Embrionális őssejtek

A felfedezés az embrionális őssejtek - nem volt baleset, és megjelent az előkészített talajban kutatás területén a fejlődési biológia kutatás. Az „őssejt” vezették be a gyógyszert, 1908-ban a Society of Hematology Congress in Berlin, Alexander Maximov alkalmazott vérképző sejtek. Hosszú, mielőtt az izolálását és előállítását stabil vonalak pluripotens embrionális őssejtek a fejlődés korai szakaszában a kutatási folyamat alkalmazott őssejtek terato- (embrió-karcinóma sejtek, amelyek tanulmányozta a ismeretlen mechanizmusok embriogenezis, beleértve a szekvencia expressziójának a korai gének és fehérje termékek munkájuk.

De vajon az emberi genom totipotenciája helyrehozhatatlanul elveszett-e az evolúció folyamatában? Nem, és az embriogenezis bizonyíték. Ha ez így van, akkor akkor, ha elvileg megvalósul az evolúciós fejlődés második útja? Valószínűleg, ha egy személy elhagyja a Kozmoszt, ahol a környezeti feltételek viszonylag állandóak lesznek sokáig. A csontveszteség (csont demineralizáció egy súlytalan állapotban) nagyon lassan támadható remodeling és a regeneráció lehet tekinteni, mint az első lépés, hogy az emberi adaptációs folyamatot, mint egy faj létezését a térben. Az evolúciós fejlődés második útjának kifizetése azonban más lesz - a sterilitás lesz az ár, amely a totipotenciát és az abszolút plaszticitást minden sejtre visszafizeti. Így szaporodnak ebben a világban az "evolúciós kaméleonok" nem lesz meiosis, otpochkovaniem. De sokáig élni fogunk. A telomeráz halhatatlanság az amőba halhatatlansága. Egy multicelluláris szervezetben az őssejtek mennyiségi és minőségi hosszú élettartamot képeznek.

[1], [2], [3], [4]

Az embrionális őssejtek forrása

Ma forrásai az embrionális őssejtek laboratóriumi vizsgálatok céljára vonal egér teratokarci (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) és humán teratokarcinóma (NTERA-2, TERA-2 , H-9 klón), valamint Hess Trauneona. Mindazonáltal a jelenléte részletezett celluláris útlevél jelezve immun fenotípus, kromoszóma analízis eredményeit az mRNS expressziós profilok kitéve receptorokon és protein intracelluláris jeltovábbítás nem kompenzálja jelentős hátrányai teratokartsinomnyh vonalak ESC - gyors elvesztése totipotenciát és lehetetlensége alkalmazás a klinikai vizsgálatokban, és vegyes a differenciálódást a kultúra nagyon nehéz elkülöníteni tiszta dedikált vonalon heterogén populációját sejteket. Ezért általában egy forrás ESC vonalak termelt klinikai célokra, szolgál a belső sejttömeg a blasztociszta, embriók egyedi blasztomérák 8-sejtes fejlődési szakaszban, sejtek morula későbbi szakaszában, és a primer csírasejt.

Meg kell jegyezni, hogy a teratocarcinóma sejtek, bár pluripotenciális tulajdonságaik vannak, jelentősen alacsonyabb pluripotens potenciállal rendelkeznek, mint az ESC. Integrálni őket embrió sejtek ritkán képződéséhez vezet kimérák, ahol ráadásul még soha nem alakult ivarsejt genotípus teratokartsinomnyh sejteket. Úgy véljük, hogy ennek oka, hogy a gyakori előfordulása a sejttenyésztés során teratokarcinóma kromoszóma-rendellenességek: elvesztése Y kromoszóma, triszómia fajta, deléciók vagy transzlokációk.

Az emberi ESC vonal megkülönböztetésére tett kísérleteket sokszor elvégezték, de ez a feladat nem oldható meg, mivel a normál emberi blasztociszták nehezen férhetnek hozzá tárgyhoz. Ezenkívül emberekben a kromoszóma rendellenességek gyakorisága magasabb, mint az állatok embriogenezisében. A túlnyomó többsége a korai emberi embriók kapott megtermékenyítés után in vitro, talált kaotikus kromoszómán mozaicizmus és gyakori numerikus és szerkezeti aberrációk. Még később, a blastociszták szakaszában az emberi embrióknak csak 20-25% -a normális karyotípusú sejtekből áll. Az ilyen embriók létrehozása ESK gyakorlatilag lehetetlen, mert a zigóta általában tenyésztjük, amíg a szakaszban két vagy négy blasztomerek, majd transzplantáljuk a méhbe. Csak viszonylag korábban volt megbízható technika kifejlesztett a termesztett trágyázott emberi ovulák a blastocys szakaszban. A technika bevezetése az in vitro megtermékenyítés gyakorlatába nem csak a sikeres beültetés kimenetelének gyakoriságát növelte, hanem a normál blasztociszták számára is könnyebben hozzáférhető tárgyat eredményezett.

Egy másik pluripotens őssejt forrása az elsődleges szexuális sejtek, amelyek, ellentétben a fejlettebb őssejt-populációk germenativnogo epitélium, nem a felületén béta-integrin, de kifejezik nagy aktivitású shelochnoy foszfatáz. Meg kell jegyezni, hogy a kísérletben a lakosság őssejtekből alakulnak ki a őscsírasejteket vizsgáljuk a 80-es években a múlt században. Ugyanakkor kifejlesztettek egy eljárást az elsődleges csírasejtek elszigetelésére az egér embrió gonád rudimentjéből. Az első sikertelen eredmények tenyésztésével őscsírasejteket in vitro javasolja a hiábavalóságát ezeket az erőfeszítéseket, mivel a sejtek, bár túlélte, de nem szaporodnak, és meghalt az első napon. Később azt találták, hogy primer egér csírasejtek in vitro proliferációra jelenlétében csak a táptalajban lévő oldható és membránhoz kötött specifikus polipeptid növekedési faktorok. Számos tanulmány azt mutatta, hogy szükség van a jelenléte a tápközegben nem csak LIF, de membrannosvyazannyh és Acél-oldható faktor (SIF) a túlélés és proliferáció a primordiális csírasejtek. Ezeket a peptideket elő a szomatikus sejtek embriókat a mutációra homozigóta Steel, és egyikük egy ligand a proto-onkogén c-kit.

Az emlősök és az emberek elsődleges csírasejtje extragonadal eredetű és a nemi sejtvonal klonális fejlődésének forrása. Kezdővonal ősi csírasejtek, valamint az összes szövetben az embrió és a extraembryonalis mesoderma ad epiblast (elsődleges ektoderma) korai rendelkező embriókat mozaik szerkezeti szerveződését. Módszer mikrosebészeti eltávolítása különböző részein telepített korai embrionális lokalizáció övezetben epiblast elkötelezett progenitor klón őscsírasejteket. A rodamindekstrana, amelyet közvetlenül használunk a sejt-marker azt találtuk, hogy a prekurzorok őscsírasejteket találhatók a proximális régióban a epiblast, közel a extraembrionális ectoderma. Az elsődleges szexuális sejtvonal a 45 sejtes klónból származik, amelynek eloszlása a gasztruláció kezdetén történik. Aztán jön a szegregáció a klón, és a folyamat gasztruláció elsődleges csírasejtek lép extraembryonalis mezodermából és megtalálható az alapja a rudimentum a húgytömiőfoiyadékba mögött a primitív csík. Onnan az elsődleges csírasejtek felé vándorolnak ventrális endoderma a hindgut, és mozoghat a mesenteriumban továbbra is aktívan, ülepítő végén a migráció nemi gerincek. A folyamat során a migráció, valamint az első 2-3 nap lokalizációs a bajt primer gonadális csírasejtek aktívan szaporodnak, és mennek keresztül nyolc ciklusban replikáció. Ha az elején a migráció, körülbelül 50 elsődleges csírasejtek, több mint 25 000, a nemi gerincek egérembriókon tizenkét napon száma őscsírasejteket.

A funkcionális hasonlóság gszt-k és őscsírasejteket demonstrálja teljes integrációját az utóbbi a csere blasztociszta belső sejtmassza és az ezt követő teljes az embrió fejlődése, szöveti, amelyek csak a leszármazottak őscsírasejteket. Szerint egyéb jellemzői egér elsődleges csírasejtek PGC ugyancsak azonosak voltak, amely bemutatja a tudjanak differenciálódni különböző irányokba, hogy embrióid testek in vitro, egy in vivo formában teratoma, amikor injektáljuk szubkután immundeficiens egerekbe emlékeztető spontán teratoma herében egerek vonal 129 / ter.

Megállapítást nyert, hogy, ha hozzá LIF közepes, és az oldható membrannosvyazannogo SIF izolált primer csírasejtek a 8-napos egér embriók túlélési és szaporodik tenyészetben 4 napon, de aztán meghal. Ezen túlmenően, az időszakban, amikor a halál kultúrája megfigyelt őscsírasejteket egybeesik a fejlődési szakaszában a egérembriók (12,5-13,5 nap), amikor a rügyek elsődleges gonadális női csírasejt lép a meiózis, és a hím őscsírasejteket blokkolva vannak mitotikus osztály. Azonban, ha hozzá a környezet nem csak a növekedési faktorok LIF és SIF, hanem FGF-2, az elsődleges csírasejtek továbbra proliferirovat és szubkultúrák alakulnak sejttelepe reprodukálni tudja még, miután eltávolították a környezet a növekedési faktorok (SIF és FGF). Az ilyen sejteket hosszú ideig tenyészthetjük az embrionális fibroblaszt szubsztráton anélkül, hogy oldható LIF növekedési faktort adagolnánk. Ezek a stabil sejtvonalak származó ősi csírasejtek, és arra kérték, hogy hívja embrionális csírasejtek. Ez a kifejezés nem tekinthető sikeresnek, mint amikor tenyésztett EG-sejtek nem nyerhető embrionális csírasejtek, képes végrehajtani a későbbi szakaszaiban oogenezist vagy spermatogenezis. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy az EG-sejtvonalak, bár származó ősi csírasejtek, de a kultúra megszerzése tulajdonságainak embrionális pluripotens őssejtek elvesztik azon képességüket, hogy elkövetése a germenativnye vonalat. Más szóval, az elsődleges csírasejtek a tenyésztés során elvesztik tulajdonságaikat ivarsejtek átalakult prekurzorok és ESC-szerű pluripotens sejtek.

Megjegyezzük, hogy ha immunhiányos EG egereket adunk be, teratoma nem keletkezik. Feltételezzük, hogy a veszteség az emberi EG-sejtek képesek eredményeznek teratoma annak a ténynek köszönhető, hogy ezek a vonalak nem voltak létre közvetlenül a tenyésztett ősi csírasejtek, és származnak sejtekből izoláljuk a embrióid testek. Ezért lehetséges, hogy pluripotens, de már elkötelezett sejtek leszármazottai.

Meg kell jegyezni, hogy alapvető különbségek vannak az EG sejtek és az elsődleges csírasejtek között. Ez utóbbiak nem teszik lehetővé a kiméra egér embriók kinyerését, ami azt jelzi, hogy az elsődleges csírasejtek nem képesek beépíteni a belső sejtm massába vagy a trophektodermba. Népesség jellemzőinek őscsírasejteket hasonlóan a legtöbb szomatikus sejtjeiben elkövetett sorral később az embriókat, bevezetése, amely egy blasztociszta is kialakulását eredményezi kiméra embriók.

Módosítási technikák tenyésztjük embrióid testek kapott EG-sejtek aggregációja által megengedett szelektív táptalajokon végzett kiválasztás hogy befogadjon egy másik populáció pluripotens sejtek, az úgynevezett „származó sejtek embrióid testek (embrióid test eredetű sejtek - EBD-sejtek). EBD-sejtek képesek szaporodni tenyészetben sokáig tette lehetővé, hogy hozzon létre stabil sejtvonalak elkötelezett sejt. Sejt-klónok nyerték expresszáló mRNS-t és számos specializált sejt-marker fehérjék. Ez a megközelítés eredményeként bebizonyította, hogy az elsődleges szexuális emberi pluripotens sejtek, és differenciálódnak az in vitro be különböző sejttípusok: neuronok, glia, vaszkuláris endotélium, a hematopoietikus sejtek, az izom, és endodermális sejtek.

Az embrionális őssejtek alternatív forrásai

Az emberi ESC vonalak alternatív forrása hibrid sejt lehet. Az implantáció a méhbe álvemhes tehenek geterogenomnoy szerkezetet kapunk, ha egyesülő elektroporációval fetusa humán szomatikus sejteket a tojás tehenek, amelyet előzőleg eltávolítottuk a pronukleusz, lehetővé teszi, hogy megkapja a belső sejttömegéből pre-implantációs embrió mesterséges fejlődési stádiumokban. Erre a célra, az első lépésben nyert blastocysta tojás tehén egy átültetett emberi sejtek nucleus.

