Mesenchymális őssejtek

A regionális őssejtek között különleges helyet foglalnak el a mezenchimális őssejtek (MSC-k), amelyek származékai alkotják az emberi test összes szervének és szövetének stromális mátrixát. Az MSC-kutatásban az orosz biológiai tudomány képviselői élveznek prioritást.

A múlt század közepén A. Friedenstein laboratóriumában először izoláltak homogén, multipotens csontvelői stromális őssejtekből álló kultúrát. A szubsztráthoz tapadt mezenchimális őssejtek hosszú ideig magas proliferációs intenzitást tartottak fenn, és a szubsztráton történő fixálás után alacsony vetéssűrűségű tenyészetekben fibroblasztszerű sejtek klónjait képezték, amelyek nem rendelkeztek fagocita aktivitással. Az MSC proliferáció megszűnése spontán differenciálódással végződött in vitro csont-, zsír-, porc-, izom- vagy kötőszöveti sejtekké. További vizsgálatok lehetővé tették a különböző emlősfajok csontvelői stromájában található fibroblasztszerű sejtek oszteogén potenciáljának, valamint telepképző aktivitásának megállapítását. In vivo kísérletek kimutatták, hogy a telepképző fibroblasztszerű sejtek mind hetero-, mind ortotopikus átültetése csont-, porc-, rostos és zsírszövet kialakulásához vezet. Mivel a csontvelői stromális őssejtekre jellemző a nagyfokú önmegújulási képesség és a sokrétű differenciálódás egyetlen sejtvonalon belül, multipotens mezenchimális progenitor sejteknek nevezik őket.

Meg kell jegyezni, hogy a mezenchimális őssejtekkel kapcsolatos alapkutatások több mint 45 évének során valódi feltételeket teremtettek származékaik klinikai gyakorlatban történő alkalmazásához.

Ma már kétségtelen, hogy az emberi test minden szövete különböző sejtvonalak őssejtjeiből alakul ki a proliferáció, migráció, differenciálódás és érés folyamatainak eredményeként. Azonban egészen a közelmúltig azt hitték, hogy egy felnőtt szervezet őssejtjei szövetspecifikusak, azaz csak azokban a szövetekben képesek specializálódott sejtek vonalait létrehozni, amelyekben elhelyezkednek. Ezt az elméleti álláspontot cáfolták azok a tények, hogy a hematopoietikus őssejtek nemcsak a perifériás vér sejtes elemeivé, hanem a máj ovális sejtjeivé is átalakulnak. Ezenkívül a neurális őssejtek képesek mind neuronok, mind gliaelemek, valamint a hematopoietikus progenitor sejtek korai elkötelezett vonalainak létrehozására. A mezenchimális őssejtek viszont, amelyek általában csont-, porc- és zsírszövet sejtes elemeit termelik, képesek idegi őssejtekké alakulni. Feltételezik, hogy a növekedés, a fiziológiai és reparatív szövetregeneráció során nem elkötelezett progenitor sejtek keletkeznek a szövet-nem specifikus őskészletekből. Például az izomszövet regenerációja a csontvelőből a vázizmokba vándorló mezenchimális őssejtek révén valósítható meg.

Bár az őssejtek ilyen jellegű keresztcserélhetőségét nem minden kutató ismeri el, a mezenchimális őssejtek klinikai felhasználásának lehetőségét sejttranszplantáció forrásaként és a genetikai információ sejtes vektoraként már senki sem vitatja, ahogy a csontvelői stromális őssejtek multipotenciáját sem, amelyek viszonylag könnyen izolálhatók és in vitro kultúrában szaporíthatók. Ugyanakkor a csontvelői stromális őssejtek potenciális pluripotenciájáról szóló jelentések továbbra is megjelennek a tudományos szakirodalomban. Bizonyítékként olyan kutatási protokollokat idéznek, amelyekben specifikus transzdifferenciálódási induktorok hatására az MSC-k idegsejtekké, szívizomsejtekké és hepatocitákká alakulnak át. Egyes tudósoknak azonban komoly kétségeik vannak a korai embriogenezis időszakából származó gének ismételt aktiválásának és expressziójának lehetőségével kapcsolatban. Ugyanakkor mindenki megérti, hogy ha megtalálják a feltételeket a mezenchimális őssejtek multipotenciájának az ESC-k pluripotenciájára való kiterjesztéséhez, akkor a regeneratív plasztikai medicina számos etikai, erkölcsi, vallási és jogi problémája automatikusan megoldódik. Továbbá, mivel ebben az esetben a regeneratív őssejt-potenciál forrásává a beteg autológ stromális sejtjei válnak, a sejttranszplantáció immunkilökődésének problémája is megoldódik. A közeljövő fogja megmutatni, mennyire reálisak ezek a kilátások.

[ 1 ], [ 2 ]

Mezenchimális őssejtek alkalmazása az orvostudományban

A klinikumban a mezenchimális őssejt-származékok alkalmazása elsősorban a kiterjedt és mély termikus bőrelváltozások esetén előforduló szöveti defektusok helyreállításával kapcsolatos. A preklinikai szakaszban kísérleti értékelést végeztek az allogén fibroblaszt-szerű mezenchimális őssejtek mély égési sérülések kezelésére való alkalmazásának megvalósíthatóságáról. Kimutatták, hogy a csontvelő fibroblaszt-szerű mezenchimális őssejtjei egyrétegű tenyészetet alkotnak, ami lehetővé teszi átültetésüket a mély égési sebek regenerációs folyamatainak optimalizálása érdekében. A szerzők megjegyzik, hogy az embrionális fibroblasztok hasonló tulajdonsággal rendelkeznek, de klinikai alkalmazásukat a meglévő etikai és jogi problémák korlátozzák. Wistar patkányokon modellezték a bőr minden rétegének károsodásával járó mély termikus égést. Az égési terület a teljes bőrfelület 18-20%-a volt. Az első kísérleti csoportba mély termikus égéssel rendelkező patkányok tartoztak, akikre allogén fibroblaszt-szerű mezenchimális őssejteket ültettek át. A második csoportba mély termikus égéssel rendelkező állatok tartoztak, akikre allogén embrionális fibroblaszt-szerű mezenchimális őssejteket ültettek át. A harmadik csoportot mély termikus égéssel rendelkező kontrollpatkányok képviselték, akik nem estek át sejtterápián. Fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek és embrionális fibroblasztok szuszpenzióját pipettával 2 x ¹⁰⁴ mennyiségben vittük fel az égési seb felületére.A sejteket az égés modellezése és a keletkezett nekrotikus varasodás eltávolítása utáni 2. napon kezelték. A sejtátültetés után az égési felületet gentamicint tartalmazó izotóniás nátrium-klorid-oldattal megnedvesített gézszalvétával fedték le. Csontvelősejteket gyűjtöttek MSC-k kinyerésére, majd ezeket felnőtt Wistar patkányok combcsontjaiból származó fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek vonalába indukciójukkal. Az embrionális fibroblasztokat 14-17 napos embriók tüdejéből nyerték. Az MSC-k kinyerésére szolgáló embrionális fibroblasztokat és csontvelősejteket előzetesen Petri-csészékben tenyésztették 37°C hőmérsékleten CO2 inkubátorban, 5% CO2-tartalmú atmoszférában, 95% páratartalom mellett. Az embrionális fibroblasztokat 4-6 napig tenyésztették, míg az MSC-k monorétegének kialakulása 14-17 napot igényelt. Ezt követően az MSC-ket kriokonzerválták a fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek forrásanyagaként, amelyeket az MSC-k 4 napos kiolvasztásával és tenyésztésével nyertek. A képződött fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek száma több mint háromszorosa volt az ugyanazon tenyésztési időszak alatt képződött embrionális fibroblasztok számának. Az égési sebekben átültetett sejtek azonosításához a tenyésztési szakaszban genomjukat egy, az E. coli ß-galaktozidázt kódoló 1ac-2 gént hordozó rekombináns V típusú adenovíruson alapuló virális ingázó vektorral jelölték. Az átültetés utáni különböző időpontokban élő sejteket immunhisztokémiailag detektálták krioszekciókban X-Gal szubsztrát hozzáadásával, amely jellegzetes kékeszöld színt ad. Az égési seb állapotának dinamikus vizuális, planimetrikus és hisztológiai értékelésének eredményeként megállapították, hogy már a sejtátültetést követő 3. napon jelentős különbségek mutatkoznak a sebfolyamat lefolyásában a kiválasztott csoportokban. Ez a különbség különösen a sejtátültetést követő 7. napon vált szembetűnővé. Az első csoport állatainál, amelyekbe fibroblasztszerű mezenchimális őssejteket ültettek át, a seb egyenletesen intenzív rózsaszín színt kapott, a granulációs szövet teljes területén az epidermisz szintjéig nőtt, és az égési felület mérete jelentősen csökkent. A sebfelszínen képződött kollagénfilm némileg elvékonyodott, de továbbra is befedte a teljes égési területet. A második csoport állatainál, amelyekbe embrionális fibroblasztokat ültettek át, a granulációs szövet a sebszélek epidermiszének szintjéig emelkedett, de csak helyenként, míg a sebből származó plazmorrhea intenzívebb volt, mint az első csoportban, és a kezdetben kialakult kollagénfilm gyakorlatilag eltűnt. Azoknál az állatoknál, amelyek nem kaptak sejtterápiát, a 7. napon az égési seb halvány, gödrös, fibrinnel borított nekrotikus szövet volt. Plazmoreát figyeltek meg az egész égési felületen. Hisztológiailag az 1. és 2. csoport állatai a sejtes infiltráció csökkenését és az érhálózat fejlődését mutatták,és a kezdődő regenerációs folyamat ezen jelei az 1. csoport patkányainál kifejezettebbek voltak. A kontrollcsoportban a seb sejtes infiltrációjának jeleit figyelték meg, az újonnan képződött erek szövettani mintázata hiányzott. A megfigyelés 15-30. napján az 1. csoport állatainál az égési felület területe szignifikánsan kisebb volt, mint a többi csoport patkányainál, és a granulációs felület fejlettebb volt. A 2. csoport állatainál az égési felület területe szintén csökkent a kontrollcsoport patkányainál lévő égési sebek méretéhez képest, amelyek a marginális hámosodás miatt alakultak ki. A kontrollcsoportban az égési felület helyenként sápadt maradt, ritka granulációkkal, vaszkuláris csillagok jelentek meg rajta, fibrines plakk-szigetek voltak, a mérsékelt plazmorrhea az egész égési felületen folytatódott, és egyes helyeken nehezen elválasztható varasodás maradt fenn. Általánosságban elmondható, hogy a 3. csoport állatainál a seb mérete is csökkent, de a seb szélei aláhúzottak maradtak.

Így a fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek és az embrionális fibroblasztok, valamint a sejtterápia alkalmazása nélküli sebgyógyulási sebesség összehasonlító vizsgálata során a fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek és az embrionális fibroblasztok transzplantációjának eredményeként az égési felület gyógyulási sebességének felgyorsulását figyelték meg. Azonban allogén fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek alkalmazása esetén a sebgyógyulás sebessége magasabb volt, mint az embrionális fibroblasztok transzplantációja esetén. Ez a regenerációs folyamat fázisváltozásának felgyorsulásában nyilvánult meg - a sejtes infiltráció ideje csökkent, az érhálózat növekedésének sebessége nőtt, valamint a granulációs szövet képződése.

A dinamikus planimetria eredményei azt mutatják, hogy az égési seb spontán gyógyulásának aránya (sejtterápia alkalmazása nélkül) volt a legalacsonyabb. Az allogén fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek transzplantációja utáni 15. és 30. napon a sebgyógyulás aránya magasabb volt, mint az embrionális fibroblasztok transzplantációja esetén. A béta-galaktozidáz kimutatására szolgáló hisztokémiai módszer kimutatta, hogy a fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek és az embrionális fibroblasztok transzplantációja után az átültetett sejtek életképesek maradnak a regenerálódó sebek felszínén és mélységében a teljes megfigyelési időszak alatt. A szerzők úgy vélik, hogy a fibroblasztszerű mezenchimális őssejtek alkalmazásával az égési seb regenerálódásának magasabb aránya az érési folyamat során ezen sejtek által felszabaduló biológiailag aktív növekedést stimuláló faktoroknak köszönhető.

