőségét. Hibrid sejtek tenyésztésekor a differenciálódás indukciója lényegesen gyakrabban fordul elő, mint az ESC-k eredeti HM-1 szülői vonalában. Hasonló hatás figyelhető meg az elsődleges telepek kialakulása során: az embrionális hibrid sejtek számos elsődleges telepe a kialakulás korai szakaszában differenciálódik, a szelekciójuk és szaporodásuk során nagy klónveszteséggel.

Így az ESC-k és a szomatikus sejtek fúziójával létrehozott citohibridek – a differenciált sejtek genomjával való szoros kapcsolat ellenére – megőrzik a pluripotenciát, mint az embrionális genom egyedi tulajdonságát. Ezenkívül az ilyen hibrid sejtekben a differenciált sejtekből származó egyes kromoszómák átprogramozása is lehetséges. Továbbra sem világos, hogy a hibrid sejtekben milyen mértékben maradnak meg az embrionális genom pluripotens tulajdonságai, különösen a kimérákban a csíravonal kialakításában való részvétel képessége. Ehhez normális kariotípusú embrionális hibrid sejtekre van szükség. Mindenesetre a pluripotens embrionális hibrid sejtek valódi genetikai modellé válhatnak a pluripotencia fenntartásában vagy szabályozásában részt vevő kromoszómák azonosítására, mivel a szülői kromoszómák kétoldali szegregációja potenciálisan ilyen lehetőséget kínál.

Nem kevésbé vonzó annak a jelenségnek a tanulmányozása, amelyet O. Serov és munkatársai (2001) „kromoszómális memóriaként” definiálnak. A hibrid genomban a homológ kromoszómák két alternatív konfigurációban vannak: a szomatikus partner homológjai egyszer már differenciálódtak, míg a pluripotens partner homológjaiban ez a folyamat csak most kezdődik. Következésképpen a hibrid sejtek általi nagy pluripotens tulajdonságok megőrzése azt jelzi, hogy az ESC homológok „pluripotens” konfigurációja kellően stabil a hibrid genomban, a szomatikus partnerből kiinduló transzakáló faktorok hatása ellenére. A differenciált genom homológ kromoszómáinak a kimérák fejlődése során történő átprogramozásának fent leírt jelei nem zárják ki annak lehetőségét, hogy a citohibridek in vitro kialakulásának és tenyésztésének első szakaszaiban megtartják az in vivo differenciálódás során szerzett státuszukat. A nemrégiben szerzett adatok szerint, amikor az embrionális hibrid sejteket nem szelektív környezetbe helyezik át, csak a szomatikus partner kromoszómáinak intenzív eliminációját mutatják, azaz a hibrid sejtek genomja könnyen megkülönbözteti a homológokat 10-15 passzázs in vitro tenyésztés után. Így az embrionális hibrid sejtek ígéretes kísérleti modellt jelentenek nemcsak az embrionális genom olyan alapvető tulajdonságának, mint a pluripotencia, hanem alternatívájának, az embrionális differenciálódásnak a tanulmányozására is.

Az embrionális őssejt-transzplantáció terápiás hatékonysága

Mielőtt elemeznénk az ESC-k és származékaik transzplantációjának terápiás hatékonyságát, összefoglaljuk a fenti anyagokat. Az ESC-k képességei az embriogenezis in vitro teljes körű megvalósítása szempontjából nem elegendőek, mivel a fejlődési rendellenességek ebben az esetben a mezenchimális őssejtek hiányának köszönhetők, amelyek a szervezetben autonóm módon és az ESC-ktől függetlenül keletkeznek. Az ESC-k genetikai potenciálja kisebb, mint a zigóta genetikai potenciálja, ezért az ESC-ket nem használják közvetlenül embriók klónozására. Az ESC-k egyedülálló biológiai potenciálját, mint az egyetlen olyan sejttípust, amelyben a fejlesztési programok teljes mértékben és következetesen megvalósulnak, a génfunkciók vizsgálatában használják fel. Az ESC-k segítségével dekódolják a három csíralemez fejlődését kódoló korai és késői gének expresszióját aktiváló jelkombinációkat. Az ESC-genom pluripotenciájának in vitro megőrzése egyedülálló eszközzé teszi őket a reparatív regenerációhoz, képesek automatikusan pótolni a sejtveszteségeket szervek és szövetek károsodása esetén. Ideális hipotetikus forgatókönyv szerint feltételezhető, hogy „...a donor ESC-k átültetése során kompakt módon csomagolt programok kerülnek át a recipiens testébe, amelyek kedvező körülmények között új szövetek felépítésében valósulnak meg”7, amelyek képesek „...hatékonyan integrálódni a recipiens testébe mind morfológiai, mind funkcionális szinten”.