A második szakaszban az embrioblasztot a blastocisztából nyerik ki, és abból - az ESC-t a Thomson módszer szerint. Érdemes megjegyezni, hogy a legjobb eredményeket a szétválasztás ESC vonalak az e módszerrel kaptuk magok használatakor a follikuláris sejtek vagy az elsődleges csírasejtek, hogy továbbra is fennállnak az emberi szervezetben állapotban hibernáció. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy a tehén tojást transzplantált humán sejtek nucleus neukorochennye kell nagy az aktivitásuk és a telomer telomeazy, amely elkerüli az idő előtti öregedés ESC-ből származó klónok a hibrid tojás (Repin, 2001). Ismeretes, hogy a legfontosabb intracelluláris marker fehérjék PGC vannak okt3, Oct4 TCF, Groucho, melyek tartoznak az úgynevezett hangtompítók, kromatin proteinek. Tömítőcsavarok biztosít egy különösen kompakt csomagolására heterokromatin, eukromatin, amely megakadályozza a kialakulását hurkok. A fehérjék által közvetített kromatin csomag korrelál az ESC genom totipotenciájával. Ma úgy találta, hogy az érett petesejt a szarvasmarha és az ember az egyetlen faj specializálódott sejtek, amelyek magas koncentrációban a hangtompítók proteinek a citoplazmában. Ennek alapján egy hibrid ESC-ek előállítására olyan módszert dolgoztak ki, hogy a szomatikus sejtmagokat a tehenek nem nukleáris ovulusaira vitték át. Előzetes in vitro vizsgálatok azt mutatták, hogy a citoplazmában oociták tehenek helyreállítja totipotenciát genomjában humán szomatikus sejtmagok 12-24 óra elteltével a tenyészet.

Különös figyelmet érdemelnek az emberi embriók preimplantációs fejlődésének jellemzői, amelyek azt mutatják, hogy a totipotens sejtek egy pluripotens sejtek populációját később pótolják, mint egereknél. Vizsgálata sejt transzformálás azt mutatta, hogy a belső sejttömegéből humán blasztociszták sejtek, ESK kívül vannak és a trofoblaszt sejtek, jelezve a teljes potenciát.

Ismert, hogy a blasztociszták szakaszában két különbözőképpen elkülönített sejtpopuláció található. Ezek egyike a trofoblaszt sejtekből és más embrionális placenta komponensekből származó blastociszt, trofectoderm külső rétege. A második populációt a sejtek egy sűrű tömegbe csoportosítják, amely érintkezik a trophektoderm belső felületével. A belső sejttömeg-sejtpopuláció az embriószervek összes szövetéből és csíráiból származik. A késői blasztociszták szakaszában egy extra embrionális endoderm képződik a belső sejttömegből és epiblaszt képződik (az elsődleges ektoderma). Ugyanakkor az epiblaszt sejtek megtartják a pluripotenciát, míg az extra-germinális endoderm sejtjeinek megkülönböztethetősége korlátozott.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Emberi őssejtek kinyerése

Mostanáig azt hitték, hogy a trofoblaszt nyert hESCs lehetetlen. Azonban a diploid vonal trophectoderm őssejteket izoláltunk a blasztocita olyan közegben, amely tartalmaz, ahelyett, LIF és FGF2 heparin, elszaporodik, és átalakul őssejtek. Ha eltávolítja a közepén FGF-2, a trophectoderm sejtek abba tenyésztés kezdenek endoreduplikációs kromoszómák és sejtes elemei trofektodermalnye fokozatosan átalakult egy hatalmas trofoblasztsejtekkel. Valószínűleg, LIF nem stimulálnak proliferációt a trophectoderm sejtek annak a ténynek köszönhető, hogy a FGF-2 kiváltja egy mechanizmust transsignalizatsii mint FGF2, kötődés citoplazmatikus receptor (FGFR2), aktiválják a MAP-kináz a citoplazmában - ERK1 és ERK2. Következésképpen, ha beépül a sejtekbe a blasztociszta egy jelátviteli útvonal (LIF - gpl30 - JAK-kináz - STAT3) belső sejttömeg sejteket transzformáljuk pluripotens hESCs, míg aktiválása a második mechanizmus a transzmembrán jelátvitel (FGF2 - FGFR2 - MAP kinázok ERK1 / ERK2) őssejtek blasztociszta trophectoderm képződik. Válogatás a jelátadó útvonal, viszont függ az aktivitása a gén Oct4. Ez a gén tartozó POU domain, található a locus t 17 autosomes és során expresszálódik oogenezis, az aprítás időszakban, valamint a sejtekben a belső sejttömeg a blasztocita, és őscsírasejteket. Funkcionális szerepet Oct4 gén kódol egy transzkripciós faktor szükséges előfordulása pluripotens sejtek differenciálódása, valamint dedifferenciációt.

Oct4 génexpresszió gszt függ a kölcsönhatás a transzkripciós faktorok kofaktorok. Irányított expresszió szabályozása Oct4 a blasztociszták azt mutatta, hogy az aktivitását és alsó felében formák trophectoderm sejtek, míg nagyobb indukált expresszióját Oct4 merülnek elsősorban hESCs.

A kísérletben, ESC nem képes lefordítani egy sorban való tenyésztésévei totipotens blasztomerek hasítási szakaszban és a színpad gasztruláció és későbbi szakaszaiban az embrionális fejlődés. Egér gszt általában osztja a 3,5-4,5 nap vemhesség, amely megfelel a hatodik (egyrétegű a blasztocita) és hetedik szakaszok (kétrétegű a blasztociszta - egy korai tojás hengert) a normális embriogenezis. Nyilvánvaló, hogy csak az implantációs periódusban az egerek embriói olyan sejtes populációkat tartalmaznak, amelyek ESC-be transzformálhatók. Következésképpen az ESC-vonalak izolálása csak az embriogenezis bizonyos fázisaiban lehetséges. Totipotens, tekintve fejlesztési lehetőségeinek életképes embrió embrionális membránokat és a placenta a zigóta alatt keletkező zúzás blasztomérák. A csírasejtek teljes hatásának elvesztése a késői morula szakaszban kezdődik, amikor további blasztomere-aprítás a helyüktől függ. Korai szedercsíra blasztomérák megtartják totipotenciája kísérleti manipuláció változik a helyszín, mint az inverziós helye, nem akadályozza a magas minőségű embrió.

Megállapítottuk, hogy az ESC kibocsátásának hatékonyságát a vonalban a blastociszták állapota befolyásolja a felszaporodásuk idején. A használata blasztociszták után hétnapos szimuláció diapauza a genitális traktusban egerek, ovariektomizált 3,5 nap vemhességi és kezelt progeszteron, hozzájárul egy sikeres elválasztását vonalak az embrionális őssejtek. Feltételezzük, hogy ilyen körülmények között nő a belső cellás masszát létrehozó blasztomerek száma. Lehetséges, hogy a sejtciklus kiterjed és a legtöbb blasztomer bejut a G0 fázisba.

Ezen túlmenően, a stabil pluripotens embrionális őssejtek vonalak függ a genotípus embriók: elég könnyen megkülönböztethető a gszt Murine blasztociszták vonal 129, lényegesen nehezebb beszerezni őket egerek alkalmazásával CS7BL / 6, és gyakorlatilag lehetetlen, hogy izolálja a vonal hESCs blasztociszták CBA / Ca egerekben. Nyilvánvaló, hogy a korai embrióknak vannak olyan genetikai jellemzőik, amelyek befolyásolják a pluripotens ESC vonal kialakulását. Azonban, ha a tenyésztés epiblast szigetelt, valamint a szelektív kiválasztási differenciáló hESCs sejtvonal Korai embriókból CBA / Ca egereket még kiosztott.

A blasztocisztákból származó ESK-vonalak megszerzésére bizonyított standard technikát a korai embriók kísérleti technikájával kapcsolatos laboratóriumi kézikönyvek tartalmazzák. Kísérleti Hess lehet tenyésztésével kapott izolált epiblast (elsődleges ektoderma) 4,5-napos egér embriók mikrosebészeti technikák meglehetősen összetett és módosított tenyésztési körülmények. Ennek az eljárásnak a bonyolultsága indokolt, mivel az ESC vonalak kialakulási gyakorisága jóval magasabb volt, mint a blastociszt belső cellás tömegével való munka.

ESC vonalak izolálására egyes klónt átvittük egy mikro-nos, ápolása 40-60 aggregált sejtek, ez diszpergálódik újra. Többszörös ismétlések Ezen eljárás lehetővé teszi, hogy megkapjuk immortalizált ESK összhangban maximális proliferációs sebesség normokariotipnyh sejtek rögzíti a műanyag, járatokon át 50-100 megtartják totipotenciát és nagy telomeráz aktivitás. A folyamat során a támogató vonalak: ESC a legnagyobb veszély a szennyezés vagy a szérum bakteriális endotoxinok - még nyomokban endotoxin koncentráció a tenyésztő tápközegben okozott tömeges halált az éretlen csírasejtek. Gondosan ellenőrzik a lineáris növekedés és az időben történő diszperziós GSZT tenyészetben képesek szimmetrikus hasadás, amelyben mindkét lánya sejtek maradnak pluripotens és képes elvégezni korlátlan számú sejt ciklus fenntartása diploid kariotípus és a teljes hatékonyságot.

Kiválasztása tiszta populációjának humán gszt végezhetjük transzfekciót követő genomjukba a rekombináns DNS-molekulák kódoló gént tartalmazó szintézisét a zöld fluoreszcens fehérje (GFP). Expressziója GFP növekszik növekvő gszt olyan környezetben támogató azok proliferációját, míg az elején a differenciálódás a gén expressziós szintjének csökken, ami lehetővé teszi kiválasztott szelektív táptalajon tiszta, stabil, pluripotens sejtvonalak. Amikor tenyésztjük izoláljuk GFP-kiválasztás gyakorisága PGC telepképződést növekszik többször, mint a tenyésztési körülményeknek növények szüntetni erőteljes antiproliferatív hatása differenciálódott sejtek.

Fordítása humán embrionális őssejtek összhangban útján való izolálási módszer kidolgozása, a beültetés előtti embriók (lépést 80-120 sejtek), amely után maradnak az in vitro megtermékenyítés eljárás. Ehhez szintetikusan előállított „felesleges” embriók mechanikusan diszpergálnak a közepes Delbekko tűt. Miután címkézés monoklonális antitestekkel szelektív fluoreszcens jelölő embryoblast izolált sejtek. Az embrioblaszt disaszpáz-kollagenáz keverékével diszpergálódik az egyes sejtekbe. A disszociált sejteket egy speciális közegben (80% Delbekko tápközeg + 20% magzati borjúszérum jelenlétében 500 ug / ml IL-6, LIF és SCF) a egyrétegű embrionális fibroblasztok 3 adagológép első passzálások. Így túlélését és proliferációját ős- és progenitorsejtek által fenntartott kitettség IL-6, LIF és az SCF. Ebben a környezetben, a szuszpenziót hESCs nőnek klónok osharennyh különálló sejtek különválasztható enyhe több pipettázással. Az 5.-7. Napon új klónok jelennek meg a felfüggesztett kultúrában. A maximális növekedési sebességet elért ESK megismételjük klónok disszociáló lépésben 10-15 sejteket. Ezután minden klónt átvittük egy mikrocella és nőtt fel, hogy egy aggregált 40-50 sejtek. Az eljárást többször megismétlik a járatokban, növeli a hangerőt a kultúra sűrűsége 5-10 millió sejt per 6 cm-es edényre. Segítségével ez a Thomson passzálták azt izoláljuk 10 klónt halhatatlan humán gszt járatokon át 100 megtartják magas telomeráz aktivitás, a képesség, hogy intenzív proliferáció és fenotípusos jellemző minimális teljes aktivitását, differenciálódás bármelyik 350 speciális sejtvonalak származnak ekto-, mező- - és endoderm. Differenciálása humán ESC kezdődött (a tenyészet megváltoztatása, addíciós és eliminációs szérum LIF), sejt a szubsztráthoz tapadtak, jelezve a fejlesztés a citoszkeleton és az adhéziós receptorok. Fontos, hogy a korlátlan proliferáció humán GSZT tartjuk normál kariotípus.

A humán ESC-vonalak izolálásának második módja az elsődleges szexuális sejtek használatán alapul. Kísérleti tanulmányok kimutatták, hogy az Eu-sejtvonalakat az egerek 12,5 napos embrióinak nemi plakkjaiból lehet előállítani. Azonban ezeknél az esetekben a progenitor sejtvonalak képződési gyakorisága lényegesen alacsonyabb volt, mint a korábbi embriókkal végzett kísérleteknél. Ugyanakkor a 13,5 napos terhességi kor kezdeti egér embrióitól származó primer szexuális sejtek általában nem tudnak vonalakká alakítani.