Az égési sebek kezelésére auto- vagy allogén keratinociták és allogén fibroblasztok transzplantációját a klinikai gyakorlatban is alkalmazzák. Meg kell jegyezni, hogy a kiterjedt, mély égési sérülésekkel küzdő gyermekek sebészeti kezelése összetett feladat a magas traumatikus jelleg és a többszörös sebészeti beavatkozások, a jelentős vérveszteség és az alkalmazott infúziós közegekre adott különféle reakciók miatt. A testfelület 40%-át meghaladó kiterjedt, mély égési sérülések bőrplasztikai műtéteinek fő nehézségei az áldozatok állapotának súlyosságából és a donor bőrforrások hiányából adódnak. A magas perforációs együtthatójú hálós transzplantációk alkalmazása nem oldja meg a problémát, mivel a perforáció után képződő sejtek nagyon lassan hámlanak, és maguk a bőrlebenyek gyakran lizálnak vagy kiszáradnak. Az égési sebek olyan bevonatai, mint a xenoszkin, a holttestekből származó allograftok, a szintetikus filmbevonatok, nem mindig elég hatékonyak, ezért új módszereket fejlesztenek ki az égési felületek tenyésztett keratinociták és fibroblasztok rétegeivel történő bevonására. Különösen egy olyan módszert javasoltak, amelynek során az égési felületeket tenyésztett allofibroblasztok segítségével vonják be, amelyek átültetéskor kifejezett stimuláló hatást gyakorolnak a határeseti égések sebben megőrzött epidermocitáinak, valamint a hálós transzplantátumok szeptumában lévő keratinocitáknak a proliferációjára. L. Budkevich és társszerzői (2000) munkája bemutatja a módszer gyermekek égési sérüléseinek kezelésében való alkalmazásának eredményeit. A vizsgálatban 31, 1 és 14 év közötti termikus traumában szenvedő gyermek vett részt. Három gyermeknél a IIIA-B - IV. fokozatú égési sebek teljes területe a testfelület 40%-át, 25 gyermeknél 50-70%-át, további három gyermeknél pedig 71-85%-át tette ki. A korai sebészeti nekrektómiát tenyésztett allofibroblasztok átültetésével és autodermoplasztikával kombinálták. A kezelés első szakaszában a nekrotikus szövetek kimetszését, a második szakaszban tenyésztett allofibroblasztokat ültettek be hordozófóliára, a harmadik szakaszban (a tenyésztett allofibroblasztok átültetése után 48 órával) pedig a mátrix eltávolítását és autodermoplasztikát végeztek bőrlebenyekkel, 1:4 perforációs arányban. Három, súlyos égési betegséggel klinikára felvett betegnél tenyésztett allofibroblasztokat ültettek be granulációs sebekre. Tenyésztett allofibroblasztok átültetésére 18 gyermeknél egyszer, 11 gyermeknél kétszer, két betegnél pedig háromszor került sor. A sejtkultúrával borított sebfelület területe 30 és 3500 cm2 között mozgott. A tenyésztett allofibroblasztok hatékonyságát a bőrgraftok beágyazódásának teljes százalékos aránya, az égési gyógyulási idő és a súlyos termikus trauma okozta halálesetek száma alapján értékelték. A graft beágyazódása a betegek 86%-ánál teljes volt. A bőrgraftok részleges beágyazódásának elmaradását az esetek 14%-ában figyelték meg. A kezelés ellenére hat (19,3%) gyermek meghalt. A bőrkárosodás teljes területe a testfelület 40-70%-át tette ki.A tenyésztett allofibroblasztok transzplantációja egyetlen betegnél sem mutatott összefüggést az égési sérülések okozta halálozással.

A kezelési eredményeket elemezve a szerzők megjegyzik, hogy a korábban a testfelület 35-40%-át lefedő mély termikus bőrkárosodást az élettel összeegyeztethetetlennek tekintették (kisebb gyermekek - 3 éves korig - a testfelület 30%-át lefedő mély égések kritikusak, idősebb gyermekek - a testfelület több mint 40%-át lefedőek). A tenyésztett allofibroblasztok átültetésével és az azt követő, magas perforációs együtthatójú bőrlebenyekkel végzett sebészeti nekrektómia és az azt követő autodermoplasztika során a IIIB-IV fokú égések továbbra is kritikusak, de jelenleg sok esetben még az ilyen áldozatok életének megmentésére is van kilátás. A mély égési sérülésekkel küzdő gyermekeknél a sebészeti nekrektómia tenyésztett allofibroblasztok átültetésével és autodermoplasztikával kombinálva különösen hatékonynak bizonyult a kiterjedt bőrelváltozásokkal küzdő betegeknél, akiknek kevés a donorhelyük. Az aktív sebészeti taktika és a tenyésztett allofibroblasztok átültetése hozzájárul az ilyen betegek általános állapotának gyors stabilizálódásához, az égési betegségek fertőző szövődményeinek számának csökkenéséhez, a transzplantátumok beágyozódásához kedvező feltételek megteremtéséhez, az elveszett bőr helyreállításának idejének és a fekvőbeteg-kezelés időtartamának csökkentéséhez, valamint a halálos kimenetelű esetek gyakoriságának csökkenéséhez a kiterjedt égési sérülésekkel küzdő áldozatoknál. Így a tenyésztett allofibroblasztok átültetése, majd az azt követő bőrlebenyes autodermoplasztika lehetővé teszi a súlyos égési sérülésekkel küzdő gyermekek felépülését, akiket korábban halálra ítéltnek tartottak.

Általánosan elfogadott, hogy az égési sérülések kezelésének elsődleges célja a sérült bőr legteljesebb és leggyorsabb helyreállítása a toxikus hatások, a fertőző szövődmények és a kiszáradás megelőzése érdekében. A tenyésztett sejtek alkalmazásának eredményei nagymértékben függenek az égési seb transzplantációra való alkalmasságától. A tenyésztett keratinociták sebészeti nekrektómia utáni sebfelszínre történő átültetése esetén az átültetett sejtek átlagosan 55%-a (területre vetítve) beágyazódik, míg granulációs sebek esetén a beágyazódási arány 15%-ra csökken. Ezért a kiterjedt, mély bőrégések sikeres kezeléséhez elsősorban aktív sebészeti taktikára van szükség. IIIB-IV. fokú égési sebek esetén az égési felületet azonnal megszabadítják a nekrotikus szövettől, hogy csökkentsék a mérgezést és az égési sérülések szövődményeinek számát. Az ilyen taktika alkalmazása kulcsfontosságú az égési sérülés beérkezésétől a sebek záródásáig eltelt idő, valamint a kiterjedt égési sérülésekkel küzdő betegek kórházi tartózkodásának időtartamának csökkentéséhez, és jelentősen csökkenti a halálos kimenetelűek számát is.

Az égési felületek bevonására tenyésztett keratinociták sikeres alkalmazásáról szóló első beszámolók az 1980-as évek elején jelentek meg. Ezt a manipulációt később tenyésztett keratinociták rétegeivel végezték, amelyeket leggyakrabban autosejtekből, sokkal ritkábban allokeratinocitákból nyertek. Az autokeratinocitoplasztika technológiája azonban nem teszi lehetővé sejtbank létrehozását, miközben a megfelelő területű keratinocita-transzplantáció előállításához szükséges idő hosszú, 3-4 hét. Ebben az időszakban jelentősen megnő az égési betegség fertőző és egyéb szövődményeinek kialakulásának kockázata, ami jelentősen meghosszabbítja a betegek kórházi tartózkodásának teljes idejét. Ezenkívül az autokeratinociták gyakorlatilag nem gyökereznek meg, ha granulációs égési sebekre ültetik át őket, és a speciális növekedési táptalajok és a keratinocita-növekedést biológiailag aktív stimulátorok magas költsége jelentősen korlátozza klinikai alkalmazásukat. Más biotechnológiai módszerek, mint például a kollagénplasztika, a kriokonzervált xenoszkin átültetése és a különböző biopolimer bevonatok alkalmazása növelik a kiterjedt felületes, de nem a mély égések kezelésének hatékonyságát. A sebfelszín tenyésztett fibroblasztokkal történő bevonásának módja alapvetően eltér abban, hogy a tenyésztett sejtréteg fő alkotóelemeként fibroblasztokat, nem pedig keratinocitákat használnak.

A módszer kifejlesztésének előfeltétele az az adat volt, hogy a kis ereket körülvevő periciták progenitor mezenchimális sejtek, amelyek képesek fibroblasztokká átalakulni, amelyek számos növekedési faktort termelnek, és biztosítják a sebgyógyulást a keratinociták proliferációjára és adhéziójára gyakorolt erős stimuláló hatásuk miatt. A tenyésztett fibroblasztok sebfelszínek lezárására való alkalmazása azonnal feltárta a módszer számos jelentős előnyét a tenyésztett keratinociták alkalmazásával összehasonlítva. Különösen a fibroblasztok tenyészetben történő kinyerése nem igényel speciális táptalajok és növekedési stimulánsok alkalmazását, ami több mint tízszeresére csökkenti a transzplantáció költségeit a keratinociták kinyerésének költségéhez képest. A fibroblasztok könnyen passziválódnak, aminek során részben elveszítik a felszíni hisztokompatibilitási antigéneket, ami viszont lehetőséget teremt allogén sejtek felhasználására transzplantátumok előállításához és bankjaik létrehozásához. A klinikumban használatra kész transzplantátumok előállításához szükséges idő 3 hétről (keratinociták esetében) 1-2 napra (fibroblasztok esetében) csökken. Primer fibroblaszt tenyészetet az autodermoplasztika során vett bőrdarabokból származó sejtek tenyésztésével lehet előállítani, és ^az emberi fibroblaszt szubkultúrák előállításához szükséges sejtsűrűség mindössze 20 x ^103/1 cm2.

A fibroblasztok és szabályozó fehérjéik keratinociták proliferációjára és differenciálódására gyakorolt hatásának vizsgálata érdekében összehasonlító elemzést végeztek a keratinociták morfológiájáról és proliferációjáról I. és III. típusú kollagén szubsztrátjain, valamint fibronektinen, humán fibroblasztokkal közös tenyészetben. Humán keratinocitákat izoláltak égési sérült betegek autodermoplasztika során vett bőrdarabjaiból. A keratinocita vetési sűrűsége 50 x 103 sejt/cm2 volt. A tenyésztett fibroblaszt transzplantáció klinikai hatékonyságát 517 betegen értékelték. Minden beteget két csoportra osztottak: 1. csoport - IIA, B-IV fokú égési sérülésekkel rendelkező felnőtt áldozatok; 2. csoport - IIIB-IV fokú mély égési sérülésekkel rendelkező gyermekek. Az egyrétegű fibroblaszt tenyészet szerkezeti és funkcionális szerveződésének dinamikájának értékelése, figyelembe véve a glükózaminoglikánok, a fibronektin és a kollagén szerepét a regenerációs folyamatokban, lehetővé tette a szerzők számára, hogy a 3. napot határozzák meg a fibroblaszt tenyészetek transzplantációkhoz való felhasználásának legkedvezőbb időszakának. A fibroblasztoknak a keratinociták proliferációjára és differenciálódására gyakorolt hatásának vizsgálata kimutatta, hogy az in vitro fibroblasztok kifejezett stimuláló hatást fejtenek ki, elsősorban a keratinocita adhéziós folyamatokra, több mint kétszeresére növelve a tapadt sejtek számát és fixációjuk sebességét. Az adhéziós folyamatok stimulációját a DNS-szintézis intenzitásának és a keratinocita proliferáció szintjének növekedése kíséri. Ezenkívül kiderült, hogy a fibroblasztok és az általuk képződő extracelluláris mátrix jelenléte szükséges feltétele a keratinociták tonofibrilláris apparátusának kialakulásának, az intercelluláris kapcsolatoknak, és végső soron a keratinociták differenciálódásának és a bazális membrán kialakulásának. Mély égési sérülésekkel küzdő gyermekek kezelésében az allofibroblaszt kultúra transzplantációjának magas klinikai hatékonyságát állapították meg, különösen a donorhely hiányában kiterjedt bőrelváltozásokkal rendelkező betegek csoportjában. Egy átfogó morfofunkcionális vizsgálat kimutatta, hogy a transzplantációs fibroblasztokat a DNS, valamint a kollagén, a fibronektin és a glikozaminoglikánok aktív szintézise jellemzi, amelyek a sejtek által képződő extracelluláris mátrix részét képezik. A szerzők rámutatnak a transzplantált fibroblasztok magas beágyazódási arányára (akár 96%), a beérkezésük idejének jelentős csökkenésére (24-48 órán belül a keratinociták alkalmazása esetén alkalmazott 2-3 hét helyett), az égési felület hámképződésének jelentős felgyorsulására, valamint a fibroblasztokból történő transzplantáció technológiájának költségeinek jelentős (tízszeres) csökkenésére a keratinocita-transzplantációhoz képest. A tenyésztett allofibroblasztok transzplantációja lehetővé teszi a súlyos égési sérülésekkel - a testfelület több mint 50%-át érintő hőkárosodással - küzdő gyermekek életének megmentését.amelyet korábban az élettel összeegyeztethetetlennek tartottak. Meg kell jegyezni, hogy az allogén embrionális fibroblasztok átültetésével nemcsak a különböző fokú és területű égési sérülésekkel küzdő betegek gyorsabb sebregenerációja és felépülése, hanem a halálozásuk jelentős csökkenése is meggyőzően bizonyított.

Az autológ fibroblasztokat a plasztikai sebészet olyan összetett területén is alkalmazzák, mint a hangszálsérülések rekonstrukciós korrekciója. Erre a célra általában szarvasmarha-kollagént használnak, amelynek hatástartamát immunogenitása korlátozza. Mivel idegen fehérje, a szarvasmarha-kollagén érzékeny a recipiens kollagenázára, és immunreakciókat válthat ki, amelyek kockázatának csökkentése érdekében glutaraldehiddel térhálósított kollagénkészítmények előállítására szolgáló technológiákat fejlesztettek ki. Előnyük a nagyobb stabilitás és az alacsonyabb immunogenitás, amely gyakorlati alkalmazást talált a hangszálak hibáinak és sorvadásának kiküszöbölésében. Az autológ kollagén injekcióit először 1995-ben alkalmazták. A technika biztosította az autológ kollagénrostok elsődleges szerkezetének megőrzését, beleértve a molekulán belüli enzimatikusan katalizált keresztkötéseket is. A tény az, hogy a természetes kollagénrostok jobban ellenállnak a proteázok általi roncsolásnak, mint a rekonstruált kollagén, amelyben a telopeptidek el vannak vágva. A telopeptidek integritása fontos a kollagénrostok kvaterner szerkezete és a szomszédos kollagénmolekulák közötti keresztkötések kialakulásához. A szarvasmarha-kollagén készítményekkel ellentétben az autológ kollagén nem okoz immunreakciókat a recipiensben, de nem elég hatékony pótlószerként. Stabil korrekció érhető el lokális kollagéntermeléssel autológ fibroblasztok transzplantációjával. Az autológ fibroblaszt transzplantáció klinikai hatékonyságának vizsgálata során azonban bizonyos nehézségeket azonosítottak. A fibroblaszt transzplantáció utáni korai időszakban a klinikai hatás gyengébb volt, mint a szarvasmarha-kollagén bevezetése utáni. Autológ fibroblasztok tenyésztésekor nem zárható ki annak a lehetősége, hogy a normál fibroblasztok patológiássá, úgynevezett miofibroblaszttá alakulnak át, amelyek a fibrózis és a hegképződés kialakulásáért felelősek, amint azt a fibroblasztok és a kollagén fibrillumok specifikus kölcsönhatása által okozott kollagén gél összehúzódása is bizonyítja. Ezenkívül az in vitro sorozatos passzázsok után a fibroblasztok elveszítik az extracelluláris mátrixfehérjék szintézisének képességét.