Természetesen az ESC-k monodifferenciálódási módszereinek kidolgozását követően megkezdődött az egyetlen specializált klónból in vitro nyert sejtek funkcionális aktivitásának in vivo vizsgálata. Egy proliferáló ESC-klón migráló progenitor sejtek populációit hozza létre, amelyek valóban képesek aktívan integrálódni a recipiens szövetkárosodás területeibe, amit a regeneratív-plasztikai gyógyászatban alkalmaznak. Megállapították, hogy a DOPA neuronok substantia nigrába történő átültetése csökkenti a klinikai tüneteket a kísérleti hemiparkinsonizmusban. A donor idegi őssejtek regionális átültetése csökkenti a gerincvelő és az agy traumája vagy zúzódása által okozott motoros zavarok mértékét. A demyelinizációs betegségekben végzett őssejt-transzplantáció első pozitív eredményeit is megkapták. Úgy tűnik, hogy az ESC-k regeneratív-plasztikus potenciálja korlátlan lehetőségeket nyit meg a sejttranszplantáció gyakorlati orvoslásban való alkalmazására. Azonban, ha ektopikus zónákba ültetik át, az ESC-k elkerülhetetlenül tumorokká alakulnak. Teratómák alakulnak ki, amikor az ESC-ket szubkután injekciózzák immunhiányos egerekbe. Amikor szingén egerekbe ESC-szuszpenziókat ültetnek a here tokja alá, teratómák is képződnek, amelyek különböző szövetekből állnak, és amelyek sejtjei mindhárom csíralemez származékai. Az ilyen teratómákban a redukált organogenezis folyamatai rendkívül ritkák.

Számos tanulmány szolgáltat információt a korai ESC-származékok kísérleti patológiájú állatokba történő átültetésének pozitív eredményeiről. Az ESC-származékokat alkalmazó sejtes neurotranszplantációt továbbfejlesztik kísérletekben és az első klinikai vizsgálatokban az agy- és gerincvelői sérülések funkcionális zavarainak korrigálására, valamint a syringomyelia és a sclerosis multiplex kezelésére (Repin, 2001). Az ESC-kből történő in vitro neurogenezis technikájának megjelenésével az embrionális agyszövet helyett módszereket fejlesztenek az embrionális idegszövet-tenyészetekből származó neuroszféra-származékok átültetésére. Az ilyen transzplantációs szuszpenziók lényegesen homogénebbek, és elkötelezett neuron- és neuroglia-prekurzorokat tartalmaznak.

A táptalajhoz 6 héten át rendszeresen, 10 μg/ml dózisban retinolsav adagolásával a posztmitotikus neuronok több mint 80%-a képződik az NTERA-2 humán embrió-(terato)karcinóma sejtvonalban. A neuronális populáció teljes homogenitását az immunfenotípusos markerekkel jelölt érett neuronok áramlási szortírozásával érik el, ami lehetővé teszi a teratokarcinóma és az éretlen sejtek maradványainak eltávolítását. Kísérleti állatok agyának különböző régióiba történő átültetés után az ilyen neuronok nemcsak túlélnek, hanem integrálódnak a regionális neurális hálózatokba is. A lokális központi idegrendszeri defektusok kísérleti modelljeivel rendelkező állatokban a neurotranszplantáció csökkenti az olyan emberi patológiák klinikai megnyilvánulásait, mint a traumás agysérülés, a stroke, a demielinizációs betegségek, a kisagy fejlődésének örökletes rendellenességei, valamint a lipid- és poliszacharid-lerakódási betegségek.

A központi idegrendszer degeneratív betegségeiben a regenerációs folyamatok optimalizálása érdekében technológiákat fejlesztenek ki mielintermelő oligodendrociták kinyerésére élő őssejtekből (ESC-k). Az első szakasz hagyományosan az ESC-k proliferációját foglalja magában a transzplantációhoz szükséges sejtszám reprodukálásával. A második szakaszban a sejtek célzott differenciálódása történik mielintermelő oligodendrocita prekurzorok populációjává, amelyet szelektív marker antigének szabályoznak.

Bizonyos lehetőségek nyílnak az ESC-származékok felhasználására a csecsemőmirigy érésében bekövetkező genetikai hibák által okozott immunhiányosságok korrigálására szolgáló módszerek fejlesztésében. Az indukált génhibával – a TCR-gének V(D)J lókuszainak rekombinációs mechanizmusának zavarával, ami a T-limfocita-funkció elvesztéséhez vezet – rendelkező knockout (rag 1) egereken végzett vizsgálatokban a korai ESC-származékok állatok csecsemőmirigyébe történő átültetése helyreállítja a sejtes immunitásért felelős normál immunklónok populációinak érését. Folyamatban vannak az in vitro előformált ESC-k átültetésének klinikai vizsgálatai gyermekek halálos örökletes anémiáinak kezelésére.