Az első stabil vonalak az emberi pluripotens EG-sejtek származnak elsődleges gonocytes izolált genitális primordia 5-9 hetes embriók. Az izolált sejteket tenyésztjük egy szubsztrát inaktivált egér embrionális fibroblasztok DMEM közegben magzati szérummal, és az oldathoz hozzáadunk merkaptoetanol, forskolin, valamint a rekombináns humán növekedési faktorok (FGF és a LIF). 7-12 nap után a tenyészetben voltak többsejtű kolónia morfológiai jellemzői és molekuláris markerek megfelelő EG-humán sejtek. Miután aggregáció, ezek a sejtek kialakult embrióid testek, a további fejlesztése a specializált sejtek, amelyek megjelennek jellemző a származékok mindhárom csíralemezek. Az egész 10-20 szakaszban az EG-sejtvonalak megtartották a normál kariotípust, és nem vesztették el a pluripotenciát.

Azt is kimutatták, hogy a LIF, membránhoz kötött és oldható acél faktorok, valamint a TGF-b együttes hatása módosítja az elsődleges csírasejtek kifejlesztésének programját. A primer nemi sejtek továbbra is proliferálódnak ahelyett, hogy megállítják a mitotikus elváltozásokat és kezdik megkülönböztetni az oogenezis vagy spermatogenezis irányába. Több további mitotikus ciklus után hasonlóvá válnak az epiblaszt sejtekhez, és elvesztik a csírasejtek prekurzorainak tulajdonságait, pluripotens embrió-szárú EG-sejtekké alakulnak át.

Így, 1998-ban, a szexuális csíra boncolási humán magzati szövetből, először izoláljuk immortalizált vonal őscsírasejteket. Az embriogenezis humán primer csírasejtek jelennek peteburkában a harmadik héten a fejlődés, és a 4-5 hetes, ezek a sejtek vándorolnak a terület a szexuális tubercle, amennyiben azok a lakosság elsődleges dormantnye gonocytes. Inaktív állapotban az elsődleges csírasejtek a születésükig a bimbóban maradnak. Primer csírasejt vonalakat extraháljuk a magzati genitális tuberkulózis 5-9-hetes embriókat kinyerjük ex tempore szövet, amelyet kezelünk keverékével típusú kollagenázt a IV-V, a hialuronidáz és a DN-áz mennyiségi és minőségi növelése sejt kitermeléssel. Primer csírasejtek a szövetben a magzati genitális tubercle körülvéve stromális (mesenchymális) Sertoli sejtek. Funkcionális célja Sertoli sejtek az anti-apoptotikus faktorok (Fas-ligandum), mitogének, és immunszuppresszív szerek, amelyek védik a szexuális őssejtek immuntámadás a szervezet által. Ezenkívül a genitális tuberkulózis stromális mikrokörnyezetének fontos szerepe van az ivarsejtek érlelésében. Az izolált primer csíra sejtek tenyészetben vannak ültetve a fenti a feeder kötőszöveti réteget álló fibroblasztok magzati első három részeket. A leghatékonyabb kombinációját mitogének elismerten egy komplex, amely LIF, FGF és forskolin (cAMP képződés stimuláns). Proliferációs őscsírasejteket in vitro adagolását igénylik magzati szérumot, jelenlétében egy primer reprodukciós gonocytes tenyészetben klónok képződése kíséri a globuláris, nem tapadó sejtek, hogy a szubsztrát.

Az amerikai National Institutes of Health alapján összefoglalja a meglévő információk a módszerek felosztása emberi ESC sorok blasztocisztákba készült előzetes következtetésre jutott, hogy a sikeres elosztása az ESC valószínűleg tenyésztett blasztocisztákba jól kialakított belső cella tömegét (Őssejtek: a tudományos haladás és a további kutatási irányok Nat. Inst, az USA Health USA-ból). Ebből a szempontból a legjobb forrása a GSZT hozzon létre vonalak emberi hólyagcsíra 5. Napján a fejlődés, melynek elosztása a belső cella tömegét gondosan kell eltávolítani trophectoderm. Izolált belső sejttömeg álló ebben a szakaszában a 30-35 sejtek kell táptalajon termesztett egér embrionális fibroblasztok, ami döntő feltétele a kolóniaképződést tenyészetben hESCs.

Az embrionális őssejtek fenotípusos jellemzőinek elemzése

Határozott érdeklődés fajok összehasonlító elemzése fenotípusos jellemzői a ESC. Azt találtuk, hogy az emberi ESC kolóniák - sűrű klaszterek lapított epiteliális-sejtek, míg a egerek embrioid borjú áll laza konglomerátum legömbölyített sejtek. A humán ESC index nukleáris plazmatikus arány kisebb, mint egér gszt. Majom embrionális őssejtek képezik lapos kolóniák több csipkézett sejtek. Az ESC főemlősök korai klónjaiban egyszerű sejtek láthatók. Az egyre szaporodó hESCs összes állatfajok nem fejeznek MHC I és II. Ugyanakkor, a humán gszt hogy pozitív választ, hogy antitestek TERA 1-60 és GCTM-2, ami azt jelzi a jelenlétét a felszínükön keratin / kondroitin-szulfát proteoglikánok, jellemző az embrionális (teratoma) -kartsinomnyh őssejtek. Expresszió hESCs mindenféle állatokon Oct4 gén azt sugallja, hogy annak ellenére, hogy a fenotípusos különbségek a humán és egér gszt, látszólag által aktivált ugyanazon gének fenntartásáért felelős pluripotenciamarkerek (Peru, 2001). Ezen túlmenően, az ESC vonalak származó embrionális patkány, sertés, nyúl, főemlősök és szarvasmarha, hasonló morfológiai jellemzőit, hasonló sor molekuláris azonosítása markerek és közel azonos molekuláris mechanizmus végrehajtása a embriogenezis program, amely lehetővé teszi, hogy egy friss pillantást a xenotranszplantációval kérdés .

Ellentétben a normál embriogenezis in vivo, in vitro proliferációját hESCs nem kíséri a kialakulását germinális rétegek és blokkra homeotikus Nohgenov háttér, azaz anélkül organogenezis. Mivel a szegmentáció gének nem működnek kultúra hESCs lehetetlen reprodukálni ilyen időszakok embriogenezis lapként szomit szegmentáció a sejtmag, a formáció a szikhólyag, húgytömiőfoiyadékba ideiglenes és más szervekben és szövetekben. Kultúra hESCs mintha fagyott elején a folyamat kialakulásának 350 sornyi korlátozása specializálódott sejtek. Így, klón leányvállalata progenitor sejtek és központilag lokalizált PGC csak modell embrió fejlődés során, amelyben különböző szöveti régió képezhető egy fokozatban különbözőek specializálódott sejtek származnak, azonban a közös prekurzorok. Bár a minimális szintjét receptorok felszínén hESCs, megtartják képes végrehajtani primitív morfogenetikus folyamatokat szimuláló ömlesztett korai embrió szerkezete: zagyot hESCs tenyészetben, és aggregátumok olyan szerkezetet képez, emlékeztető blasztociszta vagy még később embriók (tojás hengerek). Az ilyen szuszpenziós aggregátumokat egyszerűen és komplex embrionális testeknek neveztük el.

Amikor keverve differenciálódnak különböző sejtek a embrioid test egyszerre által kifejezett korai gének ektoderma (okt3, FGF-5, nodális), endoderma (GATA-4), mezoderma (brachyury), kardiogén mesodermát (PKH-2,5), neurális cső (msx3 ) és hematopoiesis (elkf). Használata különböző kombinációi citokinek és növekedési faktorok célzáshoz kialakulását csíra réteg sejtek in vitro számos esetben nem volt lehetséges embrióid testek, amelyeket előnyösen expresszált gének ektoderma vagy mesoderma, amely megnyitja az utat a modellezése gasztruláció és a korai organogenezis fázisában.

Klonális növekedés hESCs bizonyított aszimmetrikus sejtosztódás, amelyben csak az egyik ESC központjában klón megtartja, nem korlátozó reprodukciós képességet, míg a másik utódsejt ad okot generációs progenitor sejtek differenciálódása már jön. Ezért az embrionális test perifériáján a klón szorzásának mértéke nagyobb, mint a középpontban. A növekvő klón marginális sejtjei spontán rendezetlen differenciálódáson mennek át, migrálódnak vagy meghalnak az apoptózis mechanizmusai által. Ezek az események meghatározza a sorsát a klón, ha a proliferációs sebesség meghaladja a migráció sebessége és az apoptotikus sejthalál, klón méretek tovább nő, stabilizáció bekövetkezik egyenlő az apoptózist és a képződési sebességét új sejtek sebesség, regresszió - fordított arányban ezeket a folyamatokat. A progenitor sejtek szimmetrikusan oszlanak el, azaz mindkét lány sejt tovább differenciálódik érett speciális sejtvonalakká. Az ESC / progenitor sejtek aránya változik, de az ESC mennyisége mindig az arányt jelenti a progenitor sejtpopuláció egy százalékának. Ezért csak a klónok gondos pipettázása és időben történő bontása növelheti az ESC-k számát a kultúrában. Az ESC maximális hozamának eléréséhez a leghatékonyabb volt a klónok bontása a 10-12 sejtek stádiumában. Az embrionális testben a sejtek differenciálódásának iránya és mértéke függ a helyétől. Külső embrióid test sejtek nem expresszálják a gént és Oct4 mennek keresztül differenciálódását primer endoderma sejtekben, amelyekből ezt követően kialakított epiteliális sejtek és parietális extraembryonalis zsigeri endoderma. Az embrió test belső sejtjei expresszálják az oct4 gént, és megőrzik a pluripotenciát 48 órás tenyésztés mellett. De akkor a morfológiai átszervezés történik a epiteliális egyrétegű tenyészetben kezdődik és gének expresszióját, hogy ellenőrizzék a fejlesztése az elsődleges ektoderma. Ezután elkezdődik a teljes rendezetlen cytodifferenciáció folyamata különböző sejttípusok megjelenésével, amelyek mindhárom germinális lemez származékai. A folyamat során a spontán differenciálódását embrióid test sejtek először merülnek aggregátumok endoderma markerek formájában fragmensek (ciszták) peteburok. Ezen túlmenően a növekvő kapillárisok angioblasztjai és endotélsejtjei is megjelennek. A végső szakaszában spontán differenciálódását belső sejtek a embrioid test alakul ki különböző véglegesen differenciálódott sejteket, beleértve a neuronokat, glia-elemeket is, szívizomsejtek, makrofágok és eritrociták. Bizonyos közelítése (figyelembe véve a térbeli inverzió lapok képező embrionális szövet) keresztül embrióid testek in vitro lehet felfedezni morfogenetikus folyamatokat és elemzik a molekuláris mechanizmusok embrionális citodifferenciációs kezdeti időszak, és létrehozza a szerepe a specifikus gének végrehajtása során ezeket a folyamatokat.

Így a klónon belül olyan sejtek találhatók, amelyekben különböző genetikai fejlesztési programokat fedeznek fel - ESC-k, korai progenitorok és differenciáló progenitor populációk. Az ESC termesztése dömpinges csepp vagy tömegkultúrák adagolóréteg nélküli módszereivel és LIF táptalajon való hozzáadása nélkül elkerülhetetlenül embrionális testek kialakulásához vezet. Az embrionális testek külső és belső rétegeinek sejtjeinek morfológiája más. A külső réteg nagy, folyamatcellákból áll. A felszínüket a környezettel szemben számos mikrohullámmal borítják. A sejtek külső rétegét elválasztjuk a Reichert membránhoz hasonlító belső bázikus membrántól, míg az embrió testek belső rétegének sejtjei hengeres epitélium. Morfológiailag a belső réteg, bár sok elválasztó sejtet tartalmaz, jobban emlékeztet a nem differenciált ESC telepekre.

Az emberi embrionális őssejtek jellemzői

Hiánya parenchymás mesenchymalis kölcsönhatás a háttérben jelzáró gének homeosis okoz rendezetlen növekedés PGCs a kultúra, mivel ez a fül törött és a kialakulását infrastruktúra ideiglenes szerveket. Szervezetlen növekedés és a rendezetlen spontán differenciálódását hESCs tenyészetben hiánya miatt mesenchymalis jelölés stroma keretében jövő szervek: in vitro lehetséges kialakulását millió májsejtek, de nem tud olyan szegmense a máj, beleértve az olyan strukturális és funkcionális elemek, mint például a melléküregek, a tér Disse és Kupfer sejtek.