Azonban kísérleti úton kifejlesztettek egy módszert az autológ humán fibroblasztok tenyésztésére, amely kiküszöböli a fent említett hiányosságokat, és nem eredményezi a normál fibroblasztok onkogén átalakulását. Az ezzel a módszerrel nyert autológ fibroblasztokat az arc lágy szöveteinek hibáinak helyreállítására használják. G. Keller és munkatársai (2000) egyik tanulmányában 20, 37 és 61 év közötti, ráncokkal és atrófiás hegekkel küzdő beteget kezeltek. A retroaurikuláris régióból vett bőrbiopsziákat (4 mm) 10 ml táptalajt (Eagle-táptalaj antibiotikummal, mikoszeptikummal, piruváttal és magzati borjúszérummal) tartalmazó steril kémcsövekben szállították a laboratóriumba. Az anyagot 3-5 db 60 mm átmérőjű tenyésztőedénybe helyezték, és 5% CO2-t tartalmazó atmoszférában termosztátban inkubálták. 1 hét elteltével a sejteket tripszinnel eltávolították a csészékből, és 25 cm2-es fiolákba helyezték. A sejteket 4 x 107 mennyiségben injektálták a betegekbe. Jelentős és tartós klinikai hatást figyeltek meg a nasolabiális redők korrekciója során szenvedő betegeknél, valamint a hegeknél az autológ fibroblasztok harmadik transzplantációja után 7 és 12 hónappal. Az áramlási citometria szerint a tenyésztett fibroblasztok nagy mennyiségű I. típusú kollagént termeltek. Az in vitro vizsgálatok kimutatták az injektált fibroblasztok normális kontraktilitását. A tenyésztett fibroblasztok 4 x 107 sejtes dózisban történő szubkután beadása után két hónappal nem észleltek daganatot a meztelen egerekben. Az injektált fibroblasztok nem okoztak hegesedést vagy diffúz fibrózist a betegeknél. A szerző szerint a beültetett autológ fibroblasztok képesek folyamatosan kollagént termelni, ami kozmetikai fiatalító hatást biztosít. Ugyanakkor, mivel a differenciálódott sejtek élettartama korlátozott, a fiatal betegektől vett fibroblasztok hatékonyabbak, mint az idős emberektől kapottak. A jövőben feltételezhető, hogy lehetőség lesz egy fiatal donortól vett fibroblaszt kultúra krioprezerválására, hogy később saját fiatal sejteket lehessen átültetni egy idős betegbe. Összefoglalva, nem teljesen helytálló az a következtetés, hogy az autológ fibroblasztok, feltéve, hogy funkcionálisan konzerváltak, ideális eszközt jelentenek az arc lágy szöveteinek hibáinak korrekciójára. Ugyanakkor maga a szerző is megjegyzi, hogy a vizsgálat során néhány problémás helyzet merült fel az autológ fibroblaszt-kollagén rendszer alkalmazásával kapcsolatban. A klinikai hatás gyakran gyengébb volt, mint a szarvasmarha-kollagén alkalmazása esetén, ami csalódást okozott a betegeknél.

Általánosságban elmondható, hogy a mezenchimális őssejtek klinikai alkalmazásának kilátásairól szóló irodalmi adatok meglehetősen optimistáknak tűnnek. Kísérletet tesznek autológ csontvelői multipotens mezenchimális progenitor sejtek alkalmazására degeneratív ízületi elváltozások kezelésére. A tenyésztett mezenchimális progenitor sejtek komplex csonttörések kezelésében történő alkalmazásának első klinikai vizsgálatait végzik. Az auto- és allogén mezenchimális csontvelői stromális sejteket porcszövet létrehozására használják transzplantációhoz trauma vagy autoimmun elváltozások okozta ízületi porchibák korrekciója során. Módszereket fejlesztenek a multipotens mezenchimális progenitor sejtek klinikai alkalmazására a csonthibák kiküszöbölésére olyan gyermekeknél, akiknél az I. típusú kollagén gén mutációi okozzák a hiányos oszteogenezis súlyos formáját. A mieloabláció után a recipiens gyermekekbe HLA-kompatibilis egészséges donoroktól származó csontvelőt transzplantálnak, mivel a frakcionálatlan csontvelő elegendő számú mezenchimális őssejtet tartalmazhat a súlyos csonthiba kompenzálására. Allogén csontvelő transzplantációja után ezeknél a gyermekeknél pozitív szövettani változásokat figyeltek meg a trabekuláris csontokban, a növekedési ütem növekedését és a csonttörések előfordulásának csökkenését. Bizonyos esetekben pozitív klinikai eredményt érnek el közeli rokonságban álló allogén csontvelő és oszteoblasztok átültetésével. Az MSC transzplantációt a csontszövetben az oszteoblasztok és oszteoklasztok egyensúlyhiánya okozta veleszületett csonttörékenység kezelésére is alkalmazzák. Ebben az esetben a csontképződés helyreállítását a betegek csontszövetében található ős- és progenitor stromális sejtek készletének kimerizációjával érik el.

Folytatódik a donor mezenchimális őssejtek genetikai módosításának módszereinek fejlesztése a stromális szövetek genetikai hibáinak korrekciója céljából. Feltételezhető, hogy a közeljövőben a mezenchimális progenitor sejteket a neurológiában fogják alkalmazni az agysejtek célzott kimerizációjára és egészséges sejtkészlet létrehozására, amelyek képesek a betegség klinikai megnyilvánulásaiért felelős hiányos enzimet vagy faktort termelni. A mezenchimális őssejtek transzplantációja felhasználható a csontvelő sztrómájának helyreállítására rákos betegeknél radio- és kemoterápia után, valamint csontvelősejtekkel kombinálva a vérképzés helyreállítására. A mozgásszervi rendellenességek MSC-k segítségével történő kiküszöbölését célzó helyettesítő terápia fejlesztését elősegítik a mátrix bioanyagok vagy biomimetikumok tervezése területén elért mérnöki fejlesztések, amelyek mezenchimális őssejtek utódai által benépesített vázakat képeznek.

A mezenchimális őssejtek forrásai

A mezenchimális őssejtek fő forrása a csontvelő, amelynek vérképző őssejtjei az emlősök testében folyamatosan vér- és immunsejtté differenciálódnak, míg a mezenchimális őssejteket a csontvelő sztrómájának fibroblasztszerű sejtjeinek kis populációja képviseli, és hozzájárul a hematopoietikus őssejtek differenciálatlan állapotának megőrzéséhez. Bizonyos körülmények között a mezenchimális őssejtek porc- és csontszövetsejtekké differenciálódnak. Alacsony sűrűségű ültetési körülmények között táptalajra oltva a csontvelő mononukleáris stromális sejtjei adhéziós sejtek telepeit alkotják, amelyek valójában fibroblasztszerű multipotens mezenchimális progenitor sejtek. Egyes szerzők úgy vélik, hogy a nem elköteleződött mezenchimális őssejtek a csontvelőben rakódnak le, amelyek önmegújító képességük és magas differenciálódási potenciáljuk miatt az emlős szervezetének teljes élete során a test minden szövetét ellátják a stromális elemek mezenchimális prekurzoraival.

A csontvelőben a stromális sejtes elemek hálózatot alkotnak, kitöltve a sinusoidok és a csontszövet közötti teret. Egy felnőtt csontvelőjében a szunnyadó MSC-k mennyisége összehasonlítható a hematopoietikus őssejtek mennyiségével, és nem haladja meg a 0,01-0,001%-ot. A csontvelőből izolált és tenyésztésnek alá nem vetett mezenchimális őssejtek mentesek az adhéziós molekuláktól. Az ilyen MSC-k nem expresszálnak CD34-et, ICAM-ot, VCAM-ot, I. és III. típusú kollagént, CD44-et és CD29-et. Következésképpen in vitro nem mezenchimális őssejtek rögzülnek a tenyésztő szubsztráthoz, hanem a mezenchimális őssejtek fejlettebb progenitor származékai, amelyek már kialakították a citoszkeleton és a sejtadhéziós molekulák receptor apparátusának komponenseit. A CD34 fenotípusú stromális sejtek még a perifériás vérben is megtalálhatók, bár a csontvelőben lényegesen kevesebb van belőlük, mint a CD34-pozitív mononukleáris sejtekből. A vérből izolált és tenyészetbe átvitt CD34 sejtek a szubsztráthoz tapadnak, és fibroblasztszerű sejtek telepeit alkotják.

Ismeretes, hogy az embrionális időszakban az emlősök és az emberek összes szervének és szövetének stromális alapja a mezenchimális őssejtek közös készletéből származik az organogenezis előtt és alatt. Ezért úgy vélik, hogy egy érett szervezetben a mezenchimális őssejtek többségének a kötő- és csontszövetben kell lennie. Megállapították, hogy a laza kötő- és csontszövet stromájának sejtes elemeinek fő részét elkötelezett progenitor sejtek képviselik, amelyek azonban megtartják a proliferáció és a klónok képzésének képességét in vitro. Amikor ilyen sejteket juttatnak be az általános véráramba, a mezenchimális progenitor sejtek több mint 20%-a beágyazódik a vérképző szövet és a parenchimális szervek stromális elemei közé.

A mezenchimális őssejtek potenciális forrása a zsírszövet, amelynek őssejtjei között különböző mértékben elkötelezett adipocita prekurzorokat azonosítottak. A zsírszövet legkevésbé érett progenitor elemei a stromális-vaszkuláris sejtek, amelyek a csontvelő multipotens mezenchimális prekurzor sejtjeihez hasonlóan képesek glükokortikoidok, inzulinszerű növekedési faktor és inzulin hatására adipocitákká differenciálódni. Tenyészetben a stromális-vaszkuláris sejtek adipocitákká és porcsejtekké differenciálódnak, a csontvelői eredetű zsírszövetben pedig olyan sejtek találhatók, amelyek adipocitákat és osteoblastokat képeznek.

A stromális őssejteket izmokban is kimutatták. Az emberi vázizomzatból izolált sejtek primer tenyészetében csillagsejteket és többmagvú miotópokat mutattak ki. Lószérum jelenlétében a csillagsejtek in vitro citodifferenciálódás jelei nélkül szaporodnak, és miután a táptalajhoz dexametazont adtak, differenciálódásukat a vázizom- és simaizomsejtek, a csont, a porc és a zsírszövet fenotípusával rendelkező sejtes elemek megjelenése jellemzi. Ezért mind elkötelezett, mind nem elkötelezett multipotens mezenchimális progenitor sejtek jelen vannak az emberi izomszövetben. Kimutatták, hogy a vázizomzatban jelen lévő progenitor sejtek populációja a csontvelő nem elkötelezett multipotens mezenchimális progenitor sejtjeiből származik, és különbözik a miogén szatellitsejtektől.

Újszülött patkányok szívizomában is találtak differenciálódási potenciállal rendelkező multipotens mezenchimális progenitor sejteknek megfelelő adhéziós csillagsejteket, mivel dexametazon hatására ezek zsírsejtekké, oszteoblasztokká, porcsejtekké, simaizomsejtekké, vázizom miotubulusokká és szívizomsejtekké differenciálódnak. Kimutatták, hogy az ér simaizomsejtjei (periciták) a differenciálatlan perivaszkuláris multipotens mezenchimális progenitor sejtek származékai. Tenyészetben a perivaszkuláris mezenchimális őssejtek simaizom α-aktint és vérlemezkéből származó növekedési faktor receptort expresszálnak, és képesek legalább simaizomsejtekké differenciálódni.

A szártartalékok szempontjából különleges helyet foglal el a porcszövet, amelynek rendkívül alacsony reparatív potenciálja feltehetően a multipotens mezenchimális progenitor sejtek vagy differenciálódási és növekedési faktorok hiányának köszönhető. Feltételezik, hogy a porc- és oszteogenezisre előre elkötelezett multipotens mezenchimális progenitor sejtek más szöveti forrásokból jutnak be a porcszövetbe.

A mezenchimális progenitor sejtek szöveti eredetét és az inakban való megtapadásának feltételeit sem állapították meg. Kísérleti megfigyelések azt mutatják, hogy a korai posztnatális időszakban a nyúl Achilles-ín sejtjei az elsődleges tenyészetekben és az első passzázs során megtartják az I. típusú kollagén és a dekorin expresszióját, de további tenyésztéssel elveszítik a tenociták differenciálódási markereit.

Meg kell jegyezni, hogy arra a kérdésre, hogy a különböző szövetekben lokalizált multipotens mezenchimális progenitor sejtek valóban folyamatosan jelen vannak-e a sztrómájukban, vagy a mezenchimális őssejtek szöveti készletét a csontvelői stromális őssejtek migrációja pótolja-e, még nem érkezett válasz.

A felnőtt szervezet csontvelője és más mezenchimális szövetzónái mellett a köldökzsinórvér is lehet az MSC-k másik forrása. Kimutatták, hogy a köldökzsinórvéna vére olyan sejteket tartalmaz, amelyek hasonló morfológiai és antigén tulajdonságokkal rendelkeznek, mint a multipotens mezenchimális progenitor sejtek, képesek adhézióra, és a differenciálódási potenciálban nem maradnak el a csontvelői eredetű multipotens mezenchimális progenitor sejtektől. A köldökzsinórvér mezenchimális őssejtjeinek tenyészeteiben 5-10%-ban találtak nem elköteleződött multipotens mezenchimális progenitor sejteket. Kiderült, hogy számuk a köldökzsinórvérben fordítottan arányos a terhességi korral, ami közvetve a multipotens mezenchimális progenitor sejtek különböző szövetekbe történő migrációját jelzi a magzati fejlődés során. Megjelentek az első információk a köldökzsinórvérből izolált mezenchimális őssejtek, valamint az embrionális bioanyagból nyert sejtek klinikai alkalmazásáról, amely a magzati őssejtek ismert integrálódási, beágyazódási és működési képességén alapul a felnőtt recipiensek szerveiben és szövetrendszereiben.