Az őssejt-transzplantáció gyors klinikai bevezetésével szembeni kifogások az emberi embrionális őssejtek stabil vonalainak korlátozott számán és szabványosításuk szükségességén alapulnak. A standardizált ESC-vonalak, valamint a felnőtt emberi őssejtek tisztaságának növelése érdekében a rövid tandem DNS-ismétlődések molekuláris genetikai elemzésén alapuló vonalszelekciós módszer alkalmazását javasolják. Szükséges az ESC-vonalak vizsgálata is kis kromoszóma-átrendeződések és genetikai mutációk jelenlétére, amelyek sejtkultúra-körülmények között történő előfordulásának valószínűsége meglehetősen magas. Tézis született az összes ESC és regionális pluripotens őssejt tulajdonságainak kötelező vizsgálatáról, mivel in vitro szaporodásuk olyan új jellemzők megjelenéséhez vezethet, amelyek nem jellemzőek az embrionális őssejtekre vagy a definitív szövetekre. Különösen azt feltételezik, hogy a citokineket tartalmazó táptalajon történő hosszú távú tenyésztés közelebb hozza az ESC-vonalakat a tumorsejtekhez, mivel hasonló változásokon mennek keresztül a sejtciklus-szabályozás útjaiban, miközben korlátlan számú sejtosztódást képesek végrehajtani. Egyes szerzők a tumorfejlődés lehetőségére alapozva a korai embrionális őssejt-származékok emberbe történő átültetését meggondolatlannak tartják. Véleményük szerint sokkal biztonságosabb az ESC-k elkötelezett leszármazottait, azaz a differenciálódott sejtprogenitor vonalakat használni. Jelenleg azonban még nem fejlesztettek ki megbízható technikát a kívánt irányba differenciálódó stabil emberi sejtvonalak előállítására.

Így egyre több adat jelenik meg az irodalomban az emberi embrionális őssejt-származékok transzplantációjának pozitív terápiás hatásáról. Ezen tanulmányok közül sokat azonban felülvizsgálnak és kritizálnak. Egyes kutatók úgy vélik, hogy a korai klinikai vizsgálatok eredményei előzetes jellegűek, és csak azt jelzik, hogy az őssejtek képesek kedvező hatást gyakorolni egy adott betegség klinikai lefolyására. Ezért szükséges adatokat szerezni a sejttranszplantáció távoli eredményeiről. Érvként a klinikai neurotranszplantológia fejlődési szakaszait hozzák fel. Valójában eleinte a Parkinson-kórban az embrionális agytöredékek transzplantációjának magas hatékonyságáról szóló publikációk voltak túlsúlyban az irodalomban, de aztán elkezdtek megjelenni olyan jelentések, amelyek tagadták a betegek agyába átültetett embrionális vagy magzati idegszövet terápiás hatékonyságát.

Az első klinikai vizsgálatokat az NTERA-2 teratokarcinóma ESC-kből származó neuroblasztok transzplantációjának biztonságosságának felmérésére végezték, amelyek éretlen sejtjeit tenyészetben szaporították, amíg 100 millió sejttömeget nem értek el. Az így kapott sejtek egy részét a fenotípus jellemzésére és a sejtes szennyeződések meghatározására, valamint a vírusokkal és baktériumokkal való esetleges szennyeződés vizsgálatára használták. A LIF-et és a magzati stromális sejtek tápláló rétegét eltávolították a táptalajból, és feltételeket teremtettek az ESC-k neuroblasztokká történő célzott differenciálódásához citokinek és növekedési faktorok kombinációjának felhasználásával. Ezután a neuroblasztokat az éretlen teratokarcinóma sejtekből áramlási sejtszortírozón tisztították meg. A transzplantált sejtek másodlagos tisztítása és fenotípus jellemzése után a betegek agyának bazális magjába (a vérzéses stroke utáni hetedik hónapban) neuroblaszt szuszpenziót (10-12 millió) injektáltak speciális mikrokanül és fecskendő segítségével sztereotaxiás és komputertomográfiai kontroll alatt. A stroke zónájába történő neurontranszplantáció következményeinek transzplantáció utáni egyéves szűrése nem mutatott ki semmilyen mellékhatást vagy nemkívánatos hatást. A betegek fele a transzplantációt követő 6-12 hónapban javulást mutatott a motoros funkciókban. A pozitív klinikai változásokat a sejtátültetés utáni stroke zónában fokozott vérellátás kísérte: a fluoreszcensen jelölt 2-dezoxiglükóz felszívódásának átlagos növekedése a pozitronemissziós tomográfia szerint elérte a 18%-ot, egyes betegeknél pedig a 35%-ot.