Úgy véljük, hogy a pluripotens GSZT realizált kizárólag embriogenezis alkotnak szövetek és szervek az embrió, míg a köldökzsinór és a méhlepény származnak trofoblaszt. Zárt egy shell trofektodermalnuyu ESK következetesen generál-sejt-klónok ideiglenes megvalósító fejlesztési program kombinatorikus mRNS ömlesztett Nohteyaov topográfiai mátrix, amely előre a térbeli elrendezésben, alakja, méretei, száma az ideiglenes és végleges szervi sejtek és parenchyma szerelvényt strukturális és funkcionális egység. Ugyanakkor az ESC az egyetlen sejttípus, amely a molekuláris mechanizmusa megvalósítása a potenciálok teljesen disszociált a genetikai program fejlesztési és ESCO-k magukat fosztva annak lehetőségétől, a kölcsönhatás más sejtek miatt elzáródása mind receptor felfogás és transsignalizatsii rendszerek. Azonban megfelelő aktiválási GSZT eredmények fokozatos kiépítésével embriogenezis programot befejező születés teljesen kialakult, és készen áll, hogy a méhen kívüli élet egy szervezet tagjai milliárd sejt. Ebben a rövid idő alatt, de elképzelhetetlen adósság a sejtközi térbe útját elkerülhetetlen hibák előfordulása a molekuláris mechanizmusok, amelyek az életfunkciók sejtek és a programok ellenőrzése a proliferáció, differenciálódás és a specializáció. Ezért a modern farmakogenomikáról külön figyelembe véve a betegség molekuláris eszközöket, és a betegség sejt programozás. És az intézkedés a legtöbb új gyógyszerek korrekcióját célzó a program nevét a differenciálódás, szaporodás és organogenesis, valamint a regenerációs a szervek és szövetek. A felnőtt szervezet keresztül gszt lehetővé válik, hogy ellenőrizzék a viselkedését őssejtek / progenitor sejtek átültetett az agyban, májban, lépben, csontvelőben és más szervek az emberi megjavítani a sérült recipiens parenchymás szervek miatt differenciálás és a specializálódás donor mesenchymalis sejtek tartósított mátrix. Lényegében totipotenciája programot indít újabb petesejt genom szintjén, zigóták és blasztomérák, de ezek a sejtek még nem lehet klónozni és átvittük a szükséges mennyiségben igényeinek tapasztalati és gyakorlati gyógyszert. Ezért az ESC egyedülálló forrása a genetikai információ, amely a háromdimenziós lineáris restrikciós térkép, az embrió és kódok szakosodott sejtvonalak során gasztruláció.

Gyakorlatilag korlátlan lehetőségek regeneratív ESC annak a ténynek köszönhető, hogy a genom, ellentétben a genetikai apparátus differenciált szomatikus sejtek, fenntartja pluripotencia. Az egyik megnyilvánulása szunnyadó állapotban gyökerezik GSZT genetikai információ az úgynevezett minimum fenotípus - a felszínen az ESC kifejező korlátozott számú receptor, ezért telepített nagyon kevés program kölcsönhatásba transsignalizatsii nukleáris berendezés, a sejt és mikrokörnyezet. A háttérben a hibernáció felelős gének korlátozását szakosodott sejtvonalak és sejtek differenciálódását, aktivált csak mintegy 30 500 gének, amelyek termékei kommunikációs cellák a környező mikrokörnyezet. Eljárás használatával a soros génexpresszió elemzését a kimutatták, hogy az általánosság a főbb funkcionális genom dobozok szabályozó energia és metabolizmus szomatikus sejtekben, és gszt-k utolsó meghatározott rendkívül alacsony mRNS mennyiségét a receptorok, a G-fehérjék, másodlagos hírvivők, transzkriptázt, kofaktorok expresszióját és elnyomás azaz a teljes rendszer transzmembrán szabályozó jelet a sejt belsejébe. Ez annak köszönhető, hogy a hiányzó vagy alacsony expressziós gének transsignalizatsii. Differenciálódása során indukálódik genomjában ESC 18 műveletet leállítjuk szinkronban működő gének számára háttér-aktiválásának transsignalizatsii 61 szabályozó gén szintézisét sejtadhéziós receptorok, extracelluláris mátrix komponensek, restrikciós transzkriptázoktól messendzhernyh elemek és a jel átviteli rendszer egy nukleáris egység a plazma sejtmembrán receptorokhoz. Egyidejűleg blokkolt felelős gének expressziójának a fehérjék szintézisét hangtompítók, valamint génexpresszió koingibitorov nyújtó totipotenciát genom hESCs.

Mindhárom embrionális szórólap sejtjeinek genetikai markereit találtuk. Azonosítás ektodermális sejtréteg végzett gének expresszióját nodális, okt3 és az FGF-5, mezodermális sejtek - gén brachyury, zéta-globin, endoderma - a GATA-4 gén expressziója. A normális embriogenezis során gasztruláció megfigyelt aktív migrációs éretlen populációk ős- és progenitorsejtek, lokálisan kijelölő területek az arccsontok a koponya, egyes részei az agy, a perifériás idegrendszer, a szív ingerületvezetési rendszer és a csecsemőmirigy szöveti képződő klónokból kényszerült sejtek. Sejtjelöléses korai gének csíralemezek megkönnyíti topográfiai elemzés a migráció a progenitor sejtek a fejlődő embrió. Azt találtuk különösen, hogy a sejtek az aggregátumokban embryocarcinoma P19 expressziója az első gén mezodermából brachyury közben kezdődik csökkentését génexpressziójának szöveti plazminogén aktivátor, a-fetoprotein, keratin 8, és a keratin-19, amelyek markerek korai mesoderma vándorló populációk. Következésképpen, a formáció a szövetek mezodermális eredetű kezdődik csak után a folyamat a migráció és ülepítő pont mesodermalis progenitor sejtek.

A rendkívül korlátozott fenotípusos jellemzői és a hiánya a legtöbb blokkok transsignalizatsii ESC mindazonáltal kifejezni valamilyen receptor molekulákat, hogy lehet használni, hogy azonosítani őket. Érdemes megjegyezni, hogy az antigéneket, markert ESC az emberek és főemlősök gyakori volt. Leggyakrabban a jelzéshez használt hESCs jelölt antitestek antigénekre membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (egyedi lipid képviselő antigéneket komplex glikolipidet GL7 a sziálsav), valamint a nagy polimer glikoproteinek TRA-1-81, TRA-1-60. Továbbá, hESCs kifejezni specifikus embrionális antigén SSEA-1 és az endogén alkalikus foszfatáz, valamint egy specifikus transzkripciós faktor Oct4. Az utóbbi fenntartásához szükséges hESCs proliferációs mechanizmusok - specifikus transzkripciós faktor Oct4 gén expresszióját aktiválják fibroblaszt növekedési faktor 4 gén expressziója és stabilizálja boksz felelős a nem-korlátozó jellegű DNS kettőzés az éretlen sejtek. A legfontosabb intracelluláris marker proteinek okt3, Oct4 TCF és Groucho, kapcsolódó fehérjék kromatin-hangtompítók.

Szinte azonnal, miután a hosszú távú tenyésztett gszt kísérlet sikertelen, és az organizmus először elő kultúra őssejtek izolált egérblasztocitákból, és a primer csírasejt kultúra, kezdett szakaszban ESC pluripotencia kapacitástanulmányok beadva a korai szakaszában az embrionális fejlődés. Kimutatták, hogy a morula és blasztociszta PGC alkotni képesek kiméra embriók, amelyben a donor PGC leszármazottai találtak mind a szomatikus szövetben és még ivarsejtek. Így Developmental Biology Using ESC scripting „híd” között a kísérleti vizsgálatok in vivo és in vitro, amely jelentősen növelte a lehetőségét tanulmányozása folyamatok Bookmarks primer szövetek és szervek, differenciálódását és az embrionális organogenezis.

Jól ismert, hogy in vivo körülmények között az embriogenezis során ESK integrálódott sejttömeg a korai embrió, és ezek származékai megtalálhatók minden szervekben és szövetekben. Az ESC-k a kiméra embrióban egy olyan nemi sejtvonalat kolonizálnak, amelynek leszármazottai teljes körű ovulákat és spermiumokat alkotnak. Embrionális őssejteket klonogén - egyetlen PGC létrehozhat genetikailag azonosak a kolónia a sejtek molekuláris markerekkel, amelyek magukban foglalják a Oct4 génexpressziót és alkalikus foszfatáz, a magas telomeráz aktivitás, valamint expresszióját specifikus embrionális antigének.

Ahhoz, hogy tanulmányozza a mechanizmusok az embriogenezis technika felhasználásával hESCs kimerizáció morula létrehozásával biológiai szerkezet található, amely külső réteg tetraploid blasztomerek recipiens és donor PGC vannak beadva. Így, trofoblaszt kialakítva leszármazottai tetraploid blasztomerek recipiens, amely lehetővé teszi a beültetés és placentáció, és a donor PGC eljáró a belső sejttömeg, amely képződik életképes csíra vonal az elsődleges test és progenitor ivarsejtek. Tanulmány ESC értéke abban rejlik, nemcsak, hogy amikor a manipuláció in vitro a genomjában megmarad pluripotencia, hanem az a tény, hogy megőrizve képes részt képződését hESCs őscsírasejteket a kiméra embrió. Az eredmények azt mutatják, hogy csak az egyik az utódok a géntechnológiával módosított PGC megtelepedni összes elsődleges és csírák formázószalaggal kiméra kapott embrió aggregációja vagy együttes tenyésztés A sejtek 8-sejtes embrióból. Amikor egerekbe transzplantált morula gszt transzfektáljuk zöld fluoreszcens fehérje gén, fluoreszcens leszármazottai a sejteket találtunk az összes vizsgált szövetben a fejlődő embrió (Shimada, 1999). Transzplantációs ESC a morula létrehozhat életképes egerek testében amely kizárólag a leszármazottak adományozott az ESC, amely módot ad a különböző terápiás klónozás lehetőségeket. Most egy ilyen módszeres megközelítést sikeresen alkalmazták, hogy tanulmányozza a problémát a fejlődésbiológia, különösen, hogy képes elemezni a genetikai mechanizmusok inaktiválása az X kromoszómán vagy epigenetikus instabilitását hESCs. Transzplantációs ESC az a korai embrió használják a mezőgazdasági biotechnológia, valamint a kísérleti génterápia.

A génmódosított ESC-k transzplantációit használják a mutáns gének célsejtjeinek tesztelésére. Az in vitro tenyésztett ESC-ket biotechnológiában alkalmazzák knockout egerek előállítására. Erre a célra, homológ rekombinációval eltávolítandó gszt vizsgálatban gént (knockout) és szelektív tápközegben sejteket, amelyekből hiányzik ez a gén. Ezután knockout PGC injektáljuk blasztocitává vagy hordozzák azokat blasztomerek morula aggregációt. Az így kapott kiméra korai embriókat átültetett egy recipiens nőstény és újszülött egerek közül kiválasztott egyének ivarsejtjei, nullizigotnymi ennek a génnek. E technológia szerint a teremtett számos vonalak knockout egerek, amelyeket széles körben alkalmazták kísérleti biológia és a kísérleti gyógyszert. Ezeken a biológiai modellek vizsgálták az értéke bizonyos gének az embrionális fejlődésben, valamint azok szerepét a mechanizmusok betegségek és kóros állapotok emberekben. Ezenkívül a kieséses állatok vonalát a génterápia új módszereinek preklinikai vizsgálati fázisában alkalmazzák. Például, a gén transzfekció ESK normális allélt a mutáns gén hatékony kezelésére korrigált mutációt, megüti a hemopoietikus rendszer. A bevezetése idegen géneknek GSZT lehetővé teszi gyors létrehozásához homozigóták transzgenikus laboratóriumi állatokban. Azonban, meg kell jegyezni, hogy a technika irányított rekombinációval gén deléció megbízhatóan dolgozott ki még csak viszonylag ESC egerekben. Rágcsáló gszt dupla knockout telepítve funkcionális szerepe területe cluster gének kromoszómán 7 (másolási genomi régió 19 perc humán kromoszóma), és a közeli része a 11. Kromoszóma (másolja humán 5D kromoszóma) - deléció ezen gének Az ESK egerek lehetővé tették, hogy kiértékeljék analógjaik működését emberekben.