Új mezenchimális őssejtforrások keresése

Az embrionális eredetű mezenchimális őssejtek, valamint más magzati sejtek felhasználása számos etikai, jogi, igazságszolgáltatási és jogalkotási problémát vet fel. Ezért folytatódik az extraembrionális donorsejt-anyag keresése. Az emberi bőrfibroblasztok klinikai alkalmazására tett kísérlet sikertelen volt, amit nemcsak a technológia magas pénzügyi kapacitása, hanem a fibroblasztok fibrocitákká történő gyors differenciálódása is előrejelzett, amelyek jelentősen alacsonyabb proliferációs potenciállal rendelkeznek és korlátozott számú növekedési faktort termelnek. Az MSC-k és a csontvelő multipotens mezenchimális progenitor sejtjeinek biológiai vizsgálatában elért további előrelépések lehetővé tették számunkra az autológ mezenchimális őssejtek klinikai alkalmazására vonatkozó stratégia kidolgozását. Izolálásuk, tenyésztésük, ex vivo reprodukciójuk és célzott differenciálódásuk technológiája mindenekelőtt az MSC-k molekuláris markereinek spektrumának tanulmányozását igényelte. Elemzésük kimutatta, hogy az emberi csontszövet primer tenyészetei többféle multipotens mezenchimális progenitor sejtet tartalmaznak. A prooszteoblaszt fenotípust olyan sejtekben detektálták, amelyek expresszálják a stromális progenitor sejtek STRO-1 markerét, de nem hordozzák az oszteoblaszt markert - az alkalikus foszfatázt. Az ilyen sejtekre jellemző az alacsony mineralizált csontmátrix képzési képesség, valamint az oszteopontin és a mellékpajzsmirigyhormon-receptor expressziójának hiánya. Az STRO-1-pozitív sejtek alkalikus foszfatázt nem expresszáló származékait a közepesen és teljesen differenciált oszteoblasztok képviselik. Megállapították, hogy az STRO-1-pozitív humán trabekuláris csontsejtek klónozott vonalainak sejtes elemei képesek érett oszteocitákká és adipocitákká differenciálódni. Ezen sejtek differenciálódásának iránya a többszörösen telítetlen zsírsavak, a gyulladáskeltő citokinek - IL-1b és tumor nekrózis faktor a (TNF-a), valamint a gyulladáscsökkentő és immunszuppresszív TGF-b hatásától függ.

Később kiderült, hogy a multipotens mezenchimális progenitor sejtek nem rendelkeznek egy csak rájuk jellemző specifikus fenotípussal, de a hematopoietikus sejtek immunofenotípusos antigénjeinek - CD45, CD34 és CD14 - expressziójának hiányában a mezenchimális, endoteliális, epiteliális és izomsejtekre jellemző markerek komplexét expresszálják. Ezenkívül a mezenchimális őssejtek konstitutívan és indukálhatóan termelnek hematopoietikus és nem hematopoietikus növekedési faktorokat, interleukinokat és kemokineket, és egyes citokinek és növekedési faktorok receptorai expresszálódnak a multipotens mezenchimális progenitor sejteken. Az emberi test stromális mátrixának sejtjei között találtak olyan nyugalmi állapotú, nyugalmi állapotú sejteket, amelyek immunofenotípusa majdnem megegyezik az 5-fluorouracillal kezeletlen multipotens mezenchimális progenitor sejtek antigénprofiljával - mindkét sejt CD117-et expresszál, amely a „felnőtt” őssejteket jelöli.

Így a mezenchimális őssejtekre jellemző sejtmarkert még nem azonosították. Feltételezik, hogy a nyugalmi állapotban lévő sejtek a nem elköteleződött multipotens mezenchimális progenitor sejtek populációját képviselik, mivel nem expresszálják az oszteo- (Cbfa-1) vagy az adipogenezishez (PPAR-y-2) elkötelezett sejtek markereit. A lassan proliferáló nyugalmi állapotban lévő sejtek magzati szarvasmarha-szérummal való hosszan tartó érintkezése terminálisan differenciálódó, elkötelezett progenitorok kialakulásához vezet, amelyeket gyors növekedés jellemez. Az ilyen mezenchimális őssejtek klonális expanzióját az FGF2 támogatja. Úgy tűnik, hogy a stromális őssejtek genomja meglehetősen szorosan „zárt”. Vannak jelentések a spontán differenciálódás hiányáról az MSC-kben – az elköteleződés speciális feltételei nélkül még a mezenchimális vonal sejtjeivé sem alakulnak át.

A mezenchimális őssejt-származékok populációszerkezetének vizsgálatához differenciálódási markerfehérjéket keresnek stromális sejtvonalakon és primer tenyészetekben. A csontvelő kolóniaképző sejtek in vitro klonális analízise kimutatta, hogy az EGF növeli az átlagos kolóniaméretet és csökkenti az alkalikus foszfatáz klonális expresszióját, ha primer tenyészetekre alkalmazzák, míg a hidrokortizon hozzáadása aktiválja az alkalikus foszfatáz expresszióját, amely az MSC differenciálódásának osteogén irányának markere. Az STRO-1 elleni monoklonális antitestek lehetővé tették az STRO-1-pozitív adhéziós sejtek populációjának elkülönítését és vizsgálatát Dexter-tenyészetek heterogén rendszerében. Meghatároztak egy olyan citokin spektrumot, amely nemcsak a hematopoietikus és limfoid sejtek proliferációját és differenciálódását szabályozza, hanem részt vesz a vázszövetek képződésében, képzésében és felszívódásában is para-, auto- és endokrin mechanizmusokon keresztül. A másodlagos hírvivők, például a cAMP, a diacilglicerin, az inozitol-trifoszfát és a Ca2+ receptor által közvetített felszabadulását szintén alkalmazzák a megfelelő receptorokat expresszáló stromális szövetsejtek különböző kategóriáinak markeranalízisére. A monoklonális antitestek markerként való alkalmazása lehetővé tette a limfoid szervek sztrómájának retikuláris sejtjeinek a T- és B-függő zónákhoz való tartozásának megállapítását.

Egy ideig tudományos viták folytak arról a kérdésről, hogy az MSC-k (Medical Sclerosis Cells - Mesenchymális Szemle) vérképző őssejtekből származhatnak-e. Valójában, amikor csontvelői sejtszuszpenziókat ültetnek be egyrétegű tenyészetekbe, különálló fibroblaszt telepek nőnek bennük. Kimutatták azonban, hogy a fibroblaszt telepek prekurzorainak és a vérképző szövetek differenciálódásának különféle csíráinak jelenléte a csontvelőben nem bizonyítja közös vérképző őssejtből való eredetüket. Csontvelői őssejtek diszkrimináns analízisével megállapították, hogy a heterotóp csontvelő-transzplantáció során a mikrokörnyezetet nem a vérképző sejtek viszik át, ami bizonyítja a csontvelőben lévő MSC-k olyan populációjának létezését, amely hisztogenetikailag független a vérképző sejtektől.

Ezenkívül a szelektív klónozási módszer lehetővé tette a stromális progenitor sejtek egy új kategóriájának azonosítását a csontvelősejtek egyrétegű tenyészeteiben, számuk meghatározását, valamint tulajdonságaik, proliferációs és differenciálódási potenciáljuk vizsgálatát. Kiderült, hogy a stromális fibroblaszt-szerű sejtek in vitro szaporodnak és diploid kolóniákat alkotnak, amelyek a szervezetbe visszaültetve új vérképző szervek kialakulását biztosítják. Az egyes klónok vizsgálatának eredményei azt mutatják, hogy a stromális progenitor sejtek között van egy olyan sejtpopuláció, amely proliferációs és differenciálódási potenciáljánál fogva a stromális szövet őssejtjeinek szerepét töltheti be, hisztogenetikailag független a vérképző őssejtektől. Ennek a populációnak a sejtjeit az önfenntartó növekedés jellemzi, és a csontvelő csont-, porc- és retikuláris szövetének progenitor sejtelemeivé differenciálódnak.

Nagy érdeklődésre tartanak számot R. Chailakhyan és társszerzői (1997-2001) tanulmányainak eredményei, akik nyulak, tengerimalacok és egerek csontvelő stromális progenitor sejtjeit tenyésztették a-MEM táptalajon, magzati borjúszérum hozzáadásával. A szerzők 2-4 x 103 csontvelősejt/1 cm2 kezdeti sűrűséggel végezték az explantációt. Homológ vagy heterológ, sugárzással inaktivált csontvelősejteket használtak táplálóként olyan dózisban, amely megtartotta a tápláló hatást, de teljesen blokkolta a proliferációjukat. Kéthetes, primer, különálló fibroblaszt telepeket tripszinizáltak monoklonális törzsek előállítására. A telepek klonális eredetét kromoszóma markerrel igazolták hím és nőstény tengerimalacok vegyes csontvelő-tenyészeteiben, élő tenyészetek időzített fényképezésével, valamint CBA és CBAT6T6 egerek szingén csontvelőjének vegyes tenyészeteiben. Frissen izolált csontvelősejtek vagy in vitro tenyésztett stromális fibroblasztok szuszpenziójának vese tok alá történő átültetését ivalon vagy zselatin porózus vázakba, valamint inaktivált nyúl szivacsos csontmátrixba végeztük. A klónok csonthüvelybe történő átültetéséhez a tengerimalac combcsontjait megtisztítottuk a lágy szövetektől és a csonthártyától, az epifíziseket levágtuk, és a csontvelőt alaposan kimostuk. A csontot 3-5 mm-es darabokra vágtuk, szárítottuk, majd 60 Gy dózissal besugároztuk. Az egyes fibroblaszt telepeket csonthüvelyekbe helyeztük, és intramuszkulárisan implantáltuk. Az in vitro tenyésztett stromális fibroblasztok intraperitoneális átültetéséhez A típusú (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) és O típusú (V=0,15 cm3, h=2 mm) diffúziós kamrákat használtunk.

R. Chailakhyan és munkatársai (2001) klonális törzsek növekedési dinamikájának vizsgálatakor azt találták, hogy a fibroblaszt kolóniákat alkotó egyes sejtek, valamint azok leszármazottai hatalmas proliferatív potenciállal rendelkeznek. A 10. passzázsra egyes törzsekben a fibroblasztok száma 1,2-7,2 x 109 sejt volt ^. Fejlődésük során akár 31-34 sejtduplázódást is végrehajtottak. Ebben az esetben több tucat klón stromális prekurzorai által létrehozott csontvelőből származó törzsek heterotóp transzplantációja a csontvelő mikrokörnyezetének átvitelét és egy új vérképző szerv kialakulását eredményezte a transzplantációs zónában. A szerzők azt a kérdést tették fel, hogy az egyes klónok képesek-e a stromális sejtek csontvelő mikrokörnyezetének átvitelére, vagy ehhez több különböző klonogén stromális prekurzor együttműködése szükséges? És ha az egyes klónok képesek a mikrokörnyezet átvitelére, akkor az mindhárom vérképző csíra esetében teljes lesz-e, vagy a különböző klónok biztosítják a mikrokörnyezet kialakulását a különböző vérképző csírák számára? Ezen problémák megoldására kifejlesztettek egy technológiát a stromális progenitor sejtek kollagén gélen történő tenyésztésére, amely lehetővé teszi a kinőtt fibroblaszt telepek eltávolítását a felületről a későbbi heterotóp transzplantációhoz. A CBA egerek és tengerimalacok csontvelősejtjeiből tenyésztett stromális fibroblasztok egyedi klónjait a gélbevonat egy fragmentumával együtt kivágták, és heterotóp módon átültették - szingén egerek vese tokja alá vagy autológ tengerimalacok hasizmába. Az izomba történő átültetéskor a gélen lévő telepeket csonthüvelyekbe helyezték.

A szerzők azt találták, hogy a csontvelő fibroblaszt telepek átültetése után 50-90 nappal az esetek 20%-ában csont- vagy csont- és vérképző szövet fejlődését figyelték meg a transzplantációs zónában. A recipiens állatok 5%-ánál a kialakult csontszövet-gócok csontvelővel teli üreget tartalmaztak. A csonthengerek belsejében ezek a gócok lekerekített alakúak voltak, és csontszövetből, oszteocitákból és jól fejlett oszteoblasztikus rétegből álló kapszulát tartalmaztak. A csontvelő ürege retikuláris szövetet tartalmazott mieloid és eritroid sejtekkel, amelyek arányos viszonya nem különbözött a normál csontvelőben találhatótól. A vesében a transzplantátum egy tipikus csontvelői szerv volt, amely a natív csontvelő átültetése során képződött, a csontkapszula csak a vese kapszula felől fedte a csontvelő üregét. A vérképző szövet mieloid, eritroid és megakariocita elemeket tartalmazott. A csontvelő üregének sztrómája jól fejlett sinusrendszerrel rendelkezett, és tipikus zsírsejteket tartalmazott. Ugyanakkor egyes telepek transzplantációs zónájában a vese kapszula alatt vérképzés jeleit nem mutató csontszövetet találtak. Az egyes klónok proliferatív és differenciálódási potenciáljának vizsgálatát nyulak monoklonális csontvelőtörzsein folytatták, melyek sejtjeit táptalajban és egy külön ivalon szivacsban reszuszpendálták, 1-2 mg tömegben, és egy nyúl csontvelő donor vesetokja alá ültették át. 21 monoklonális törzs sejtjeit vetették alá ilyen autotranszplantációnak. Az eredményeket 2-3 hónap elteltével vették figyelembe. A szerzők megállapították, hogy az esetek 14%-ában az átültetett monoklonális törzsek csontszövetből és vérképző sejtekkel teli csontvelőüregből álló csontvelőszervet képeztek. Az esetek 33%-ában az átültetett törzsek változó méretű tömör csontot képeztek, az üregekben oszteocitákkal és fejlett oszteoblasztikus réteggel. Bizonyos esetekben csont- vagy vérképző elemek nélküli retikuláris szövet fejlődött ki az átültetett klónokkal rendelkező szivacsokban. Előfordult, hogy jól fejlett sinusoid hálózattal rendelkező retikuláris stroma alakult ki, amely azonban nem benépesült vérképző sejtekkel. Így a kapott eredmények hasonlóak voltak a kollagén gélen végzett klónátültetés során kapott adatokhoz. Ha azonban a szubsztráton tenyésztett klónok átültetése az esetek 5%-ában csontvelőszövet, 15%-ában csontszövet és 80%-ában retikuláris szövet képződését eredményezte, akkor monoklonális törzsek átültetésekor az esetek 14%-ában csontvelőelemek, 53%-ában csontszövet és 53%-ában retikuláris szövet képződését figyelték meg. A szerzők szerint ez arra utal, hogy a stromális fibroblasztok proliferatív és differenciálódási potenciáljának megvalósításához szükséges feltételek a porózus állványzatokra történő átültetés során optimálisabbak voltak, mint csonthüvelyekbe és kollagén szubsztrátra történő átültetésük során.Lehetséges, hogy a klónok tenyésztésének és reverz transzplantációjának fejlettebb módszerei javíthatják a klónok differenciálódási potenciáljának megvalósításának feltételeit, és megváltoztathatják ezeket az arányokat. Így vagy úgy, de az elvégzett vizsgálatok fő jelentősége az, hogy egyes stromális sejtklónok képesek csontszövetet képezni, és egyidejűleg stromális hematopoietikus mikrokörnyezetet biztosítani a csontvelői hematopoiesis három csírájának egyszerre: eritroidnak, mieloidnak és megakariocitának, meglehetősen nagy hematopoietikus szövet- és némi csonttömeg-platformokat hozva létre.