Az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézetei (National Institutes of Health) azonban független vizsgálatot végzett a neurotranszplantáció klinikai hatékonyságáról Parkinson-kóros betegeknél. Az első csoportba tartozó betegek dopamint termelő embrionális idegszövet-szakaszokat kaptak transzplantációval, míg a második csoportba tartozó betegek álműtéten estek át. Az eredmények a neurotranszplantáció nulla klinikai hatékonyságát mutatják, annak ellenére, hogy a dopamint termelő embrionális idegsejtek túlélték a recipiensek agyát. Ezenkívül az embrionális idegszövet átültetése után 2 évvel a betegek 15%-ánál tartós diszkinézia alakult ki, amely a placebo csoportban lévő betegeknél hiányzott (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). A betegség további fejlődésének megfigyelései ezeknél a betegeknél folyamatban vannak.

Egyes szerzők a neurotranszplantáció klinikai hatékonyságának értékelésével kapcsolatos ellentmondásos irodalmi adatokat a betegcsoportok kiválasztásának eltérő megközelítéseivel, az állapotuk objektív értékelésére szolgáló módszerek nem megfelelő megválasztásával, és ami a legfontosabb, az embrionális idegszövet fejlődésének eltérő időszakaival és az agy különböző területeivel, amelyekből ezt a szövetet nyerték, a transzplantáció eltérő méreteivel és a sebészeti beavatkozás módszertani jellemzőivel társítják.

Meg kell jegyezni, hogy a pluripotens embrionális őssejtek kísérleti hemiparkinsonizmusban szenvedő patkányok agyának striatum régiójába történő közvetlen átültetésére tett kísérletek az embrionális őssejtek (ESC-k) proliferációjával és dopaminerg neuronokká történő differenciálódásával jártak. Feltételezhető, hogy az újonnan képződött neuronok hatékonyan integrálódtak a neurális hálózatokba, mivel az ESC-transzplantáció után a viselkedési rendellenességek és a motoros aszimmetria korrekcióját figyelték meg az apomorfin tesztben. Ugyanakkor néhány állat elpusztult az átültetett ESC-k agydaganatokká történő átalakulása miatt.

Az USA Nemzeti és Orvosi Akadémiájának szakértői, az USA Nemzeti Egészségügyi Intézetének szakemberei úgy vélik, hogy az ESC-k klinikai potenciálja komoly figyelmet érdemel, de ragaszkodnak ahhoz, hogy részletesen tanulmányozni kell tulajdonságaikat, a szövődmények valószínűségét és a hosszú távú következményeket az emberi betegségek megfelelő biológiai modelljein végzett kísérletekben (Őssejtek és a regeneratív orvoslás jövője, National Academy Press.; Őssejtek és a jövőbeli kutatási irányok, Nat. Inst, of Health USA).