A kapacitás függvényében vizsgálatok emberi embrionális gének, transzfekció gén, amely a laboratóriumi állatokat hagytuk hESCs különösen crypto szerepének tisztázása a gén a fület és alkotó kardiogén mezodermából, Pax-6 gén - az embriogenezis szem. Jelenti az első gének expresszióját éretlen proliferáló kártya ESC teratokarcinóma és blasztociszta egerekkel, amellyel igazoltuk túlnyomó elnyomás ESK transsignalizatsii gének. A kombináció a mutáns GSZT 60-80 és 20-30 sejtek normális beültetés előtti egér embriók kialakulásához vezet kiméra embriók ahol könyvjelzőt szervek alkotják a donor és recipiens sejtek, amely lehetővé teszi számunkra, hogy milyen szerepet tölt be ismeretlen gének gasztruláció és organogenesis. Funkcionális térképét gén fejlődő egérembriók kinagyított részleteit a szerepét gén sf-1 lapon a mellékvesében és a nemi primordia, tömeg-1 gén - a vese lapon myoD családi gének - a lap a vázizom géncsaládból gata-1-4 - a korlátozás érés az erythro- és lymphopoiesis alapjai.

Rendező ki az anyai és apai allélek gének hESCs vektor alkalmazásával rekombináz szolgált, hogy tisztázza a funkciók különböző gének embriogenezis során és a technológia célzó emberi ismeretlen gének egér GSZT hozzájárulnak a felfedezés új mutáns gének fejlesztéséért felelős a súlyos örökletes betegségek. Használata knockout módszerrel meghatározott obligát jelentősége bizonyos gének fektetéséhez embrionális szövetek: gata-4 - infarktus, GATA-1 - eritroid hemopoetikus szövetek, myoD - vázizom, brachyury - a mezodermából restrikciós transzkriptázoktól hnf3 és hnf4 - a máj őssejtek, rag-2 - könyvjelzõivel klónok T és B-limfociták (Repin, 2001). Dupla törlését gének hESCs megnyitotta a hozzáférést a tanulmány a funkcionális gének szerepe a germinális rétegeiben, szegmentáció és homeosis és ESC transzplantáció adott megszerzésének lehetőségét életképes interspecifikus hibrid embriók. Javított módszerei transzplantációs donor PGCs egyetlen 8-sejtes embrióból bizonyított, hogy kimerizáció a sejtek szintjén számos szerv a kedvezményezett embrió. Megjegyezzük, hogy sejt hajtások találhatók az emberi szövet recipiens egerek szervei beadása után humán vérképzési őssejtek a hólyagcsíra. Azt találtuk, hogy a egérembriók képződése során a vér szervek keringő pluripotens hESCs. Lehetőség van arra, hogy a biológiai funkciója a szervezet a jövőben magzati immunrendszert. A ESC in vitro reprodukálható megfelelő modelleket az emberi genetikai betegség: dupla knockout modellek disztrofin gén egerekben a Duchenne-féle izomdisztrófia, leállítás ATM gén (vezérlőjel szintézis kináz kromatin) - ataxia-teleangektaziyu. Ebben az esetben, egy halálos kimenetelű örökletes betegség gyermekeknél hiba miatt a DNS-javítás alakul degenerációja Purkinje-sejtek a kisagyban, amely kíséri sorvadást a csecsemőmirigy miatt a halál a szaporodó sejtek. Klinika és patofiziológiai patomorfologija ataxia teleangek- tazii reprodukálni keresztül behurcolása az ESC kóros genetikai információ egerekből származó kimérák megegyeznek az emberekben. Továbbá ataxia-teleangektazii alkalmazásával PGC és knockout egerekben kifejlesztett kísérleti modellben, néhány örökletes homozigóta kapcsolatos humán megbetegedések rendellenességek szénhidrát-és zsíranyagcsere, katabolizmus aminosavak, eltávolítása réz és bilirubin, amely jelentősen növelte a lehetőségét kísérleti gyógyszer preklinikai tesztelése az új módszerek kezelésére vonatkozó betegségek személy.

[12], [13], [14], [15]

Az őssejt-cytohybrid alkalmazása

A hibrid sejtek olvasztásával nyert szomatikus sejtek hESCs, megfelelőek és ígéretes modell tanulmányozására őssejt pluripotencia és átprogramozása differenciált sejt kromoszómák. Tsitogibridy nyert egyesülésével ESC differenciálódott sejtek a felnőtt állat, ad lehetőséget, hogy tanulmányozza a kapcsolatát a genom különböző „korosztály”: fejleszti különleges helyzet, amikor a homológ kromoszómák sejtekből származó különböző szakaszaiban a differenciálás, és különböző fokú érettség, ugyanabban magba, ahol könnyen transdeystvuyuschimi megosztani szabályozó jeleket. Nehéz előre látni, hogyan fog reagálni tsisregulyatornye epigenetikus rendszer homológ kromoszómák meglévő során in különálló fejlesztés, válaszul a hatását transdeystvuyuschih jeleket embrionális rokon ge. Ezenkívül, a hibrid sejtek bekövetkezik szegregációja szülői kromoszóma, amely lehetővé teszi, hogy tanulmányozza a kölcsönhatás a genomok különálló kromoszómán szinten, azaz potenciálisan azonosítani a része specifikus kromoszómák a karbantartási pluripotencia, vagy éppen ellenkezőleg, a differenciálódás kimenetele.

Mivel az első kísérleti modell kölcsönhatásának tanulmányozására genomok különböző „történelmi fejlődés” használt tsitogibridy előállított egyesítésével teratokartsinomnyh pluripotens és differenciált szomatikus sejtek. Bizonyos esetekben az ilyen hibrid sejtek elegendően magas szinten pluripotens tulajdonságokat tartottak fenn. Különösen, in vivo szomatikus hibrid teratokartsinomno-sejteket indukált fejlődését igaz teratoma tartalmazó származékai mindhárom csíralemezek, egy in vitro szuszpenziós tenyészetekben képződött embrióid testek. Még az ilyen típusú fajok közti tsitogibridov jegyezni jelenlétében magzati antigének olyan esetekben, amikor a szomatikus partner a egyesülés teratokarcinóma sejteket limfociták vagy timociták. Érdemes megemlíteni, hogy a teratocarcinoma sejtek fibroblasztokkal való fúziójával létrehozott cito-hibridek a fenotípusnak megfelelő fibroblasztoknak felelnek meg.

A legfontosabb az, hogy Megállapított tény, hogy a-teratokartsinomno szomatikus hibrid sejtek megjelent jelei genom átprogramozása differenciált sejtek, azzal jellemezve, hogy reaktivációja egyes gének vagy inaktív X-kromoszóma szomatikus partner. Így a kutatás eredményei a típus tsitogibridah teratokartsinomno-szomatikus sejtek jelzik, hogy a hibrid sejtek gyakran megmarad pluripotens és átprogramozása a genom, vannak jelei a szomatikus partnere.

Azokban a kísérletekben, így az embrionális intraspecifikus hibrid sejtek fúziójával lépsejtek az egér gszt kifejlett állat vizsgált jellemzők, például tsitogibridov, szegregációs elemzés a szülői kromoszómák és értékelni pluripotencia hibrid genom. Az interspecifikus hibrid sejtek által termelt fúziós teratokarcinóma sejtek szomatikus sejtek, általában jellemző az alacsony kromoszómaszegregáció tetraploid vagy közel tetraploid kariotípus. Hasonló citotoxikus kompozíciót figyeltek meg a cytohybridben az elsődleges nemi sejtek lymphocytákkal történő fúziójával. Ugyanakkor, a interspecifikus hibrid sejteket kapunk az összefonódás egér limfocita sejt teratokartsinomnyh nerc, volt intenzív kromoszómaszegregáció szomatikus partner.

Egy minőségileg új szakasz a tanulmány a szegregáció a szülői kromoszómák interspecifikus hibridek jött után fejlesztése mikroszatellit elemzési módszer segítségével a polimeráz láncreakció, ahol minden egyes egér kromoszómán talált néhány száz markerek, amely lehetővé teszi megbízhatóan megkülönböztetést bármely két homológ kromoszómák a hibrid sejtek.

Összevonásával ESK (használva HM-1 deficiens sejteket gipoksantinfosforiboziltransferazy aktivitást, 2n = 40, XY, izolált blasztociszták egértörzs 129 / 01a) egerekből származó lépsejtek kongenikus DD vonal / C nem kapta a készlet hibrid klónok morfológiailag kellett hasonlóságot hESCs. Minden klónt izoláltunk szelektív táptalajon, amelyben a növekedés csak akkor lehetséges, az aktív cella gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforetikus analízis jelenlétét mutatta: az összes klón allél variáns gipoksantinfosforiboziltransferazy jellemző egerek DD / c. Segítségével citogenetikai, azt találták, hogy négy három hibrid klónok okolodiploidny kromoszómák. Egy közel-tetraploid klón két populáció a hibrid sejtek, amelyek közül az egyik tetraploid, és a második, kisebb - diploid.

Elemzés a mikroszatellit, amely lehetővé teszi, hogy megkülönböztetést bármely két homológ kromoszómák egér 129 / 01a és DD / c, a hibrid klónok okolodiploidnym beállított azt mutatta, hogy a klónok történt két különböző preferenciális eliminációs autosomes szomatikus partner. A legtöbb autoszomális klónok HESS2 és HESS3 volt markerek sorban 129 / 01a, azaz a pluripotens partnere. A kivétel volt az 1-es kromoszóma és I: klónok HESS2 és HESS3 együtt markerek HM-1 sejtek, a kis számú markerek jelen szomatikus partner. Ezek az eredmények tükrözhetik hiányos kromoszómaszegregáció 1 és és szomatikus partner, és összhangban vannak citogenetikai adatok triszómia kromoszómák fordul elő, hogy 30-40% HESS2 és HESS3 sejt klónok. HESS4 klón szignifikánsan különbözött a kromoszómális összetétele: sok autosomes Ez a klón származott a genom ESK (kromoszómák 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 és 17), de a kromoszómák 1, 9, 11, 12, A 15., 16., 18. és 19. ábrát mindkét szülő homológja képviseli. A mennyiségi aránya mikroszatellit markerek ezeknek a homológ kromoszómák megfelelt körülbelül 1: 1. Ez lehetővé tette a szerzők arra utalnak, hogy az egyik homológot a genomjából származó a ESC és a másik - a differenciált sejteket. Egyes szubklónokat klón HESS4 során csak jelképes jelenléte kromoszómák 18. és 19. Szomatikus partnere. Az eredmények azt mutatják, hogy a sejtek klónozása HESS4, amellett, hogy a kromoszómaszegregáció szomatikus partner volt a megszüntetése az egyik vagy mindkét homológok a fenti kromoszóma pluripotens genom, tehát volt egy kétoldalas kromoszómaszegregáció mindkét szülő - a jelenség meglehetősen szokatlan, mert tsitogibridov jellemző kromoszómaszegregáció csak az egyik szülő.

Ezen túlmenően, miután a 20. átvitel, az összes klón a hibrid sejtek tartalmaznak csak az X-kromoszóma markerek a szomatikus partner, azaz, a klónok váltotta X-kromoszóma ESC az X-kromoszómán A szomatikus partner. Megerősíti ezt a tényt a kritikus adatok az in situ hibridizáció alkalmazásával FITC-jelölt specifikus próba az X kromoszómán Egér: pozitív jelet detektáltunk csak az egyik kromoszómán. Figyeljük meg, hogy a korábbi időzítése termesztés (legfeljebb 15 átjáró) szerinti citogenetikai adatok jelenlegi két X kromoszóma sok sejtben. Következésképpen, a szelektív média lehetővé teszi, hogy manipulálják az kromoszómális összetétele a hibrid sejtek és irányított kiválasztásához hordozó klónok egyes kromoszómát szomatikus partner gszt a háttérben genomban.

Mint egy egyedülálló tulajdonsága a genom tsitogibridov a lokalizációját szülői genom egy egymagos, természetesen, felveti azt a kérdést, hogy fenntartja a tulajdonságait pluripotens embrionális genom ESC-szomatikus sejthibridek a feltételek a szoros kapcsolatot a genom differenciálódott sejtek. Morfológiailag az ESC és a szomatikus sejtek cytohybridje hasonlított az ESC szülői vonalához. A pluripotencia értékelése azt mutatta, hogy a közel-diploid kromoszómakészletekkel rendelkező klónok szuszpenziós tenyészetekben képesek embrió testeket kialakítani, amelyekben három germinális lemez származékai voltak jelen.

A legtöbb hibrid sejt tartalmazta az ECMA-7 antigént, amely a korai egér embriókra jellemző, és nagy aktivitása is volt az alkalikus foszfatázzal. A hibrid sejtek magas pluripotens tulajdonságairól a legmeggyőzőbb adatokat kísérletekben szereztük be, hogy a HESS2 klón hibrid sejtjeit tartalmazó injekciós kimérák sorozatát kapjuk. A biokémiai markerek elemzése azt mutatta, hogy a donor hibrid sejtek leszármazottai megtalálhatók a legtöbb kiméra szövetben. Ennek következtében az ESC és a szomatikus differenciált sejtek fúziójából nyert hibrid sejtek magas pluripotenciát tartanak fenn, beleértve a kiméraképző képességet a blasztocisztus üregbe való beillesztés során.