A szerzők ezután azt a kérdést vizsgálták, hogy az egyes klonogén stromális progenitor sejtek képesek-e ilyen típusú sejtdifferenciálódáson átesni egy zárt diffúziós kamrarendszerben. Ezenkívül meg kellett határozni, hogy az egyes klónok polipotenciával rendelkeznek-e, vagy a differenciálódási potenciál megnyilvánulásához több, fix citodifferenciálódási tulajdonsággal rendelkező klón kooperatív kölcsönhatása szükséges, amelyek különböző arányai határozzák meg a csont-, retikuláris vagy porcszövet preferenciális képződését. Két módszertani megközelítés kombinálásával - a csontvelői stromális progenitor sejtek monoklonális törzseinek kinyerésével és diffúziós kamrákba történő átültetésével - R. Chailakhyan és társai (2001) olyan eredményeket értek el, amelyek lehetővé tették számukra, hogy közelebb kerüljenek a csontvelő stróma szerkezeti szerveződésének megértéséhez. A stromális progenitor sejtek monoklonális törzseinek O-típusú kamrákba történő átültetése mind csont-, mind porcszövet kialakulásához vezetett, ami azt jelzi, hogy egyetlen stromális telepképző sejt leszármazottai képesek egyidejűleg csont- és porcszövetet képezni. Azt a feltételezést, hogy a csont- és porcszövet egy közös stromális progenitor sejtből származik, ismételten felvetették. Ez a hipotézis azonban nem kapott helyes kísérleti megerősítést. A csont és porc diffúziós kamrákban történő kialakulása volt a szükséges bizonyíték arra, hogy a csontvelői stromális őssejtek között e két szövettípus esetében létezik egy közös progenitor sejt.

Ezután a nyúl csontvelő primer tenyészeteiből származó második-harmadik passzázs 29 klonális törzsét diffúziós kamrákba helyezték, és intraperitoneálisan implantálták homológ állatokba. A vizsgálatok kimutatták, hogy a csontvelő monoklonális törzseinek 45%-a rendelkezik osteogén potenciállal. Kilenc kamra kizárólag retikuláris szövetet tartalmazott, de további 13 kamrában csont- és porcszövettel együtt volt jelen, ami az összes törzs 76%-át tette ki. Az O típusú kamrákban, ahol mind a csont-, mind a porcszövet differenciálódása lehetséges volt, 16 törzset vizsgáltak. Négy kamrában (25%) mind csont-, mind porcszövet képződött. Ismét meg kell jegyezni, hogy R. Chailakhyan és munkatársai (2001) vizsgálataiban az egyes progenitor sejtek 31-34 kettőződésen mentek keresztül egy sejttörzsön belül, és utódaik 0,9-2,0 x 109 ^sejtet tartalmaztak. A poliklonális törzsek progenitor sejtjei által átesett mitózisok száma gyakorlatilag megegyezett a monoklonális törzsekével. A poliklonális törzsek fejlődési üteme, különösen kialakulásuk első fázisában, jelentős mértékben függött a törzsek iniciálásához használt telepek számától. Az emberi embrionális fibroblasztok diploid törzsei (WI-38), amikor a 12-15. duplikálódási szinten újra klónozták őket, szintén olyan telepeket hoztak létre, amelyek átmérőjükben és sejttartalmukban különböztek. A 103-nál több sejtet tartalmazó nagy telepek mindössze 5-10%-ot tettek ki. Az osztódások számának növekedésével a nagy telepek aránya csökkent. A csontvelői stromális fibroblasztok mono- és poliklonális törzsei 20 vagy több duplikálódás után is megtartották a diploid kromoszómakészletüket, és fejlődésük tendenciája összehasonlítható volt az embrionális fibroblasztok diploid törzseinek fejlődési dinamikájával. Az egyes csontvelői stromális progenitor sejtek diffúziós potenciáljának elemzése, amelyet monoklonális törzsek diffúziós kamrákba történő átültetésével végeztek, kimutatta, hogy felük oszteogén volt. A nagy telepek a teljes számuk 10%-át tették ki. Következésképpen az oszteogén telepképző sejtek száma a teljes populációjuk körülbelül 5%-ának felelt meg. A szerzők által azonosított oszteogén progenitor sejtek teljes tömege olyan sejteket tartalmazott, amelyek képesek egyszerre csont- és porcszövetet képezni. Ezenkívül elsőként állapították meg, hogy egy felnőtt szervezetben ez a két szövettípus közös progenitor sejttel rendelkezik: a tesztelt klónok 25%-át ilyen sejtek hozták létre, és számuk a progenitor sejtek teljes populációjában legalább 2,5% volt.

Így a csontvelői fibroblasztok egyes klónjainak heterotópos transzplantációja új aspektusokat tárt fel a mezenchimális progenitor sejtek populációjának strukturális szerveződésében. Olyan stromális progenitor sejteket találtak, amelyek képesek egyszerre egy specifikus mikro-környezetet átadni az összes hematopoietikus csíra számára, amelyek száma a különböző modellekben vizsgált nagy klónok között 5-15% között mozog (a detektált progenitor sejtek teljes számának 0,5-1,5%-a). A teljes csontvelői mikro-környezetet átadó klónok mellett vannak olyan progenitor sejtek is, amelyek csak az oszteogenezisre determináltak, és amelyek nyitott rendszerben történő átvitel esetén olyan csontszövetet képeznek, amely nem támogatja a vérképzés fejlődését. Számuk a progenitor sejtek teljes számából 1,5-3%. Ezen sejtek némelyike korlátozott önfenntartási idővel képes csontszövetet képezni. Következésképpen a stromális progenitor sejtek populációja heterogén a differenciálódási potenciáljában. Közöttük van egy olyan sejtkategória, amelyek stromális őssejteknek vallják magukat, és képesek a csontvelő stromális szövetére jellemző mindhárom irányban differenciálódni, csontot, porcot és retikuláris szövetet képezve. A bemutatott adatok reményt keltenek abban, hogy különféle sejtmarkerek segítségével meghatározható lesz az egyes stromális sejttípusok hozzájárulása egy adott mikro-környezet szerveződéséhez és a vérképzés támogatásához Dexter-kultúrákban.

A mezenchimális őssejtek jellemzői

Az utóbbi években megállapították, hogy stacionárius csontvelőkultúrákban a multipotens mezenchimális progenitor sejteket kis agranuláris sejtek (RS-1 sejtek) korlátozott populációja képviseli, amelyeket alacsony telepképző képesség és a proliferáló sejtekre specifikus Ki-67 antigén expressziójának hiánya jellemez. A szunnyadó RS-1 sejtek antigén paraméterei eltérnek a gyorsan proliferáló, elkötelezett stromális progenitor sejtek antigén spektrumától. Megállapították, hogy az elkötelezett progenitor sejtek magas proliferációs rátája csak RS-1 sejtek jelenlétében figyelhető meg. Az RS-1 sejtek viszont a multipotens mezenchimális progenitor sejtek legérettebb származékai által kiválasztott faktorok hatására fokozzák növekedési ütemüket. Úgy tűnik, hogy az RS-1 sejtek a nem elkötelezett MSC-k alosztályát alkotják, amelyek képesek az újrahasznosításra. In vitro az 5-fluorouracil-rezisztens csontvelői stromális progenitor sejteket alacsony RNS-tartalom és az ornitin-dekarboxiláz gén, a nem proliferáló sejtek markerének magas expressziója jellemzi.

A stromális progenitor sejtek intenzív proliferációja a szubsztráthoz való rögzítésük után kezdődik. Ebben az esetben a rosszul differenciált sejtek markerprofilja expresszálódik: SH2 (TGF-(3) receptor), SH3 (jelzőfehérje domén), I. és III. típusú kollagén, fibronektin, VCAM-1 (CD106) és ICAM (CD54) adhéziós receptorok, kadherin-11, CD44, CD71 (transzferrin receptor), CD90, CD120a és CD124, de a hematopoietikus őssejtek jellegzetes markereinek (CD34, CD14, CD45) expressziója nélkül. A klonális növekedés lehetővé teszi a mezenchimális őssejtek ismételt passzázsolását, számos genetikailag homogén stromális progenitor pluripotens sejt képződésével a tenyészetben. 2-3 passzázs után számuk eléri az 50-300 milliót. Megfelelő sűrűségű tenyészetben, a proliferáció leállása után a stromális progenitor sejtek a hematopoietikus szöveti fibroblasztokkal ellentétben zsírsejtekké, szívizomsejtekké, porcsejtekké és csontsejtekké differenciálódnak. Három szabályozó differenciálódási jel kombinációja, beleértve az 1-metil-izobutilxantint (az intracelluláris cAMP-képződés induktora), a dexametazont (a foszfolipázok A és C inhibitora) és az indometacint (a ciklooxigenáz inhibitora, amely szintén csökkenti a tromboxán-szintáz aktivitását), a progenitor mezenchimális sejtek akár 95%-át is adipocitákká alakítja. Az éretlen stromális elemekből származó adipociták képződését a lipoprotein lipáz gén expressziója, az apolipoproteinek és a peroxiszomális receptorok hisztokémiai kimutatása igazolja. Ugyanazon klón sejtjei TGF-β hatására szérummentes táptalajban homogén porcsejt-populációt hoznak létre. Ennek a porcszövetnek a többrétegű sejtkultúráját fejlett intercelluláris mátrix jellemzi, amely proteoglikánból és II. típusú kollagénből áll. 10%-os táptalajban a β-glicerofoszfátból (szervetlen foszfátdonor), aszkorbinsavból és dexametazonból álló differenciálódási jel komplex hatása a stromális progenitor sejtek ugyanazon kultúrájában sejtaggregátumok képződéséhez vezet. Az ilyen sejtekben az alkalikus foszfatáz aktivitás és az osteopontin szint progresszív növekedése figyelhető meg, ami a csontszövet képződését jelzi, amelynek sejtjeinek mineralizációját az intracelluláris kalciumtartalom progresszív növekedése igazolja.

Egyes adatok szerint a mezenchimális őssejtek korlátlan osztódásra és a mezenchimális differenciálódási vonal különböző sejttípusainak szaporodására való képessége nagyfokú plaszticitással párosul. Az agy kamráiba vagy fehérállományába bejutva a mezenchimális őssejtek az idegszövet parenchymájába vándorolnak, és glia- vagy neuronális sejtvonal származékaivá differenciálódnak. Ezenkívül információk állnak rendelkezésre az MSC-k hematopoietikus őssejtekké történő transzdifferenciálódásáról is in vitro és in vivo egyaránt. Egyes tanulmányok mélyebb elemzése az MSC-k kivételesen magas plaszticitását állapította meg, amely abban nyilvánul meg, hogy képesek asztrocitákká, oligodendrocitákká, neuronokká, szívizomsejtekké, simaizomsejtekké és vázizomsejtekké differenciálódni. Az MSC-k in vitro és in vivo transzdifferenciálódási potenciáljáról szóló számos tanulmány megállapította, hogy a csontvelői eredetű multipotens mezenchimális progenitor sejtek terminálisan differenciálódnak olyan sejtvonalakká, amelyek csont-, porc-, izom-, ideg- és zsírszövetet, valamint inakat és sztrómát alkotnak, amelyek támogatják a vérképzést.

Más tanulmányok azonban nem mutatták ki a mezenchimális őssejt-genom és a stromális sejtek progenitor populációinak pluripotenciájának korlátozására utaló jeleket, bár több mint 200, egyetlen primer tenyészetből izolált MSC-klónt vizsgáltak a stromális sejtek lehetséges pluripotenciájának tesztelésére. Az in vitro klónok túlnyomó többsége megőrizte az oszteogén, porc- és zsírszövet-képződési irányú differenciálódás képességét. Amikor kizártuk a recipiens sejtek migrációjának valószínűségét a mezenchimális őssejtek vese kapszula alá vagy diffúziós kamrákba történő átültetésével, kiderült, hogy az in situ stromális progenitor sejtek heterogén fenotípust tartanak fenn, ami vagy a restrikciós faktorok hiányát jelzi a transzplantációs zónában, vagy az MSC pluripotencia hiányát. Ugyanakkor megengedett egy ritka típusú szomatikus pluripotens őssejt létezése, amelyek minden felnőtt őssejt közös prekurzorai.