Ebből a szempontból fontos, hogy a herébe ültetett ESC-szuszpenzióval kapott kísérleti teratómák összehasonlító szövettani elemzése kimutatta, hogy az ESC-k, származási forrásuktól vagy bizonyos környező sejtekkel való kölcsönhatásuktól függetlenül, ugyanúgy fejtik ki tumorképző potenciáljukat. Bizonyított, hogy az ilyen teratómák klonális eredetűek, mivel mindhárom csíralemez származékaiból álló tumorok egyetlen ESC-ből is kiindulhatnak (Rega, 2001). Figyelemre méltó, hogy amikor normál kariotípusú klónozott ESC-ket transzplantáltak immunhiányos egerekbe, különböző típusú differenciált szomatikus sejtekből álló teratómák is kialakultak. Ezek a kísérleti adatok a teratómák klonális eredetének kifogástalan bizonyítékai. A fejlődésbiológia szempontjából azt jelzik, hogy nem több elkötelezett progenitor sejt, hanem egyetlen pluripotens őssejt működik a teratómát alkotó mindhárom csíralemez differenciált származékainak forrásaként. A gyakorlati sejtátültetés felé vezető úton azonban ezeknek a tanulmányoknak az eredményei, ha nem is tiltóak, akkor a potenciális veszély figyelmeztető jelei, mivel az őssejtek (ESC-k) vagy primordiális csírasejtek beoltása felnőtt immunhiányos egerek különböző szöveteibe elkerülhetetlenül daganatok kialakulását okozza az átültetett őssejtekből. Az ektopikusan átültetett ESC-k neoplasztikus degenerációját a differenciált sejtek szatellit populációinak megjelenése kíséri - az ESC-k és a progenitor klónok specializált vonalakká történő részleges differenciálódása miatt. Érdekes módon, amikor az ESC-ket vázizomzatba ültetik át, a neuronok leggyakrabban a teratokarcinóma sejtek mellett képződnek. Az ESC-knek az osztódó petesejtbe vagy blasztocisztába történő bejuttatása azonban a sejtek embrióba való teljes integrációjával jár, neoplasztikus elemek kialakulása nélkül. Ebben az esetben az ESC-k az embrió gyakorlatilag minden szervébe és szövetébe beépülnek, beleértve a nemi szervek primordiumát is. Az ilyen allofén állatokat először úgy nyerték, hogy teratokarcinóma 129 sejteket juttattak be korai embriókba a 8-100 sejtes stádiumban. Allofén egerekben a donor ESC-kből származó heterogén sejtpopulációk integrálódnak a csontvelő, a belek, a bőr, a máj és a nemi szervek szöveteibe, ami lehetővé teszi akár fajok közötti sejtkimérák létrehozását a kísérletben. Minél rövidebb a korai embrió fejlődési ideje, annál nagyobb a sejtkimerizáció százalékos aránya, a legmagasabb kimerizációs fok az allofén embrió hematopoietikus rendszerében, bőrében, idegrendszerében, májában és vékonybelében figyelhető meg. Egy felnőtt szervezetben a recipiens immunrendszerétől hisztohematikus gátak által védett szövetek érzékenyek a kimerizációra:Az elsődleges csírasejtek here parenchymába történő átültetését a donor őssejtek beépülése kíséri a recipiens csíraszöveti rétegébe. Azonban, amikor az ESC-ket blasztocisztába ültetik át, a nemi szervek kiméra rudimentjeinek kialakulása a donor elsődleges csírasejtek keletkezésével nem következik be. Az ESC-k pluripotenciája, ha speciális feltételeket teremtenek, klónozásra is felhasználható: az egér ESC-k 8-16 sejtes egérembrióba történő átültetése, amelyben a sejtes mitózisokat citokalzin blokkolja, elősegíti a normális embriogenezis megvalósulását a donor ESC-kből származó embrió fejlődésével.

Ezért az allogén ESC-transzplantáció alternatívája a terápiás klónozás, amely a szomatikus sejtmagok magvak eltávolított petesejtbe történő átültetésére épül, hogy blasztocisztát hozzanak létre, amelynek belső sejttömegéből aztán a szomatikus sejtmag donorával genetikailag azonos ESC-vonalakat izolálják. Technikailag ez az ötlet meglehetősen megvalósítható, mivel a szomatikus sejtmagok magvak eltávolított petesejtekbe történő átültetése után kapott blasztocisztákból ESC-vonalak létrehozásának lehetőségét ismételten bizonyították laboratóriumi állatkísérletekben (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Különösen a rag2 génmutációra homozigóta egerekben a szubepidermális szövetsejtek tenyésztésével kapott fibroblasztokat használták sejtmag-donorként, amelyeket magvak eltávolított petesejtekbe ültettek át. A petesejt aktiválása után a „zigótát” a blasztociszta kialakulásáig tenyésztették, amelynek belső sejttömegéből ESC-ket izoláltak, és a mutáns génre (rag2~/~) nullzigóta sejtvonalba vitték át. Az ilyen ESC-kben az egyik allélgén mutációját homológ rekombináció módszerével korrigálták. Az első kísérletsorozatban rekombináns helyreállított génnel rendelkező ESC-kből embriótesteket nyertek ki, sejtjeiket rekombináns retrovírussal (HoxB4i/GFP) transzfektálták, majd szaporítás után rag2~/~ egerek vénájába injektálták. A második sorozatban tetraploid blasztomereket aggregáltak genetikailag módosított ESC-kkel, és recipiens nőstényekbe transzplantálták. A kapott immunkompetens egerek csontvelő donorként szolgáltak a rag2~/~ mutáns egerekbe történő transzplantációhoz. Mindkét sorozatban pozitív volt az eredmény: 3-4 hét elteltével minden egérben érett, normális myeloid és limfoid sejteket találtak, amelyek képesek immunglobulinok termelésére. Így a szomatikus sejtmagok petesejtekbe történő átültetése nemcsak ESC-vonalak kinyerésére, hanem citogenoterápiára - örökletes rendellenességek korrekciójára - is alkalmazható, az ESC-t vektorként használva a korrekciós genetikai információ transzportjához. De a sejtátültetésnek ez az iránya a bioetikai problémák mellett korlátokkal is rendelkezik. Nem világos, hogy mennyire biztonságos egy adott beteg genotípusával azonos genotípusú, terápiásán klónozott sejtek átültetése, mivel az ilyen sejtek olyan mutációkat hozhatnak létre, amelyek hajlamot teremtenek más betegségekre. A normál emberi petesejtek továbbra is nehezen hozzáférhetőek, míg még a szomatikus sejtmagok eltávolított állati petesejtekbe történő átültetésével is a létrehozott „zigótáknak” csak 15-25%-a fejlődik blasztociszta stádiumba. Még nem határozták meg, hogy hány blasztocisztára van szükség egy pluripotens klónozott embrionális őssejtekből álló vonal előállításához. Érdemes megjegyezni a terápiás klónozási módszertan összetettségével járó magas pénzügyi költségeket is.