A HESS2 és HESS4 klónok szignifikánsan különböztek a szülő kromoszómák összetételében, de hasonló pluripotens tulajdonságokkal rendelkeztek. Elképzelhető, hogy a hibrid genom pluripotenciája domináns szerepet tölt be, de lehetséges, hogy az embrionális genom összes kromoszóma nem vesz részt a pluripotencia fenntartásában. Ha ez a feltételezés helyes, akkor számíthat arra, hogy a pluripotens partner néhány kromoszómájának kizárása a hibridóma genomból nem jár együtt a pluripotens státus változásával. Ebben az esetben a szülői kromoszómák szegregációjának analízise embrionális hibrid sejtekben lehetővé tenné az embrionális sejtek pluripotenciájának szabályozásáért felelős kromoszómák azonosításának szoros megközelítését.

Serov O. és munkatársai (2001) között található a 50 kereszteződéséből kapott utódok a kimérák normál egerekben, amelyek az lenne az genotípusú egerek 129 / 01a, és hordozó az X kromoszóma DD egerekben. A szerzők ezt az okot látják a hibrid sejtekben a pluripotencia csökkenésében a szomatikus genom hatása alatt. Egy másik magyarázat lehet a negatív hatást triszómia bizonyos kiegyensúlyozatlanság autoszőmák és ivari kromoszómák (XXY megfigyelt sejtek egészen a 15. Szakaszban), a hibrid sejtek áthaladását meiózis. Ismeretes, hogy az XXY sejtjei nem meiózison mennek keresztül, és nem okoznak ivarsejteket. A triszomie képes hibrid sejtek proliferatív aktivitásának csökkenésére is, aminek következtében a kimérák kifejlesztésében a szelektív előnyök a befogadó embrió sejtjeihez tartoznak. Ebből következik, hogy a hibrid sejtek pluripotens potenciáljának megfelelő kiértékeléséhez szükség van hibrid klónok előállítására normál diploid kromoszómák készlettel.

Azokban a kísérletekben Serova O. és munkatársai (2001) az első bizonyította a lehetőségét átprogramozását az X kromoszóma a genomjában egy szomatikus sejt hibrid sejtet. Ez a következtetés a szerzők elemzik az expresszióját kimérák HPRT-gén (X-kromoszóma marker): jelenlétében allélvariánsok HPRT DD / c egerekben mutattunk összes elemzett szövetben kiméra. Hangsúlyozni kell, hogy bevezetése után a hibrid sejtek a blasztociszta ürege tsitogibridy tartoznak a nem-szelektív körülmények között, és a megőrzése a X-kromoszóma a genomban a hibrid sejtek alkalmazása azt jelenti, hogy vált egy obligát komponense genomjának, és nem megkülönböztetése az Y-kromoszóma pluripotens partner.

Összefoglalva a szomatikus és pluripotens genomok hibrid embrionális sejtekben való kölcsönhatásának elemzésének eredményeit, a szerzők arra a következtetésre jutnak, hogy egyes citotoxikus sejtekben a pluripotencia domináns tulajdonságként jelenik meg. A hibrid genom képes differenciált sejtek egyedi kromoszómáinak újrarendezésére, amely azonban nem zárja ki a szomatikus genom reverz hatását az embrionális genom pluripotenciájára. A hibrid sejtek termesztésében a differenciálódás indukciója sokkal gyakrabban fordul elő, mint az ESC NM-1 eredeti szülővonalában. Hasonló hatás fordul elő primer kolóniák kialakulásában: az embrionális hibrid sejtek számos primer telepe differenciálódott a kialakulás korai szakaszában, nagy klónveszteséggel a szelekció és szaporítás során.

Így tsitogibridy egyesülésével ESC szomatikus sejtek, annak ellenére, hogy a szoros kapcsolatot a genomja differenciált sejtek megtartják pluripotencia mint egy egyedülálló tulajdonsága az embrionális genom. Továbbá, az ilyen fúziós sejtek átprogramozásával egyes kromoszómák származó diffrentsirovannyh sejtek. Továbbra sem világos, hogy milyen jól megőrzött plyu- ripotentnye tulajdonságait embrionális genom a hibrid sejteket, különösen az a képességük, hogy részt vegyenek a kialakulását csíra-line kimérák. Ehhez be kell szereznie az embrionális hibrid sejtek normál kariotípus. Mindenesetre, a pluripotens embrionális hibrid sejtek lehet egy igazi modell a genetikai azonosítása kromoszómák karbantartásában részt vevő pluripotencia vagy őt ellenőrző kétoldalú szegregáció szülői kromoszómák potenciálisan biztosít ilyen lehetőséget.

Nem kevésbé vonzó a jelenség tanulmányozása, amelyet O. Serov és társszerzők (2001) "kromoszómális memóriaként" definiálnak. A hibrid genom homológ kromoszómák két alternatív konfigurációk: homológok szomatikus partner egyszer átesett differenciálás, mivel homológok pluripotens partner, ez a folyamat csak most kezdődik. Ezért, hogy a magas pluripotens tulajdonságait a hibrid sejtek azt jelzi, hogy „pluripotens” konfiguráció homológok ESC meglehetősen stabil hibrid genomok, annak ellenére, hogy a hatása a transdeystvuyuschih tényezők származó szomatikus partner. A fent leírt jellemzői az átprogramozás differenciált homológ genom kromoszómák fejlesztése során kimérák nem zárják ki annak lehetőségét, hogy az első szakaszában a képződés in vitro tenyésztjük, és tsitogibridov megtartják az állapotát megszerzett differenciálódás során in vivo. A legújabb adatok szerint, amikor a kezdetleges hibrid sejtek nem-szelektív táptalajon, amelyben van egy intenzív eliminációs kromoszómák csak szomatikus partner, azaz, a genom a hibrid sejtek könnyen diszkriminálja homológok után in vitro tenyésztés 10-15 részeket. Így, az embrionális hibrid sejtek egy ígéretes kísérleti modell a tanulmány nem csak az alapvető tulajdonságai embrionális genom pluripotencia, hanem annak alternatívái - embrionális differenciálódás.

Az embrionális őssejt-transzplantáció terápiás hatékonysága

Az ESC transzplantáció terápiás hatékonyságának és származékainak elemzése előtt összefoglaljuk a fenti anyagot. Jellemzők ESC szempontjából a teljes körű végrehajtása embriogenezis in vitro nem elegendő, mert a hibák ebben az esetben hiánya miatt mesenchymális őssejtek, amelyek előfordulnak a szervezetben önállóan és egymástól függetlenül a hESCs. Genetikai potencia ESK kevesebb genetikai potenciál zigótákból ezért közvetlenül klónozására embriók GSZT nem használt. Egyedi biológiai potenciáljának hESCs, mint az egyetlen olyan sejtek, amelyekben fejlesztési programok legteljesebben következetes végrehajtása, találja alkalmazás a tanulmány a gén funkciója tanulmányok. A ESK hajtjuk dekódolása az első jel kombinációk expressziójának aktiválására korai és késői géneket, kódoló a fejlesztés a három csíralemezek. Megőrzése genom pluripotens GSZT in vitro teszi őket egyedülálló eszköz javítása regenerálás, amely automatikusan kompenzálja sejt veszteségek sérült szerveket és szöveteket. Egy ideális hipotetikus kiviteli alak is feltételezhetjük, hogy „... A transzplantáció donor PGC a befogadó organizmusban át kompakt csomagolt programoknak, hogy kedvező feltételek mellett realizálódik az építőiparban új tkani'7 képes” ... Hatékonyan integrálható a befogadó szervezetbe a morfológiai, mind funkcionális, mind funkcionális. "

Természetesen az ESC monodifferenciálására szolgáló módszerek kifejlesztését követően kezdettől fogva in vitro egy inszektív klónból származó sejtek funkcionális aktivitásának in vivo vizsgálata megkezdődött. Az elszaporodó ESO-klón olyan vándorló progenitorsejtek populációit hozza létre, amelyek valóban képesek aktív beilleszkedni a recipiens szövetkárosodási zónájába, amelyet a regeneratív műanyag gyógyszert alkalmaznak. Megállapították, hogy a dopa neuronok transzplantációja a substantia nigra-ban csökkenti a klinikai megnyilvánulásokat a kísérleti hemiparkinsonismusban. A donor idegi őssejtek regionális transzplantációi csökkentik a gerincvelő és az agy trauma vagy kontúziója által okozott motoros rendellenességek mértékét. Fogadott és az őssejt-transzplantáció első pozitív eredményei demyelinizáló betegségekben. Úgy tűnik, hogy az ESC-k regeneratív-műanyag potenciálja korlátlan lehetőségeket nyit a sejtes átültetés gyakorlati orvosláshoz. Azonban, amikor az ektopiás zónákba átültetik, az ESC-k elkerülhetetlenül tumorokká alakulnak át. Ha az ESC subcutan injekciója immundefektív egerekben teratomák képződnek. Ha az ESK-szuszpenziót a heréknek a kapszulába helyezzük syngén egerekben, egy teratoma is kialakul, amely különböző szövetekből áll, amelyek sejtjei mindhárom embrió szórólapból származnak. Az ilyen teratomákban a csökkent szerves genetika folyamata rendkívül ritka.

Számos munka ismerteti az ESCO korai származékainak átültetésének pozitív eredményeit az ex-peritív patológiás állatokra. Cell neurotransplantation származékainak alkalmazásával PGC továbbfejlesztik a kísérletet, és az első klinikai vizsgálatok korrekciójára funkcionális zavarok az agyban és a gerincvelő-trauma, a kezelés a syringomyelia és a sclerosis multiplex (Repin, 2001). Az Advent a technológia neyronogeneza gszt in vitro, használata helyett embrionális agyszövet transzplantációs technikák kifejlesztett származékok neuorsphere nyert tenyészetek embrionális idegszövet. Az ilyen transzplantációs szuszpenziók sokkal homogénebbek és tartalmaznak elkötelezett idegi és neuroglia prekurzorokat.

Amellett, hogy a rendszeres táptalajt retinsav dózisban 10 ug / ml 6 hétig embrionális vonalak (teratoma) NTERA-2 humán -kartsinomy kialakított több mint 80% a poszt-mitotikus neuronok. A teljes homogenitását az idegsejt-populáció érjük el flow válogatás jelzett immunfenotípus markerek érett neuronok tud megszabadulni a maradék teratokartsinomnyh és éretlen sejteket. A kísérleti állatok agy különböző területein történő transzplantáció után az ilyen neuronok nemcsak túlélik, hanem regionális neurális hálózatokba is beépülnek. Azokban az állatokban kísérleti modellek a helyi hibák CNS neurotransplantation csökkenti a klinikai megnyilvánulásai emberi patológiában, mint például a hatását kraniocerebráiis trauma, sztrók, demielinizációs betegségek, örökletes kisagyi fejlődés hibák, betegségek lerakódását lipidek és poliszacharidok.

A regenerációs folyamatok optimalizálása a központi idegrendszer degeneratív betegségeiben, az enzimtermelő oligodendrociták ESK-ból történő előállítására szolgáló technológiák kidolgozása folyamatban van. Az első szakasz tradicionálisan magában foglalja az ESC-k proliferációját az átültetéshez szükséges sejtek számának szorzásával. A második lépésben a sejtek irányított differenciálódását myelintermelő oligodendrocita prekurzorok populációjára hajtjuk végre, amelyet szelektív markerantigének szabályoznak.

Néhány kilátások nyílnak használatra származékok GSZT eljárások kifejlesztése, amelyek korrekciója immunhiányos okozta genetikai hibák érésében a csecsemőmirigy. Azokban a vizsgálatokban, knockout (RAG 1) egerek indukált gén hibája - megsértése rekombináció mechanizmusa V (D) J gén lókuszok TCR, ami funkciójának elvesztése a T-limfociták, transzplantáció korai származékai PGC csecsemőmirigy állat maradéktalanul meggyógyul érése normális populációk immun klónok felelős sejtes immunitás. Klinikai vizsgálatokban a transzplantáció előre in vitro hESCs kezelésére végzetes örökletes vérszegénység gyermekeknél.