A valódi mezenchimális őssejtek – amelyek a csontvelősejtek nagyon kis részét alkotják, és bizonyos körülmények között in vitro tenyésztés során differenciálódás nélkül képesek szaporodni – multi-, de nem pluripotenciáját bizonyítja, hogy indukáltan kötődnek a csont-, porc-, zsír- és izomszövetsejtekhez, valamint a vérképzést támogató tenocitákhoz és stromális elemekhez. Általános szabály, hogy a magzati borjúszérumot tartalmazó táptalajnak való hosszan tartó kitettség MSC-k felszabadulását idézi elő elkötelezett stromális progenitor sejtekbe, amelyek utódai spontán terminális differenciálódáson mennek keresztül. In vitro a kondicionáló táptalajhoz dexametazon, ß-glicerofoszfát és aszkorbinsav hozzáadásával célzott oszteoblaszt-képződés érhető el, míg a dexametazon és az inzulin differenciálódási jeleinek kombinációja zsírsejtek képződését indukálja.

Megállapították, hogy mielőtt a terminális differenciálódási szakaszba lépnének, a csontvelői MSC-k kezdetben fibroblasztszerű mezenchimális őssejtekké differenciálódnak bizonyos tenyésztési körülmények között. Ezen sejtek származékai in vivo részt vesznek a csontok, porcok, inak, zsír- és izomszövet, valamint a vérképzést támogató sztróma kialakulásában. Sok szerző a „multipotens mezenchimális progenitor sejtek” kifejezés alatt mind magukat az MSC-ket, mind a csontvelő és a mezenchimális szövetek elkötelezett stromális progenitor sejtjeit érti. A csontvelői eredetű multipotens mezenchimális progenitor sejtek klonális elemzése kimutatta, hogy az összes klón valamivel több mint egyharmada oszteoblasztokká, kondrocitákká és zsírsejtekké differenciálódik, míg a fennmaradó klónok sejtjei csak oszteogén potenciállal rendelkeznek, és csak kondro- és oszteocitákat képeznek. A multipotens mezenchimális progenitor sejtek klónja, mint például a BMC-9, megfelelő mikro-környezeti körülmények között nemcsak oszteoblasztok, kondrociták és zsírsejtek, hanem a vérképzést támogató stromális sejtek fenotípusával és funkcionális jellemzőivel rendelkező sejtekké is differenciálódik. Egy patkány magzati csontvelőből izolált RCJ3.1 sejtklón különböző fenotípusú mezenchimális sejtekké differenciálódik. Az aszkorbinsav, a béta-glicerofoszfát és a dexametazon együttes hatására a klón sejtes elemei először többmagvú szívizomsejteket, majd egymást követően zsírsejteket, porcsejteket és mineralizált csontszövet-szigeteket képeznek. A patkánymagzatok csonthártyájából származó szemcsés sejtek populációja nem elköteleződött többpotens mezenchimális progenitor sejteknek felel meg, mivel alacsony proliferációs ráta jellemzi, nem expresszál differenciálódási markereket, és tenyésztési körülmények között kondro-, oszteo- és zsírsejtekké, valamint simaizomsejtekké differenciálódik.

Így fel kell ismerni, hogy a mezenchimális őssejtek genomjának pluri- vagy multipotenciájának kérdése továbbra is nyitott, ami ennek megfelelően befolyásolja a stromális progenitor sejtek differenciálódási potenciáljával kapcsolatos elképzeléseket is, amelyet szintén nem sikerült véglegesen megállapítani.

A mezenchimális őssejtek kísérletileg bizonyított és fontos jellemzője, hogy képesek elhagyni a szöveti rést és az általános véráramban keringeni. A genetikai differenciálódási program aktiválásához az ilyen keringő őssejteknek be kell jutniuk a megfelelő mikro-környezetbe. Kimutatták, hogy az MSC-k szisztematikus bejuttatásával a recipiens állatok véráramába az éretlen sejtek különböző szervekbe és szövetekbe implantálódnak, majd vérsejtekké, szívizomsejtekké, zsírsejtekké, porcsejtekké és fibroblasztokká differenciálódnak. Következésképpen a lokális szöveti zónákban jel-szabályozó kölcsönhatások alakulnak ki a nem elköteleződött és az elköteleződött stromális progenitor sejtek, valamint közöttük és a környező érett sejtek között. Feltételezik, hogy a differenciálódást mezenchimális és nem-mezenchimális eredetű parakrin szabályozó faktorok (növekedési faktorok, eikozanoidok, extracelluláris mátrix molekulák) indukálják, amelyek térbeli és időbeli kapcsolatokat biztosítanak a multipotens mezenchimális progenitor sejtek mikro-környezetében. Ezért a mezenchimális szövet lokális károsodása a multipotens mezenchimális progenitor sejtek mikro-környezetének olyan zónáinak kialakulásához vezethet, amelyek minőségileg eltérnek az ép szövetek szabályozó jeleinek komplexumától, amelyekben fiziológiai, nem pedig reparatív regenerációs folyamatok zajlanak. Ez a különbség rendkívül fontos a sejtes fenotípus specializációja szempontjából a normál és a károsodás által indukált mikrokörnyezetben.

A koncepciók szerint itt ágyazódnak be a két ismert folyamat - a fiziológiai regeneráció és a gyulladásos proliferáció - közötti alapvető különbség mechanizmusai. Az első a szövet specializált sejtösszetételének és funkciójának helyreállításával végződik, míg a proliferációs folyamat megvalósításának eredménye az érett kötőszöveti elemek kialakulása és a sérült szöveti zóna funkcióvesztése. Így a multipotens mezenchimális progenitor sejtek regeneratív-plasztikai gyógyászatban történő alkalmazására szolgáló optimális programok kidolgozásához alapos vizsgálat szükséges a mikro-környezeti tényezők MSC-k differenciálódására gyakorolt hatásának jellemzőiről.

Kétségtelen, hogy az őssejt-kompartment szerkezete a sejtes para- és autokrin szabályozóktól függ, amelyek expresszióját külső jelek modulálják. A szabályozó faktorok funkciói közül a legfontosabbak az MSC-k aszimmetrikus osztódásának szabályozása, valamint az elköteleződés szakaszait és a sejtosztódások számát meghatározó gének expressziója. A külső jeleket, amelyektől az MSC-k további fejlődése függ, mikro-környezetük biztosítja. Éretlen állapotban az MSC-k hosszú ideig szaporodnak, miközben megőrzik a differenciálódás képességét zsírsejtekké, miofibroblasztokká, hematogén szöveti sztrómává, porc- és csontsejtekké. Megállapították, hogy a vérben keringő CD34-negatív stromális sejtes elemek korlátozott populációja az általános véráramból visszatér a csontvelő sztrómájába, ahol CD34-pozitív hematopoietikus őssejtekké alakul. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a progenitor mezenchimális sejtek véráramban történő recirkulációja fenntartja a stromális őssejtek szöveti egyensúlyát a különböző szervekben azáltal, hogy mozgósítja a csontvelő éretlen stromális elemeinek közös készletét. Az MSC-k differenciálódása többféle mezenchimális fenotípusú sejtekké, valamint részvételük a csontok, porcok, zsírszövetek és inak regenerációjában vagy helyreállításában in vivo bizonyított kísérleti állatokon végzett adoptív transzfer modellek segítségével. Más szerzők szerint az MSC-k távoli migrációja az érrendszer mentén a multipotens mezenchimális progenitor sejtek rövid távú vagy lokális mozgásával kombinálódik a szöveten belül a porc helyreállítása, az izomregeneráció és más helyreállító folyamatok során.

A stromális szövetbázis lokális szártartalékai sejtek forrásaként szolgálnak a fiziológiás szövetregeneráció folyamataiban, és az MSC-k távoli transzportjával feltöltődnek, ahogy a stromális szövet szárkészletei felemésztődnek. Azonban a reparatív sejtpotenciál sürgősségi mobilizálásának szükségessége esetén, például politrauma esetén, az MSC-k teljes echelonja részt vesz a reparatív regeneráció folyamataiban, és a csontvelő mezenchimális progenitor sejtjei az általános véráramláson keresztül a perifériára toborozódnak.

Mezenchimális őssejt-transzplantáció

Bizonyos párhuzamok vonhatók a fiziológiai szövetregeneráció folyamatai és a méhen belüli fejlődés során kialakuló sejtek között. Az emberi és emlős embriogenezis során a csíralemezek ekto-, mezo- és endodermális készletéből különféle típusú specializált sejtek képződnek, de a mezenchima kötelező részvételével. Az embrionális mezenchimális szövet laza sejthálózata számos szabályozó, metabolikus, váz- és morfogenetikai funkciót lát el. Az ideiglenes szervek lerakódása csak a mezenchima kondenzációja után következik be a progenitor sejtek klonogén növekedése miatt, amelyek az organogenezis elsődleges morfogenetikai jeleit generálják. Az embrionális mezenchima stromális származékai alkotják az ideiglenes szervek sejtes vázát, és az elsődleges vér- és nyirokerek növekedése révén képezik alapot a jövőbeni energia-plasztikus ellátásukhoz. Más szóval, a magzati szervek mikrokeringési egységének stromális elemei a szerkezeti és funkcionális egységeik kialakulása előtt keletkeznek. Ezenkívül a mezenchimális sejtek aktív migrációja az organogenezis során a fejlődő szervek térbeli orientációját biztosítja azáltal, hogy a homeotikus Hox-típusok korlátozásán keresztül kijelöli térfogati határaikat. A stromális váz a parenchimális szervek szerkezeti és funkcionális egységeinek összeállásához is alapul szolgál, amelyek gyakran morfogenetikailag és funkcionálisan teljesen eltérő sejteket tartalmaznak. Következésképpen az embriogenezis során a mesenchyma funkciói elsődlegesek, és szabályozó jelek generálásán keresztül valósulnak meg, amelyek aktiválják a progenitor hámsejtek regionális proliferációját és differenciálódását. Az embrionális mesenchyma sejtek olyan növekedési faktorokat termelnek, mint a HGF-b, HGF-b, CSF, amelyekhez a parenchymális progenitor sejtek megfelelő receptorokkal rendelkeznek. Egy felnőtt szervezet differenciált érett szövetében a stromális sejtek hálózata jeleket is generál a nem-mezenchimális eredetű progenitor sejtek életképességének és proliferációjának fenntartásához. A posztnatális ontogenezisben azonban a stromális szabályozó jelek spektruma eltérő (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF stb.), és célja a sérült szöveti zónák fiziológiai regenerációjának vagy helyreállításának biztosítása. Továbbá a stromális szabályozó faktorok spektrális jellemzői az egyes szövettípusokban, sőt egy szerven belül is eltérőek. Különösen a vérképzés és a limfopoézis, a vérképző és immunkompetens sejtek proliferációjával és differenciálódásával, csak bizonyos szervekben fordul elő, amelyek határain belül a stromális mikro-környezet működik, biztosítva a feltételeket a vérképző és limfoid sejtek éréséhez. A vérképző és limfoid sejtek azon képessége, hogy egy adott szervet újra benépesítsenek, proliferálódjanak és érjenek a mikroszerkezeti fülkéiben, a mikro-környezet szabályozó faktoraitól függ.

A multipotens mezenchimális progenitor sejtek által termelt extracelluláris mátrix összetevői közül ki kell emelni a fibronektint, a laminint, a kollagént és a proteoglikánokat, valamint a CD44-et (hialuronán és oszteopontin receptor), amelyek jelentős szerepet játszanak a sejtek közötti kölcsönhatások szervezésében és az extracelluláris mátrix kialakításában a csontvelőben és a csontszövetben. Bizonyított, hogy a csontvelői multipotens mezenchimális progenitor sejtek olyan stromális mikrokörnyezetet hoznak létre, amely induktív és szabályozó jeleket biztosít nemcsak az MSC-knek, hanem a hematopoietikus progenitoroknak és a csontvelő más, nem mezenchimális őssejtjeinek is. Ismert, hogy az MSC-k vérképzésben való részvételét az határozza meg, hogy képesek-e a vérképzést támogató stromális sejtekké differenciálódni, és ezt az instrukciós jelet az MSC-k közvetlenül a hematopoietikus őssejtektől veszik fel. Ezért a kultúrában a stromális progenitor sejtek hálózata táplálóbázisként szolgál az összes hematopoietikus sejtklón fejlődéséhez.

Egy érett szervezetben a hemo- és limfopoézis intenzitása dinamikus egyensúlyban van az érett vérsejtek és az immunrendszer sejtjeinek „felhasználásával” a periférián. Mivel a csontvelő és a nyirokszervek stromális sejtjei rendkívül ritkán újulnak meg, a stromális struktúrák jelentős átalakulása nem következik be. A rendszert a hemo- vagy limfopoézis bármely szervének mechanikai károsodása kibillenheti a dinamikus egyensúlyból, ami egyenletes, egymást követő változásokhoz vezet, amelyek nemcsak és nem annyira a hematopoietikus vagy limfoid elemeket, mint inkább a sérült szerv stromális struktúráit érintik. A reparatív regeneráció folyamatában először a stromális bázis képződik, amelyet ezután hematopoietikus vagy immunkompetens sejtek népesítenek be újra. Ez a régóta ismert tény teszi a traumát követő regenerációt kényelmes modellé a hematopoietikus szervek stromális mikro-környezetének tanulmányozására. Különösen a csőcsontok velőüregének mechanikus kiürítését alkalmazzák a csontvelő reparatív regenerációjának - a curettage - tanulmányozására, amely lehetővé teszi a hematopoietikus szövet gyors és hatékony eltávolítását a dinamikus egyensúlyi állapotból. A tengerimalacok sípcsontjának velőüregének mechanikus kiürítése utáni csontvelő hematopoietikus és stromális komponenseinek reparatív regenerációs folyamatainak vizsgálata során azt találták, hogy nincs közvetlen összefüggés a hematopoietikus és stromális sejtek regenerációs mutatói (a hematopoietikus sejtek száma, a stromális progenitor sejtek koncentrációja és száma) között. Ezenkívül kiderült, hogy a stromális progenitor sejtek populációjának növekedése a kürettázs után korábban következik be, és maguk a stromális fibroblasztok foszfatáz-pozitívvá válnak, ami jellemző az oszteogén szövetre. Azt is megállapították, hogy 3-5 csőcsont kürettázsa ezen sejtpopuláció növekedéséhez vezet a nem operált csontok csontvelőjében, sőt a lépben is, amely tengerimalacokban kizárólag limfopoietikus szerv.