Összefoglalva, meg kell jegyezni, hogy az ESC-kben a hipometilált DNS-sel rendelkező genom pluripotenciája magas telomeráz aktivitással és a sejtciklus rövid C^ fázisával párosul, ami biztosítja intenzív és potenciálisan végtelen szaporodásukat, amely során az ESC-k megőrzik diploid kromoszómakészletüket és „juvenilis” fenotípusos jellemzőik halmazát. Az ESC-k klonális növekedése tenyészetben nem zavarja a szervezet bármely specializált sejtvonalává történő differenciálódásukat, amikor a proliferációt leállítják és megfelelő szabályozó jeleket adnak hozzájuk. Az ESC-k szomatikus sejtvonalakká történő restrikciós differenciálódása in vitro a mesenchyma részvétele nélkül, a Nochteys megkerülésével, az organogenezisen kívül és embrióképződés nélkül valósul meg. Az ESC-k ektopikus bejuttatása in vivo elkerülhetetlenül teratokarcinómák kialakulásához vezet. Az ESC-k blasztocisztába vagy korai embrióba történő átültetése az embrionális szövetekbe való integrációjukkal és szerveinek stabil kimerizálódásával jár.

A sejttranszplantáción alapuló regeneratív-plasztikai technológiák a sejtbiológia, a fejlődésbiológia, a kísérleti genetika, az immunológia, a neurológia, a kardiológia, a hematológia és a kísérleti és gyakorlati orvoslás számos más ágának érdeklődési körének metszéspontját jelentik. A kísérleti vizsgálatok legfontosabb eredményei bizonyítják az őssejtek tulajdonságainak célzott megváltoztatásával történő átprogramozásának lehetőségét, ami lehetőséget nyit a citodifferenciálódási folyamatok növekedési faktorok segítségével történő szabályozására - a szívizom regenerációjára, a központi idegrendszeri elváltozások helyreállítására és a hasnyálmirigy-szigetrendszer működésének normalizálására. Az ESC-származékok transzplantációjának széles körű gyakorlati orvoslásba való bevezetése érdekében azonban részletesebben meg kell vizsgálni az emberi őssejtek tulajdonságait, és folytatni kell az ESC-kkel végzett kísérleteket kísérleti betegségmodelleken.

A bioetikai kérdéseket és az allogén sejttranszplantáció kilökődésének problémáját megoldhatná egy felnőtt szervezet regionális őssejtjeinek genomjának felfedezett plaszticitása. Azonban a kezdeti információkat, miszerint izolált és gondosan jellemzett hematopoietikus autológ sejtek májba történő átültetésekor, amelyekből új hepatociták származnak, ezek integrálódnak a májlebenykékbe, ma már felülvizsgálják és kritizálják. Mindazonáltal olyan adatok jelentek meg, hogy az idegi őssejtek csecsemőmirigybe történő átültetése új donor T- és B-limfocita hajtások kialakulását okozza, az agyi idegi őssejtek csontvelőbe történő átültetése pedig hosszú távú donor mielo- és eritropoézissel járó hematopoietikus hajtások kialakulásához vezet. Következésképpen a pluripotens őssejtek, amelyek képesek a genomot az ESC-k potenciáljára átprogramozni, fennmaradhatnak egy felnőtt szervezet szerveiben.

Az ESC orvosi célú kinyerésének forrása továbbra is az emberi embrió, amely előre meghatározza az erkölcsi, etikai, jogi és vallási kérdések új metszéspontjának elkerülhetetlenségét az emberi élet eredetének helyén. Az ESC felfedezése erőteljes lendületet adott az élő sejtek és az anyag, a lét és a személyiség közötti határvonalról szóló kemény viták újraindításának. Ugyanakkor nincsenek egyetemes normák, szabályok és törvények az ESC orvostudományban történő alkalmazására vonatkozóan, annak ellenére, hogy ismételten megpróbálták létrehozni és alkalmazni őket. Minden állam, a saját jogszabályainak keretein belül, önállóan oldja meg ezt a problémát. Az orvosok világszerte továbbra is megpróbálják a regeneratív-plasztikai gyógyászatot az ilyen viták keretein túlra vinni, elsősorban felnőtt őssejt-tartalékok, és nem az embrionális őssejtek felhasználásával.