Az őssejt-átültetésnek a klinikára történő gyors bevezetésével kapcsolatos kifogásokat az emberi embrionális őssejtek korlátozott számának és a szabványosítás szükségességének indokolja. A szabványosított ESC-vonalak tisztaságának, valamint a felnőtt őssejtek tisztaságának növelése érdekében javasoljuk a DNS rövid tandem ismétlésének molekuláris genetikai analízisén alapuló vonalválasztást. Szükséges továbbá az ESC-vonalak kis kromoszómális átrendeződések és genetikai mutációk jelenlétének tesztelése is, ezért a sejtnövekedés körülményei között fennálló potenciális lehetősége elég nagy. Tézis kiterjeszti a kötelező anyagvizsgáló minden típusú PGCs és regionális pluripotens őssejtek, mivel a terjedés in vitro adhat okot, hogy az új jellemzők nem rejlő embrionális őssejtek, végleges vagy szövetekben. Különösen azt feltételezzük, hogy a hosszú távú termesztési közeg citokinek Hess közelebb a tumorsejtek, mivel előfordulnak hasonló változás utak sejtciklus szabályozására a megszerzése a képesség, hogy végre korlátlan számú sejtosztódás. Egyes szerzők a daganatok kialakulásának lehetősége alapján úgy gondolják, hogy az embrionális őssejtek korai származékai emberi átültetése mint gondatlanság. Véleményük szerint sokkal biztonságosabb az ESC elkötelezett leszármazottai, vagyis a differenciált sejtek ősei. Azonban még nem fejlesztettek ki megbízható technikát a stabil humán sejtvonalak megszerzésére, amelyek a megfelelő irányba megkülönböztethetők.

Így a szakirodalomban egyre több adat áll rendelkezésre az emberi embrionális őssejt-származékok transzplantációjának pozitív terápiás hatásáról. Azonban sok ilyen művet felülvizsgálat és kritika tárgya. Egyes kutatók úgy vélik, hogy a korai klinikai vizsgálatok eredményei előzetes természetűek, és csak azt sugallják, hogy az őssejtek kedvező hatással lehetnek a betegség klinikai állapotára. Ezért szükséges a sejt transzplantáció hosszú távú eredményeire vonatkozó adatok beszerzése. Érvelésként a klinikai neurotranszplantológia fejlődési stádiumait adják. Valóban, az irodalomban, kezdetben uralja a kiadvány a magas hatásfok az agy transzplantátumok töredékei embriók Parkinson-kór, de aztán kezdtek megjelenni jelentések tagadja terápiás hatékonyságát az embrionális és magzati idegszövet átültetett betegek agyában.

Végezte el az első klinikai vizsgálatok biztonságosságának értékelésére transzplantáció neuroblastok - származékok PGC NTERA-2 teratokarcinóma, éretlen sejtek, amelyek szaporodnak a kultúra vetettük alá tároló 100 millió sejt-tömeget. Része a kapott sejteket használtuk, hogy meghatározzuk a jellemzőit sejt fenotípus és szennyezések, valamint a tesztelni a potenciális szennyeződés a vírusok és baktériumok. A tenyészközeget eltávolítjuk, a LIF és tápréteg stromális sejtek és a magzati megteremtette irányított differenciálódását hESCs be neuroblasztokra kombinációjával citokinek és a növekedési faktorok. Ezután a neuroblasztokat az éretlen teratocarcinóma sejtekbői tisztítottuk áramlási ketrecben. Miután a második tisztítása és jellemzése a fenotípus a transzplantált sejtek neuroblasztokra (10-12 millió) szuszpenziót egy speciális fecskendőt és mikrokanülök stereotaxiaval és ellenőrzése alatt a CT fecskendeznek a nucleus basalis a betegek agyában (hetedik hónap után vérzéses stroke). Odnogodovoy transzplantációt követő szűrés hatását transzplantációs a neuronok az agyvérzés zónában nem mutatott káros és nem kívánt hatásokat. A páciensek fele a motorfunkció javulását tapasztalta a transzplantáció utáni 6 és 12 hónapos időszakban. Pozitív klinikai változások növekedése kísérte a vérellátás a stroke után zónát olyan sejtek átültetését: átlagos felszívódási növekedése A fluoreszcens-jelölt 2-dezoxiglükóz szerint a pozitronemissziós tomográfia elérte a 18%, és a néhány betegnél - 35%.

Az amerikai Országos Egészségügyi Intézet azonban független tanulmányt végzett a neurotranszplantáció klinikai hatékonyságáról a Parkinson-kórban szenvedő betegek körében. Az első csoportban az embrionális idegszöveteket tartalmazó dopamin termelődött, míg a betegek második csoportja hamis műveletet hajtott végre. Az eredmények azt mutatják, hogy az ilyen neurotranszplantáció nulladik klinikai hatékonysága, annak ellenére, hogy a dopamintermelő embrionális neuronok túléltek a recipiensek agyában. Ezen túlmenően, 2 év után a transzplantáció után a magzati idegszövet 15% -ban alakult perzisztens dyskinesia, amely hiányzik az a placebo csoportban (Stem sejtek: a tudományos fejlődés és a jövőbeni kutatási irányok Nat Inst, Egészségügyi USA ...). Folytatódnak a betegség további fejlődésének megfigyelései ezen betegek körében.

Egyes szerzők attribútum a ellentmondó szakirodalmi a klinikai hatékonyság értékelése Neurotransplantation adatokat egy másik megközelítés, hogy a páciensek kiválasztásánál a csoportok, a nem megfelelő megválasztása objektív módszerek értékelésére az állapotuk, és, ami a legfontosabb, a különböző fejlődése szempontjából a magzati idegszövet és különböző részein az agy, amelyből a szövet állítottak elő különböző méretű a műtét átültetése és a módszeres jellemzők.

Meg kell jegyezni, hogy megpróbálja közvetlen transzplantáció pluripotens embrionális őssejtek a striatális régióban az agy a patkányok kísérleti test gemiparkinsonizmom kíséretében ESC proliferációját és differenciálódásukhoz a dopaminerg neuronok. Abból kell kiindulni, hogy az újonnan alakult neuronok hatékonyan beépül a neuronális hálózat GSZT transzplantáció után volt megfigyelhető korrekció anomáliák viselkedést és a motoros aszimmetria apomorfin teszt. Ugyanakkor egyes állatok elpusztultak az átültetett ESK transzformációjának következtében az agydaganatban.

A szakértők az amerikai National és Orvosi Akadémia, a szakemberek a National Institutes of Health úgy vélik, hogy a potenciális klinikai hESCs komoly figyelmet érdemel azonban ragaszkodik ahhoz, részletes tanulmányozása azok tulajdonságait, a szövődmények és a hosszú távú hatások kísérletekben megfelelő biológiai modellek az emberi betegségek (őssejtek és a a jövőbeli regeneratív gyógyászatban a National Academy Press, az őssejtek és a jövő kutatási irányai, Nat. Inst, az USA Health USA-ból.

Ebből a szempontból fontos, hogy az összehasonlító szövettani elemzését kísérleti teratoma kapott transzplantáció a herében szuszpenziót PGC azzal teratoma, hogy alakult miatt transzplantáció korai embrió, amely magában is jelen ESC azt mutatták, hogy az ESK függetlenül azok származási vagy kölcsönhatás ezek vagy más környező sejtek ugyanúgy megvalósítják tumorigén hatásukat. Ez azt bizonyítja, hogy az ilyen teratoma van egy klonális eredete, mint a tumor gszt előfordulhat, amely a származékok mindhárom csíralemezek (.Rega, 2001). Érdemes megjegyezni, hogy amikor a transzplantált immundeficiens egerekbe klónozott PGC normál kariotípus és kialakítva teratoma álló különböző típusú differenciálódott szomatikus sejtek. Ezek a kísérleti adatok tökéletes bizonyítékot szolgáltatnak a teratum klonális eredetére. Szemszögéből a fejlődésbiológia, azt sugallják, hogy ez nem több elkötelezett progenitor sejtek és a pluripotens őssejt identitás forrása differenciált származékok mindhárom csíralemez, teratoma alkatrészeket. Mindazonáltal, a gyakorlati-transzplantáció eredményei ezek a vizsgálatok, ha nem megfizethetetlen, akkor egy figyelmeztető jel a potenciális veszélyt, mivel a beoltás ESC vagy az elsődleges csírasejtek a különböző szövetekben kifejlett immunhiányos egerek elkerülhetetlenül okozza a tumorok kifejlődésére a transzplantált őssejtek. Tumoros elfajulást ectopiásan átültetett ESC kíséri a megjelenése műholdas populációinak differenciálódott sejtek - részlegesen különbséget minden bizonnyal gszt és a progenitor klónok dedikált vonalak. Érdekes, hogy a transzplantációs hESCs vázizomsejtekben közelében teratokartsinomnymi neuronok alkotják gyakrabban. Azonban, a beadását PGC Mace tojást vagy blasztociszta kíséri teljes integrációja a csírasejtekben képződése nélkül neoplasztikus sejtek. Ugyanakkor az ESC ágyazott csaknem minden szervben és szövetben az embrió, beleértve a szexuális rudimentum. Ilyen allofennye állatokat először elő, hogy a teratokarcinóma sejt 129 a korai szakaszában az embriók 8-100 sejtek. A allofennyh egerekben populációk geterogenomnyh sejtből származó donor PGC viszünk be a csontvelő, vékonybél, bőr, a máj és a nemi szervek, amely lehetővé teszi, hogy hozzon létre a kísérletben is fajok közötti sejt kimérák. Minél kisebb a ideje a korai embrió, annál nagyobb a százalékos sejt kimerizáció, a legmagasabb fokú kimerizáció megfigyelhető a vérképző rendszer, bőrt, az idegrendszert, a máj és a vékonybél allofennogo embrió. A felnőtt szervezetben a szöveti támadható kimerizáció való kitettség től védetten az immunrendszer a recipiens gistogematicalkie akadályok: transzplantációs őscsírasejteket a herében parenchimában kíséretében beillesztésével donor őssejtek a recipiens szövet germenativny réteget. Azonban, ESC transzplantáció egy blasztocita képződési kiméra primordia nemi szervek generációs donor őscsírasejteket nem fordul elő. ESC pluripotencia létrehozásakor különleges feltételeket, és fel lehet használni a klónozáshoz: ESC transzplantáció egerek 8-16-sejt egér embrió, sejtmitózis ahol tsitokalazinom blokkolt, hozzájárul a normális embriogenezis a az embrió fejlődése donor PGC.

Következésképpen, egy alternatív van transzplantációja allogén ESC terápiás klónozás alapján a szomatikus sejtek nukleáris transzplantációs egy sejtmag-mentesített oocitába, hogy hozzon létre egy blasztociszta belső sejtmassza ahonnan azután kiosztott vonal genetikailag azonos donor PGC szomatikus sejtmag. Technikailag ez az ötlet megvalósítható, mivel a lehetőségét, hogy a teremtés emberi embrionális őssejtek sorok blasztocisztákból kapott a transzplantáció után a szomatikus sejtmag be mag nélküli petesejt többször bizonyított kísérletek laboratóriumi állatokon (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Különösen egerekben a mutációra homozigóta rag2, fibroblasztok tenyésztésével kapott szubepidermális szöveti sejteket alkalmaztunk donor sejtmagokat transzplantálunk mag nélküli oocitákba. Az aktiválás után az oocitákat „zigóta” addig tenyésztjük, amíg blasztocita képződés, a belső sejttömeget izolált PGC és halad őket egy vonalat a mutáns gén nullizigotnyh sejtek (rag2 ~ / ~). Ezekben az ESC-kben homológ rekombináció esetén egy allélgén mutációját korrigáltuk. Az első kísérletsorozatban a hESCs rekombináns gén kinyert embrióid testek állítottuk elő, a transzfektált sejteket ezek rekombináns retrovírus (HoxB4i / GFP) és szaporítás után injektált egerekben vénás rag2 ~ / ~. A második sorozatban a tetraploid blasztomereket géntechnológiával módosított ESC-kkel aggregáltuk, és átültettük női recipiensükbe. A született immunkompetens egerek csontvelő donorokként mutatták be a mutáns egerek rag2 ~ / ~ transzplantációjához. Mindkét sorozatban, az eredmény pozitív volt: 3-4 hét minden egérben normális érett mieloid és a limfoid sejtek találtak termelésére képes immunglobulinok. Így átültetéshez petesejt magok szomatikus sejtek lehet használni nem csak termelni az emberi embrionális őssejtek vonalak, hanem tsitogenoterapii - Javítás örökletes elváltozásokat ESC mint vektor közlekedési kijavítása genetikai információt. De a sejt-transzplantáció ezen irányában a bioetikai problémák mellett korlátozások is vannak. Nem világos, hogy hogyan biztonságos a transzplantáció lenne terápiásán klónozott sejteket egy genotípusú azonos genotípusa egy adott beteg, mert az ilyen sejtek mutációk, hogy hozzon létre a hajlam, hogy bizonyos betegségek. Normál emberi petesejt marad elérhetetlen tárgy, mivel akkor is, ha az átültetést szomatikus sejtmagok a mag nélküli állati petesejt csak 15-25% manipulált „zigóta” dolgozzanak ki a blasztociszta állapotig. Nem határozható meg, hogy mennyi blastocisztre van szükség ahhoz, hogy egy pluripotens klónozott ESC-eket kapjunk. Meg kell jegyezni, hogy a terápiás klónozási módszertan komplexitásához kapcsolódó magas pénzügyi költségek állnak.