A tengerimalacok curett sípcsontjainak csontvelőjében zajló reparatív folyamatok morfológiai képe általában megfelel a szakirodalomban leírt, más fajok állatain végzett kísérletekben kapott adatoknak, és a vérképző szövet eltávolítása után bekövetkező változások dinamikája minden állatfaj esetében azonos, és az eltérés csak az időparamétereket érinti. Morfológiailag a vérképzés fázissorrendje a kiürült velőüregben a vérképzés helyreállításának fázissorrendje a vérrög szerveződésének, a durva rostos csontszövet képződésének, annak felszívódásának, a sinusoidok fejlődésének és a retikuláris stroma kialakulásának egymást követő folyamataiból áll, amelyet később vérképző elemek benépesítenek újra. Ebben az esetben a csontvelői szövet regenerációja során a vérképző őssejtek számának növekedésével párhuzamosan nő a vérképző őssejtek tartalmának növekedése.

Yu. Gerasimov és munkatársai (2001) összehasonlították a hematopoietikus sejtek és a stromális progenitor sejtek számának változásait a regenerációs folyamat egyes fázisaiban. Kiderült, hogy a csontvelősejtek mennyiségi változásai a kikeményített csontban megfelelnek a regeneráció morfológiai jellemzőinek dinamikájának. A szerzők a regenerátum sejttartalmának csökkenését az első három napban a hematopoietikus sejtek pusztulásával társítják, amelyet a proliferáló retikuláris szövet által létrehozott mikrokörnyezet kedvezőtlen hatása okoz a konzervált csontvelőben az epifízis régióban, valamint az osteoid szöveti gócok kialakulásával az utóbbiban és az érkárosodással a kikeményítés során. A 7-12. napon a magvas sejtek szintjének növekedése egybeesik a mieloid vérképzés egyes gócainak megjelenésével a stromális elemek proliferációs zónáiban. A 20. napon jelentős regenerált csontvelői területek és jól fejlett orrmelléküregek jelennek meg, amelyeket a sejtek teljes számának jelentős növekedése kísér. A hematopoietikus elemek száma azonban ebben az időszakban a kontrollszint 68%-a. Ez összhangban van a korábban publikált adatokkal, miszerint a vérképző sejtek száma a curettage után csak a műtét utáni 35-40. napon éri el a normát.

A korai poszttraumás időszakban a vérképzés helyreállításának fő forrása a curettage során megőrzött lokális sejtes elemek. A későbbi szakaszokban a csontvelő vérképző szövetének regenerációjának fő forrása az őssejtek, amelyek újra benépesítik a szabad stromális zónákat. Ami a stromális sejtek egyes kategóriáit (endoteliális, retikuláris és osteogén) illeti, a csontvelő üregének reorganizációja során keletkezésüket biztosító források továbbra sem tisztázottak. Yu. V. Gerasimov és munkatársai (2001) tanulmányának eredményei azt mutatják, hogy a curettage után megőrzött csontvelőben a fibroblaszt telepeket alkotó sejtek koncentrációja szignifikánsan magasabb, mint a normál csontvelőben. A szerzők úgy vélik, hogy a curettage a vérképző sejtek intenzívebb szelektív kimosódását eredményezi a telepképző stromális sejtekhez képest, amelyek részt vesznek a stroma kialakulásában, és szorosabban kötődnek annak fő anyagához, mint a vérképző sejtek.

A fibroblaszt kolóniákat alkotó sejtek számának változásának dinamikája korrelál az oszteogenezis folyamatok intenzitásával, a csonttrabekulák későbbi felszívódásával és a retikuláris stróma kialakulásával, amelyet vérképző sejtek népesítenek be. A regeneráció meghatározott időszakaiban a stromális progenitor sejtek többsége durva rostos csontszövetet és retikuláris stromá-t képez. Hosszan tartó oszteoszintézis körülményei között bekövetkező combcsonttörések esetén az 5. napon a regenerációs zónában megnő a fibroblaszt kolóniákat alkotó sejtek koncentrációja és száma, és az intenzív csontképződés időszakában számuk hatszorosára nő. Ismert, hogy a fibroblaszt kolóniákat alkotó csontvelősejtek oszteogén tulajdonságokkal rendelkeznek. A stromális progenitor sejtek száma megnő, mielőtt a vérképző sejtek betelepednének a kikeményített csontvelő területére. Ez jól egyezik azokkal az adatokkal, hogy a stromális sejtek biztosítják a vérképző mikro-környezet kialakulását. Úgy tűnik, hogy a vérképző mikro-környezet kialakulása a stromális szövet regenerációjának bizonyos szintjének felel meg, és a vérképző sejtek száma a vérképzéshez alkalmas stromális platform bővülésével növekszik.

A szerzők azon adatai a legérdekesebbek, amelyek szerint a curettage után azonnal megnő a stromális progenitor sejtek száma a csontváz távoli részein. A hatodik órától a huszadik napig bezárólag több mint kétszeresére nő mind a koncentráció, mind a fibroblaszt telepeket alkotó sejtek száma az ellenoldali sípcsonton. Ennek a jelenségnek a mechanizmusa valószínűleg azzal a ténnyel függ össze, hogy a masszív csontvelő-károsodás nagyszámú vérrögképződéshez vezet, egyidejűleg jelentős számú vérlemezke pusztulásával és vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF) felszabadulásával a vérbe, amelyről ismert, hogy a proliferatív poolon kívül a szervezetben található fibroblaszt telepeket alkotó sejtek proliferációját okozza. Nyulakon végzett kísérletekben az MSC-k helyi adagolása elősegíti a műtéti úton sérült térdízület porcszövetének helyreállítását, ami összefüggésben állhat az injektált MSC-kből származó porcsejtek képződésével. A laboratóriumi patkányokban a csonthibák reparatív regenerációja azonban jelentősen fokozódik a kerámia keretbe zárt mezenchimális őssejtek alkalmazásával. Ezért feltételezhető, hogy ha nem az RBOC, akkor valamilyen más, a sérült stromális sejtekből származó tényező távoli stimuláló hatást fejt ki a mezenchimális progenitor sejtek proliferációjára az ép csontvelői zónákban, és serkenti azok migrációját a csontvelő-defektus területére. Ezt viszont ellentmondják a korábbi évek irodalmi adatai, amelyek azt mutatják, hogy a mikrokörnyezetért felelős stromális sejtek – a hematopoietikus sejtekkel ellentétben – nem képesek migrációra, és lokális forrásokból származnak.

Yu. Gerasimov és munkatársai (2001) tanulmányának eredményei azonban azt mutatják, hogy a mechanikai trauma nemcsak a curettált csont stromális szövetének éles átrendeződését okozza, hanem a távoli ép csontok stromájában is jelentős változásokat, azaz a stromális szövet szisztémás választ ad a lokális traumára. Ezenkívül politrauma - többszörös curettage - esetén ez a reakció fokozódik, és nemcsak az operált csontban és a csontváz távoli részeiben, hanem a nyirokszervekben, különösen a lépben is megfigyelhető. A csontvelő és a lép stromális szövetének ilyen szisztémás válaszának mechanizmusa a lokális traumára és politraumára továbbra sem ismert. Feltételezik, hogy ez a folyamat a csontvelő velőüregének mezenchimális stromája által kiválasztott humorális faktor hatásával jár. A csontvelő és a lép stromális sejtjei által termelt szervspecifikus humorális faktor lehetőségét, amely a fibroblaszt telepeket alkotó sejtek proliferációjáért felelős, a csontvelő egyrétegű tenyészeteiben mutatott kolóniastimuláló aktivitásukra vonatkozó adatok bizonyítják.

E tekintetben érdemes megjegyezni, hogy multipotens mezenchimális progenitor sejtek szisztémás adagolásával származékaik nemcsak a csontvelőt, hanem más szöveteket is újra benépesítik, amit különösen génterápiára használnak. Kimutatták, hogy nagy mennyiségű, vad típusú genommal rendelkező MSC-k intravénás adagolása esetén a kollagén I gén mutációjával rendelkező egereknek a donorsejtek akár 30%-ban is helyettesíthetik a recipiensek csont- és porcszövetének sejtjeit, és a humán IL-3-at kiválasztó transzfektált egér mezenchimális őssejtek 9 hónapig hatékonyan támogatják a vérképzést, ha azokat humán hematopoietikus őssejtekkel egyidejűleg adják be immunhiányos egereknek.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Mezenchimális őssejtek genetikai módosítása

Az MSC-k kísérleti genetikai módosításának sikerei közül érdemes megemlíteni a IX. faktor génjének humán MSC-kbe történő transzfekcióját, majd a transzfektáns sejtek immunhiányos egerekbe történő átvitelét, ami az antihemofil B faktor megjelenéséhez vezet a vérben a transzplantációt követő 8 hétig. Ebben a kísérletben a transzfektált sejtekben a IX. faktor poszttranszlációs módosítását végezték γ-glutamil-karboxilázzal. Az MSC-k transzdukciója humán IX. faktort kódoló retrovirális vektorral kevésbé volt sikeres - ezen sejtek későbbi beadása egy hemofília B-ben szenvedő kutyának a IX. faktor terápiás szintjét biztosította, fenntartva a koagulációs hemosztázis normális intenzitását, mindössze 12 napig.

Az állatok agyparenchymájába történő mezenchimális őssejtek átültetése kimutatta, hogy a donor éretlen sejtjei mind neuronális, mind gliasejtes populációkká alakulnak át. Az egészséges donor mezenchimális szövet neuronális származékainak beültetése elméletileg lehetővé teszi az agyi anyagcsere genetikai rendellenességeinek korrigálását Gaucher-kórban és más lipid-, gangliozid- vagy szénhidrát-anyagcsere-zavarokban szenvedő betegeknél.

A csontvelői stromális őssejtek idegi és májszöveti progenitor sejtekké történő transzdifferenciálódásának kísérleti feltételeinek kutatása folyamatban van. A kutatók figyelme a differenciálódási induktorok és a speciális kondicionált táptalajok kombinációira összpontosul. Különösen a stromális sejtek elsődleges tenyészetének izolálásához a DMEM/F12 (1/1) táptalajban, 10% magzati borjúszérummal újraszuszpendált csontvelősejteket 200 000/cm2 sűrűséggel oltják be. 24 óra elteltével a nem tapadt sejteket eltávolítják, és a műanyaghoz tapadt fibroblasztszerű sejteket egy hétig tenyésztik. A csontvelői stromális sejtek neuroblasztokká történő differenciálódásához az egérembrionális fibroblasztok elsődleges tenyészetének háromnapos tenyésztésével kapott kondicionált táptalajt, valamint 2% magzati borjúszérummal és 20 ng/ml NF vagy 10-6 M retinsav hozzáadásával kapott DMEM/F12 táptalajt (1/1) használnak (neuroinducerként, amelyet egér és emberi embrionális őssejtek idegi differenciálódásához használnak). A csontvelői stromális sejtek hepatocita prekurzor sejtekké történő differenciálódását egy kondicionált táptalajban indukálják, amelyet egérembrionális májsejtek primer tenyészetének háromnapos DMEM/F12 táptalajban (1/1) történő tenyésztésével hoznak létre 10% magzati borjúszérum hozzáadásával.