Egy kis betekintés az embrionális őssejtek izolálásának történetébe

Terato(embrió)karcinóma sejteket izoláltak 129/ter-Sv egerek spontán kialakuló here teratómáiból, Lt/Sv egerek spontán petefészek teratómáiból, valamint ektopikusan átültetett embrionális sejtekből vagy szövetekből származó teratómákból. Az így kapott stabil egér terato(embrió)karcinóma sejtvonalak közül néhány pluripotens volt, mások csak egy specifikus sejttípussá differenciálódtak, és néhány teljesen képtelen volt a citodifferenciálódásra.

Egy időben a hangsúly azokon a vizsgálatokon volt, amelyek eredményei arra utaltak, hogy a terato-embriókarcinóma sejtek visszaállíthatók normális fenotípusba a fejlődő embrió szöveteibe történő bejuttatásuk után, valamint a genetikailag módosított terato-embriókarcinóma sejtek in vitro létrehozásán is dolgoztak, amelyek segítségével mutáns egereket nyertek az emberi örökletes patológia biológiai modellezéséhez.

Kondicionált szuszpenziós tenyészetet alkalmaztak terato-(embrió)-karcinóma sejtvonalak izolálására. Tenyészetben a terato-(embrió)-karcinóma sejtek, az ESC-khez hasonlóan, embrioid testekké nőnek, és kötelező disszociációt igényelnek a vonalátvitelhez, fenntartva a pluripotenciát az embrionális fibroblasztok tápláló rétegén vagy a kondicionált táptalajban történő szuszpenziós tenyészet során. A pluripotens terato-(embrió)-karcinóma sejtvonalak sejtjei nagyok, gömb alakúak, magas alkalikus foszfatáz aktivitással jellemezhetők, aggregátumokat képeznek, és képesek többirányú differenciálódásra. Amikor blasztocisztába juttatják őket, aggregálódnak a morulával, ami kiméra embriók kialakulásához vezet, amelyek különböző szervek és szövetek összetételében találhatók, amelyekből terato-(embrió)-karcinóma sejtek származékai találhatók. Az ilyen kiméra embriók túlnyomó többsége azonban a méhen belül elpusztul, és a túlélő újszülött kimérák szerveiben idegen sejtek ritkán és alacsony sűrűségben is kimutathatók. Ugyanakkor a daganatok (fibroszarkóma, rabdomioszarkóma, más típusú rosszindulatú daganatok és hasnyálmirigy-adenomák) előfordulása meredeken megnő, és a daganat degenerációja gyakran előfordul a kiméra embriók intrauterin fejlődésének időszakában.

A normál embrionális sejtek mikrokörnyezetében található legtöbb terato-embriókarcinóma sejt szinte természetes módon rosszindulatú neoplasztikus jelleget ölt. Úgy vélik, hogy az irreverzibilis rosszindulatú daganat a protoonkogének aktiválódásának köszönhető a strukturális átrendeződések folyamatában. Kivételt képeznek az SST3 embriokarcinóma sejtvonal sejtjei, amelyeket egér here teratómáiból (129/Sv-ter sejtvonal) nyertek, és amelyek kiméra egerekben nagymértékben képesek integrálódni az embrió szöveteibe és szerveibe anélkül, hogy később tumorképződés alakulna ki. A kiméra egerek terato-embriókarcinóma sejtvonalainak származékai gyakorlatilag nem vesznek részt az elsődleges gonociták képződésében. Nyilvánvalóan ez a legtöbb terato-embriókarcinóma vonalra jellemző magas kromoszóma-aberrációknak köszönhető, amelyek sejtjeiben mind aneuploidia, mind kromoszóma-rendellenességek megfigyelhetők.

Laboratóriumi körülmények között számos stabil humán terato-(embrió)karcinóma sejtvonalat állítottak elő, amelyeket pluripotencia, magas proliferatív aktivitás és a tenyészetekben történő differenciálódás képessége jellemzett. Különösen az NTERA-2 humán terato-(embrió)karcinóma sejtvonalat használták az idegi citodifferenciálódás mechanizmusainak vizsgálatára. Miután e sejtvonal sejtjeit újszülött patkányok előagyának szubventrikuláris régiójába ültették be, megfigyelték migrációjukat és neurogenezisüket. Kísérletet tettek arra is, hogy a NTERA-2 terato-(embrió)karcinóma sejtvonal sejtjeinek tenyésztésével kapott neuronokat stroke-os betegekbe ültették át, ami a szerzők szerint a betegség klinikai lefolyásának javulásához vezetett. Ugyanakkor a NTERA-2 terato-(embrió)karcinóma sejtvonal átültetett sejtjeinek rosszindulatúvá válását nem észlelték stroke-os betegeknél.