Összefoglalva, az ESC pluripotencia genom hypomethylated DNS-t egyesítjük a nagy telomeráz aktivitás és a rövid C ^ sejtciklus fázisban, amely biztosítja az intenzív és potenciálisan végtelen sokszorozási, amelynek során a PGC megtartják diploid kromoszóma és a „fiatalkori” sor fenotípusos jellemzők. Klonális növekedés PGCs tenyészetben nem zárja ki őket megkülönböztetni bármely szakosított sejt a szervezet egy stop vonal szaporodását, és hozzá megfelelő szabályozási jeleket. Korlátozás differenciálódását hESCs összhangban az in vitro szomatikus sejtek valósul részvétele nélkül a mesenchyma, megkerülve Nohteyaov, az organogenezis és képződése nélkül az embrió. Méhen kívüli in vivo beadjuk PGC elkerülhetetlenül képződéséhez vezet teratokarcinóma. ESC transzplantáció egy blasztociszta vagy korai embrió kíséretében integráció a szövetekben a embrió és a stabil kimerizáció szervei.

Regeneratív és műanyag technológiák alapján sejt transzplantáció metszéspontja a tagok érdekeit a sejtbiológia, fejlődési biológia, genetika kísérleti, immunológia, neurológia, kardiológia, hematológia, és sok más területen a kísérleti és gyakorlati gyógyszert. A legfontosabb kísérleti eredmények bizonyítják, a lehetőségét, átprogramozni a őssejtek a változás iránya a tulajdonságaik, amely megnyitja kilátások vezérlésére citodifferenciációs folyamatok növekedési faktorok - a szívizom regenerálására, helyreállítása CNS károsodásokért és normalizálása funkciója a szigetsejt-berendezés a hasnyálmirigy. Azonban, a széles körű elterjedése transzplantáció származékok ESC az orvosi gyakorlatban szükséges, hogy vizsgálja a tulajdonságait humán őssejtek részletesebben és további kísérleteket PGC kísérletes modelljeiben betegségek.

Bioetikai kérdések és a probléma a elutasítása allogén transzplantáció sejt tudta megoldani a megfigyelt plaszticitás a genom regionális felnőtt őssejtek. Azonban a kezdeti információ az, hogy amikor az átültetést a máj izolált és alaposan jellemezve autológ vérképző sejtek, amelyek vannak új májsejtek, amely magában foglalja a máj-lebenykékben, most felülvizsgálják és kritizálták. Azonban, közzétett adatok, hogy a transzplantáció a neurális őssejtek a tímuszban az kialakulását az új hajtások a donor T-és B-limfociták, és a kiültetés neurális őssejtek az agy a csontvelőben képződéséhez vezet a hematopoetikus csíra tartós donor myeloid és a vérképzés . Következésképpen, a felnőtt szervekben lehet őrizni a pluripotens őssejtek képesek genom átprogramozásával ESC kapacitás.

Az emberi embrió továbbra is az ESC orvosi célokra történő fogadásának forrása marad, amely előre meghatározza az erkölcsi, etikai, erkölcsi, jogi és vallási problémák új, metszéspontját az emberi élet születési pontján. Az ESC-k felfedezése erőteljes lendületet adott a kemény viták folytatásához arról, hogy hol található az élő sejtek és az anyag, az anyag és a személyiség közötti vonal. Ugyanakkor nincsenek egyetemes normák, szabályok és törvények az ESC használatára az orvostudományban, annak ellenére, hogy többször próbálják létrehozni és elfogadni őket. Minden jogalkotó saját maga megoldja ezt a problémát. A világ minden tájáról érkező orvosok továbbra is megpróbálják a regeneratív műanyag gyógyszert fejleszteni ezen vitákon túl, elsősorban nem embrionális őssejtek és egy felnőtt szervezet őssejt-tartalékainak felhasználásával.

Az embrionális őssejt-elkülönítés történeteinek egy része

Terato- (embrió) sejteket izoláltunk -kartsinomnye spontán előforduló testicularis teratoma egértörzs 129 / TER-Sv, spontán petefészek teratoma egérvonalak Lt / Sv, és a teratoma, ektopichno forrás transzplantáltunk sejtek vagy embrionális szövetben. Az így előállított terato- stabil egér vonalak (embrió) -kartsinomnyh egyes sejtek pluripotens, mások vetettük alá differenciálódás csak sejtekben az egy adott típusú, és néhány már általában képtelen citodifferenciációs.

Abban az időben, a hangsúly a kutatás, amely kimutatta egy esetleges visszatérés terato- (embrió) -kartsinomnyh sejtek normális fenotípusú bevezetésük után a fejlődő embrió szövet, valamint a munka, hogy hozzon létre in vitro genetikailag módosított terato- (embrió) -kartsinomnyh sejtek, amelyek segítségével mutáns egereket kaptak az emberi örökletes patológia biológiai modellezéséhez.

Kondicionált szuszpenziós tenyésztést alkalmaztunk a teratogén-embrió-karcinóma sejtvonalak izolálására. A kultúrában terato- (embrió) -kartsinomnye sejtek, mint a gszt, nőnek alkotnak embrióid testek és megkövetelik, hogy le kell fordítani egy vonal kötődési disszociációs fenntartása pluripotencia a tápréteg embrionális fibroblasztok vagy szuszpenzió tenyésztés kondicionált tápközegből. Terato- pluripotens sejtek (embrió) - karcinóma vonalak nagy, gömb alakú, magas aktivitása alkalikus foszfatáz, formája aggregátumok és képesek többirányú differenciálódás. Amikor bejuttatjuk egy blasztocisztából összesítve morulae, így a képződését kiméra embriók, a különböző szervekben és szövetekben, amely származékok leírása megtalálható terato- (embrió) -kartsinomnyh sejtek. Azonban a legtöbb ilyen kiméra embriók meghal a méhben, és a szervek túlélő kimérák újszülött idegen sejtek és ritkán mutatható ki az alacsony sűrűségű. Ugyanakkor a tumorok előfordulását illetően (fibroszarkóma, rabdomioszarkóma, és más típusú rosszindulatú duzzanat és adenoma hasnyálmirigy) meredeken növekszik, és a neoplasztikus degeneráció gyakran fordul elő még a méhen belüli kiméra embriók.

A teratogén-karcinóma sejtek többsége a normál embrionális sejtek mikro-környezetében szinte természetes módon szerez rosszindulatú neoplasztikus tulajdonságokat. Úgy vélik, hogy az irreverzibilis rosszindulatúság a proto-onkogének aktiválódása a strukturális átrendeződések folyamatában. Egy kivétel a sejtvonalak embriokartsinomnoy SST3, teratoma származó egér here (line 129 / Sv-ter), amely erős hasonlóságot mutatnak, képesek integrálódni a szöveteket és szerveket a magzat nélkül az azt követő daganatok kialakulását kiméra egerekben. A teratogén-karcinóma sejtvonalak származékai kiméra egerekben gyakorlatilag nem vesz részt primer gonociták kialakulásában. Nyilvánvaló, hogy össze van kötve egy nagy gyakorisággal kromoszóma a legtöbb terato- (embrió) -kartsinomnyh vonalak, amelyben a sejtek megfigyelt aneuploidia vagy kromoszómális rendellenességet.

A laboratóriumban több humán teratogén-karcinómasejtet állítottak elő, amelyek pluripotenciája, magas proliferatív aktivitása és a tenyészetekben való növekedést megkülönböztető képesség volt. Különösen az emberi teratogén-embrió-karcinóma sejtek NTERA-2 vonalát alkalmaztuk az idegi cytodifferenciáció mechanizmusainak tanulmányozására. Miután ezt a vonalat az újszülött patkányok elővegyületének szubventrikuláris régiójába transzplantálták, migrációjukat és neuronogenezisüket megfigyeltük. Voltak is megkísérli transzplantációs neuronális terato- tenyésztésével kapott sejteket (embrió) -kartsinomnoy vonal NTERA-2, a betegek stroke, amely, a szerzők szerint, ami a klinikai javulást a betegség. Ugyanakkor a teratogén-embrió-karcinóma NTERA-2 vonalbeli malignus átültetett sejtjeinek esetét nem figyelték meg stroke-ban.

Az első sor a differenciálatlan pluripotens embrionális őssejtek egerek a korai 80-es években a múlt század kapott Evans és Martin, kiválasztja azokat a belső cella tömegét hólyagcsíra - embryoblast. Az elszigetelt ESC vonalak hosszú ideig megőrzik a pluripotenciát és képesek különbséget tenni különböző típusú sejtek hatása alatt a tényezők egy speciális táptalaj.

Az „embrionális pluripotens őssejt” tartozik Leroy Stevens, hogy a vizsgálat a dohánytermékek kátrány hatása a gyakorisága a tumor fejlődése felhívta a figyelmet, hogy a spontán tesztikuláris teratokarcinóma lineáris (129 / V) egerek a kontroll csoport. Here teratokarcinóma sejteket jellemző a magas proliferációs ráta, és a folyadék jelenlétét maradt a hasüregbe, a kialakulását spontán neuronok differenciálódását, keratinociták, a kondrociták, szívizomsejtek, valamint a haj és a csont fragmentumok, de nem tüntették fel a rendezett cytoarchitectonics megfelelő szövetben. Amikor ültetés teratokarcinóma sejttenyészetben növesztett leválasztható a szubsztrát pluripotens klónok és képződött embrióid testeket ezután leállítjuk, és vetjük alá a spontán hasadási rendellenes differenciálódni neuronok, glia, izomsejtek és szívizomsejtek. Stevens találtuk, hogy teratokarcinóma egér 129 / V kevesebb, mint 1% a sejtek differenciálódni képes a különféle speciális szomatikus vonal, és önmagában differenciálódási tényezőktől függ, amelyek befolyásolják őket (összetétel a peritoneális folyadékban, a termékeket adunk a tenyészethez az érett sejtek vagy szövetek). Leroy Stevenson feltételezés jelenlétében körében teratokarcinóma sejtek embrionális progenitor szexuális csírasejtek igazoltuk: a szuszpenziót embryoblast implantáció előtti embriók sejtek felnőtt egér szövetekben képződött teratokarcinóma, és el kell őket tiszta sejtvonalak, intraperitoneális adagolás esetén a recipiens állatok differenciálódott neuronok, szívizomsejtek és más szomatikus kletki származékai mindhárom csíralemezek. In vivo kísérletekben transzplantáció ESK (nyert embryoblast de nem trofoblaszt) egér embriók különböző szakaszaiban vonalak 8-32 blasztoméra véget ért születési a kiméra állat (nincs tumor képződés) szervekben, amely érzékeli, kelbimbó donor szövetet. Kiméraképződést megfigyelhető még a sorban a nemi sejteket.

Primer progenitor csírasejtek izolált egér embrió csíra szex, morfológia, immunológiai fenotípus és funkcionális jellemzői összhangban hESCs származó teratokarcinóma Stevenson és embryoblast. A kimérák született beadása után hESCs egy blasztocitába, allofenny szervi morfogenezis jellemezve mozaik váltakozó donor és a recipiens szerkezeti és funkcionális egységek a máj, a tüdő és a vese. Számos esetben megfigyelték a máj intesztinális kriptáinak vagy lobulájának kialakulását, amely egyidejűleg a recipiens és a donorsejtekből állt. Mindazonáltal a Morphogenezis megvalósítása mindig a faj genetikai programja szerint következett be, amelyhez a recipiens tartozik, és a kimérizmus kizárólag a sejtszintre korlátozódik.

Ezután azt találták, hogy a elterjedése hESCs nélkül citodifferenciációs egy tápréteg-eredetű mesenchymalis sejtek (magzati fibroblasztok) jelenlétében megy végbe a LIF kötelező szelektív táptalajon, amely szelektív módon csak a túlélését ős- és progenitorsejtek, míg a túlnyomó többsége a speciális sejtes elemek meghal. Segítségével ezek a technikák által 1998-ban James Thomson különítettek öt halhatatlanná sor az embrionális őssejtek a belső cella tömegét blasztociszta személy. Ugyanebben az évben John Gerhart kifejlesztett egy módszert elkülönítésére halhatatlan ESC vonalak a szexuális puff 4-5 hetes emberi embriók. Köszönhetően egyedülálló tulajdonságokkal, csak két évvel később az embrionális őssejtek és a sejtek végleges szöveti megkezdődött kell használni a gyakorlatban a regeneratív orvoslás és a génterápia.