Az első differenciálatlan pluripotens egérembrionális őssejtvonalakat az 1980-as évek elején Evans és Martin nyerte ki a blasztociszta – az embrioblaszt – belső sejttömegéből. Az izolált ESC-vonalak hosszú ideig megőrizték pluripotenciájukat és azt a képességüket, hogy speciális táptalajban lévő faktorok hatására különféle sejttípusokká differenciálódjanak.

Maga az „embrionális pluripotens őssejt” kifejezés Leroy Stevens nevéhez fűződik, aki a dohánykátrány daganatfejlődési gyakoriságára gyakorolt hatását vizsgálva felhívta a figyelmet a here teratokarcinóma spontán előfordulására a kontrollcsoport lineáris (129/v) egereiben. A here teratokarcinómák sejtjeit magas proliferációs ráta jellemezte, és a hasüregből származó folyadék jelenlétében spontán differenciálódtak neuronok, keratinociták, porcsejtek, szívizomsejtek, valamint haj- és csontfragmensek képződésével, de a megfelelő szövet rendezett citoarchitektúrájának jelei nélkül. Tenyészetbe helyezve a teratokarcinóma sejtek pluripotens klónokként nőttek, a szubsztráthoz nem tapadva, és embriótesteket képeztek, majd megszűntek osztódni, és spontán rendezetlen differenciálódáson mentek keresztül neuronokká, gliasejtekké, izomsejtekké és szívizomsejtekké. Stevens megállapította, hogy a 129/v egér teratokarcinóma kevesebb mint 1%-ban tartalmaz olyan sejteket, amelyek képesek különféle specializált szomatikus vonalakká differenciálódni, és maga a differenciálódás az őket befolyásoló tényezőktől függ (a peritoneális folyadék összetétele, az érett sejtek termékei vagy a tenyészethez hozzáadott szövetek). Leroy Stevenson hipotézise a csíravonal embrionális progenitor sejtjeinek jelenlétéről a teratokarcinóma sejtek között megerősítést nyert: a preimplantációs embriókból származó embrioblaszt sejtek szuszpenziója felnőtt egerek szöveteiben teratokarcinómákat hozott létre, és az ezekből izolált tiszta sejtvonalak a recipiens állatoknak intraperitoneális beadás után neuronokká, szívizomsejtekké és más, mindhárom csíralemezből származó szomatikus sejtekké differenciálódtak. In vivo kísérletekben az ESC-k (az embrioblasztból, de nem a trofoblasztból nyert) átültetése egy másik vonalba tartozó egérembriókba a blasztomer 8-32. stádiumában kiméra állatok születését eredményezte (daganatok kialakulása nélkül), amelyek szerveiben donor szövet csíráit találták. Kimerizmust még a csírasejtvonalban is megfigyeltek.

Egy egérembrió genitális rudimentumából izolált primer progenitor csírasejtek morfológiájukban, immunológiai fenotípusukban és funkcionális jellemzőikben megfeleltek a Stevenson által teratokarcinómából és embrioblasztból nyert embrionális őssejteknek (ESC-knek). Az ESC-k blasztocisztaba történő bejuttatása után született kimérákban a szervek allofén morfogenezisét a donor és recipiens szerkezeti és funkcionális egységeinek mozaikos váltakozása jellemezte (máj, tüdő és vesék). Bizonyos esetekben megfigyelték a bélkripták vagy májlebenykék kialakulását, amelyek mind recipiens, mind donor sejtekből álltak. A morfogenezis azonban mindig a recipiens faj genetikai programja szerint valósult meg, és a kimérizmus kizárólag a sejtek szintjére korlátozódott.

Ezután megállapították, hogy az embrionális őssejtek (ESC-k) citodifferenciálódás nélküli proliferációja a mezenchimából származó sejtek (magzati fibroblasztok) tápláló rétegén LIF kötelező jelenlétével történik szelektív táptalajokban, amelyek szelektíven csak az ős- és progenitor sejtek túlélését biztosítják, míg a specializált sejtelemek túlnyomó többsége elpusztul. Ilyen módszerekkel James Thomson 1998-ban öt halhatatlanná tett embrionális őssejtvonalat izolált egy emberi blasztociszta belső sejttömegéből. Ugyanebben az évben John Gerhart kidolgozott egy módszert halhatatlan ESC-vonalak izolálására négy-öt hetes emberi embriók genitális tuberkulumából. Egyedi tulajdonságaiknak köszönhetően mindössze két évvel később az embrionális őssejteket és a definitív szövetek őssejtjeit elkezdték alkalmazni a regeneratív gyógyászat és a génterápia gyakorlatában.