Itt ismét meg kell jegyezni, hogy a csontvelő sztrómájának telepképző sejtjei heteromorfak, és két típusra oszthatók. Az első típusba tartoznak a fibroblasztszerű sejtek, amelyek nagy maggal és egy vagy két nukleólusszal rendelkező filopodiumokat alkotnak. A második típust a kis orsó alakú sejtek képviselik. Amikor mindkét típusú sejtet primer egérembrionális fibroblasztok tápláló rétegén kapott kondicionált táptalajon tenyésztjük, a neuroblasztokhoz hasonló sejtek a 3-4. napon jelennek meg a tenyészetben. Ebben a szakaszban leggyakrabban orsó alakúak, egy vagy két hosszú nyúlvánnyal, amelyek filopodiumokban végződnek. Kevésbé gyakoriak a piramis alakú vagy csillag alakú sejtek rövid dendritekkel. Egyes neuroblasztok dendritjei jellegzetes tágulatokkal (növekedési rügyekkel) és elágazásokkal rendelkeznek a disztális részükön, míg másoknak határozott növekedési kúpjaik vannak filopodiumokkal, amelyeken keresztül a dendritek növekednek. A neuronokká differenciálódó neuroblasztokban rejlő hasonló morfológiai jellemzőket (rügyek és növekedési kúpok filopodiumokkal) részletesen leírták a neurogenezissel foglalkozó tanulmányokban. Ennek alapján egyes szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy a tenyészetben talált sejtek neuroblasztok. Különösen E. Shchegelskaya és munkatársai (2002) egy stromális sejtek primer tenyészetének két hétig tartó, 3-4 naponta cserélt kondicionált táptalajban történő tenyésztése után azt tapasztalták, hogy egyes sejtek proliferálódtak, miközben differenciálatlan állapotukat megtartották. Külsőleg ezek a sejtek fibroblasztokra hasonlítottak, és a tenyészetben a differenciálódó neuroblasztokkal együtt voltak kimutathatók. A sejtek többsége (körülbelül 80%) az idegszövet sejtjeivé, elsősorban neuronokká történő differenciálódás különböző szakaszaiban volt. Ezen sejtek dendritikus nyúlványai szoros kapcsolatban álltak egymással, így a sejtek fokozatosan az ideghálózat szakaszait alkották a szubsztráton hosszú, többsejtű szálak formájában. A neuroblasztok dendritikus nyúlványai jelentősen meghosszabbodtak, némelyikük 8-10-szeresére meghaladta magának a neurontestnek a hosszát. A piramis- és csillagsejtek aránya fokozatosan nőtt. A csillagsejtek dendritjei elágaztak. A szerzők szerint a piramis- és csillagsejtek későbbi differenciálódása az orsó alakú sejtekhez képest megfelel az állatok normális neurogenezisének szakaszainak sorrendjének. Ennek eredményeként a szerzők arra a következtetésre jutnak, hogy a csontvelői stromális őssejtek indukált neurogenezisen mennek keresztül, amelynek során mindhárom fő neurontípus neuroblasztokból képződik in vitro. Idegsejt-prekurzorokat a csontvelői stromális sejtek 3-4 napig tartó, 2% magzati szérumot és 20 ng/ml LIF-et tartalmazó táptalajban történő tenyésztése során is kimutatták. Ebben az esetben azonban az őssejtek nagyon lassan osztódtak, a neuroblaszt differenciálódás csak az esetek 30%-ában történt meg, és nem alakítottak ki neuronális hálózatokat. A retinsavat az idegsejt-differenciálódás egyik induktoraként használva a szerzők a tenyészetben az idegsejtek akár 25-30%-át is megkapták,túlnyomórészt gliaelemekkel - asztrociták és oligodendrociták. A neuronok az összes idegsejtnek csak egyharmadát tették ki, bár mindhárom típus képviseltette magát: orsó alakú, piramis és csillagsejtek. A stromális sejtek retinsavas táptalajon történő tenyésztésének 6. napján az idegsejtek differenciáltabbá váltak, és az egyes piramissejtekben axonokat találtak, amelyek a normál neuroontogenezis során a dendritikus nyúlványok kialakulása után jelennek meg. A szerzők szerint az idegsejtek alacsony hozama ellenére a retinsavas indukciós módszernek megvannak az előnyei: az oligodendrociták és az asztrociták mielinizációs és táplálkozási funkciókat látnak el a dendritek és axonok növekedése során, és szükségesek az idegszövet normális képződéséhez. Ezért a sérült területek in vivo helyreállításához jobb gliasejtekkel dúsított neuronszuszpenziót használni.

A második kísérletsorozatban a szerzők megkísérelték a csontvelői stromális sejtek májsejtekké történő differenciálódását kiváltani. Három napig tartó, egérembrionális hepatociták inkubálásával kapott kondicionált táptalajban végzett csontvelői stromális őssejtek tenyésztése után nagy, gömb alakú, gyakran kétmagvú sejteket találtak, különböző méretű citoplazmatikus zárványokkal. Ezek a sejtek a differenciálódás különböző szakaszaiban voltak, és méretükben, sejtmagjaik számában és a citoplazmában lévő zárványokban különböztek. A sejtek többségében glikogént mutattak ki, amely alapján a szerzők hepatocita prekurzor sejtekként azonosították őket. Mivel a tenyészetben nem találtak neuroblasztokhoz hasonló sejteket, arra a következtetésre jutottak, hogy az embrionális hepatociták tenyésztésével kapott kondicionált táptalajban hiányoztak az idegsejtek differenciálódási faktorai, és ezzel szemben olyan faktorokat tartalmazott, amelyek a csontvelői stromális sejtek hepatocita prekurzor sejtekké történő differenciálódását indukálták. Összefoglalva, a szerzők a csontvelői stromális sejtek pluripotenciájának jelenlétét feltételezik, mivel in vitro ideg- vagy májszöveti sejtekké differenciálódnak a használt specifikus kondicionált táptalajtól és induktoroktól függően.

Néhány tanulmány valóban helyesen mutatta ki a csontvelő stromális sejtjeinek szívizomsejtekké, porcsejtekké, csont- és idegszövetsejtekké történő differenciálódását. Bizonyítékok vannak arra, hogy a csontvelősejtek között vannak olyan őssejt-populációk, amelyek képesek hepatocitákká differenciálódni. Ezen adatok fényében a fenti egereken végzett kísérletek eredményei továbbra is a pluripotens mezenchimális őssejtek csontvelőben való jelenlétének további megerősítésének tekinthetők, amelyek képesek egy felnőtt szervezet különböző szöveteinek sejtjeivé differenciálódni.

Mezenchimális őssejt-transzplantáció

A klinikai transzplantológiában az emberi mezenchimális őssejtek felhasználhatók a hematopoietikus őssejtek, valamint korai precommittált leszármazottaik expanziójának biztosítására. Különösen az autológ hematopoietikus őssejtek és MSC-k beadása rákos betegekbe nagy dózisú kemoterápia után felgyorsítja a neutrofilek és vérlemezkék számának helyreállítását a perifériás vérben. A mezenchimális őssejtek allo- és autológ transzplantációit multiplex mielóma, aplasztikus anémia és spontán trombocitopénia kezelésére használják - ezek a hematopoietikus szövet sztrómájának primer hibájával összefüggő betegségek. A sejtterápia hatékonysága az onkohematológiai patológiában sok esetben magasabb a stromális és hematopoietikus őssejtek egyidejű bevezetésével, ami a hematopoiesis helyreállításának posztoperatív időszakának csökkenésében, a regionális és keringő rákos sejtek nem szelektív pusztulása miatti halálos kimenetelek számának csökkenésében nyilvánul meg, amelyekben a beteg saját progenitor hematopoietikus sejtjei is elpusztulnak. Az MSC-k és más multipotens mezenchimális progenitor sejtek klinikai gyakorlatban való alkalmazásának kilátásai a csontvelő-aspirátumokból való kinyerésük relatív egyszerűségének, a tenyészetben való expanziónak és a terápiás gének transzfekciójának köszönhetők. Ugyanakkor a multipotens mezenchimális progenitor sejtek helyi beültetése felhasználható a helyi szöveti hibák kompenzálására, és mezenchimális eredetű szövetek szisztémás diszfunkciói esetén nem zárható ki azok bejutása az általános véráramba.

Azoknak a munkáknak a szerzői, amelyekben a MSC-k lokális, szisztémás transzplantációra és génterápiára való felhasználásának kilátásait a stromális sejtbiológia szempontjából elemzik, óvatosabbak az érvelésükben. A szülés utáni csontvelőt hagyományosan két fő, egyértelműen meghatározott sejtvonalakból álló szervnek tekintik - magából a hematopoietikus szövetből és a hozzá kapcsolódó támogató sztrómából. Ezért a csontvelő mezenchimális őssejtjeit kezdetben kizárólag a hematopoietikus mikrokörnyezet szabályozó faktorainak termeléséhez szükséges stromális alap forrásának tekintették. Ezután a kutatók figyelme az MSC-k, mint a csontvázszövetek ősforrásának szerepének vizsgálatára irányult. A legújabb adatok a csontvelői stromális sejtek ideg- vagy izomszövet kialakulásával történő differenciálódásának váratlan potenciálját jelzik. Más szóval, a mezenchimális őssejtek transzgermális plaszticitást mutatnak - azt a képességet, hogy olyan sejttípusokká differenciálódjanak, amelyek fenotípusosan nem kapcsolódnak az eredeti szövet sejtjeihez. Ugyanakkor a csontvelői stromális sejtek biológiájának egyes aspektusai továbbra sem tisztázottak és megoldatlanok mind általános biológiai szempontból, mind az egyes részletekben, beleértve a csontvelői stromális sejtek azonosítását, természetét, eredetét, fejlődését és in vivo működését, valamint a megengedett ex vivo differenciálódási potenciált és az in vivo terápiás alkalmazás lehetőségeit. Az MSC-k potenciáljáról kapott adatok, valamint más őssejtek regeneratív potenciáljával kapcsolatos vizsgálatok eredményei szöges ellentmondásban állnak a biológiában megállapított dogmákkal.

Alacsony sűrűségben tenyésztve a csontvelői stromális őssejtek különálló kolóniákat alkotnak, amelyek mindegyike egyetlen progenitor sejtből származik. A stromális progenitor sejtek százalékos aránya a magvas csontvelői sejtekben, amelyet a telepképző képesség határoz meg, nagymértékben függ mind a tenyésztési körülményektől, mind az MSC fajoktól. Például rágcsálókban a besugárzott csontvelői tápláló sejtek és szérum jelenléte a tenyészetben feltétlenül szükséges a stromális progenitor sejtek maximális számának eléréséhez, míg emberekben a mezenchimális őssejtek telepképző hatékonysága független mind a táplálótól, mind a táptalajtól. Az ismert mitogén faktorok száma, amelyek stimulálják a stromális progenitor sejtek proliferációját, korlátozott. Ezek közé tartozik a PDGF, EGF, FGF, TGF-b és IGF1. Optimális tenyésztési körülmények között a poliklonális MSC sejtvonalak több mint 50 sejtosztódást képesek elviselni in vitro, lehetővé téve több milliárd csontvelői stromális sejt kinyerését 1 ml aspirátumból.

A csontvelői stromális sejtek populációja azonban heterogén, ami mind a telepek méretének változékonyságában, mind képződésük eltérő sebességében, mind a sejtek morfológiájának változatosságában nyilvánul meg, amely a fibroblasztszerű orsó alakútól a nagy lapos sejtekig terjed. Az ilyen tenyészetek fejlődése során 20 nap után fenotípusos heterogenitás is megfigyelhető. Egyes telepeket az alkalikus foszfatáz magas expressziója jellemez, mások egyáltalán nem expresszálják, a harmadik típusú telepek pedig a központi régióban foszfatáz-pozitívak, a periférián pedig foszfatáz-negatívak. Az egyes telepek csontszövet-csomókat képeznek (a mátrixmineralizáció kezdetét az alizarinvörössel vagy Van Koss szerint kalciumra való festés jelzi). Más telepekben zsírfelhalmozódás történik, amelyet olajvörössel végzett G-festéssel azonosítanak. Ritkábban a mezenchimális őssejtek telepei porcot képeznek, amelyeket Alcian-kékkel festenek.

Kísérleti állatokba történő ektopikus transzplantáció után a poliklonális MGK sejtvonalak ektopikus csontot képeznek, retikuláris sztrómával, amely mielopoézishez és zsírsejtekhez, ritkábban porcszövethez kapcsolódik. Csontvelői stromális sejtek monoklonális sejtvonalainak átültetése esetén egyes esetekben kimérizmus figyelhető meg, amelyben a de novo csont csontszövetsejtekből áll, donor eredetű sztrómát és zsírsejteket tartalmaz, míg a hematopoietikus vonal és az érrendszer sejtjei a recipiensből származnak.

E vizsgálatok eredményei megerősítik a csontvelői stromális progenitor sejt őssejt jellegét, amelyből a klonális vonal származik. Azt is jelzik, hogy nem minden, tenyészetben klonogén sejt valóban multipotens őssejt. Egyes kutatók úgy vélik, és mi is osztjuk véleményüket, hogy az egyes klónok valódi differenciálódási potenciáljáról a legmegbízhatóbb információkat csak in vivo, transzplantáció után lehet nyerni, és nem a származékaik fenotípusának in vitro meghatározásával. Az oszteo-, kondro- vagy adipogenezis fenotípusos markereinek expressziója a tenyészetben (mRNS-sel vagy hisztokémiai technikákkal meghatározva), sőt az mineralizált mátrix termelése sem tükrözi az egyes klónok pluripotenciájának mértékét in vivo. Ezért az őssejtek azonosítása egy stromális sejtcsoportban csak utólag, egy biológiai transzplantációs vizsgálat megfelelő körülményei között lehetséges. Különösen a porcképződés figyelhető meg nagyon ritkán a nyílt transzplantációs rendszerekben, míg a porcképződés korántsem ritka zárt rendszerekben, például diffúziós kamrákban vagy stromális sejtek in vitro mikromasszás kultúráiban, ahol lokálisan alacsony oxigénnyomást érnek el, ami elősegíti a porcszövet kialakulását. Ezért még a transzplantációs technika, valamint a nem specifikus in vitro tenyésztési körülmények is jelentősen befolyásolják az MSC differenciálódás mértékét.

A meghatározott kísérleti körülmények között végzett kísérleti transzplantáció az arany standard a csontvelő stromális sejtjeinek differenciálódási potenciáljának meghatározására, és kulcsfontosságú eleme azonosításuknak. Történelmileg a csontvelő stromális sejttranszplantációjával kapcsolatos vizsgálatok a csontvelő-transzplantáció általános problémájához kapcsolódnak. Megállapították, hogy a hematopoietikus mikrokörnyezetet a csontvelő stromális sejtvonalak átültetésével hozzák létre, és ez biztosítja a hematopoietikus szövet ektopikus fejlődését a transzplantációs zónában. A mikrokörnyezet donorból, a hematopoietikus szövet pedig a gazdaszervezetből származik, így az ektopikus csontot valódi „invertált” csontvelő-transzplantációnak tekinthetjük. A csontvelő stromális sejtjeinek lokális átültetése elősegíti a csonthibák hatékony korrekcióját, ami kifejezettebb, mint a spontán reparatív regeneráció esetében. Számos preklinikai vizsgálat kísérleti modelleken meggyőzően bizonyította a csontvelő stromális sejttranszplantációk ortopédiában való alkalmazásának lehetőségét, bár a legegyszerűbb esetekben is a legkörültekintőbb munkára és elemzésre van szükség ezen módszerek optimalizálásához. Különösen az oszteogén stromális sejtek ex vivo terjeszkedésének optimális feltételeit még nem állapították meg, az ideális hordozó szerkezete és összetétele, valamint a térfogati csontregenerációhoz szükséges sejtek száma még nem alakult ki.

A mezenchimális eredetű szövetek regenerálására ex vivo tenyésztett csontvelői stromális sejtek felhasználása mellett az MSC-k szokatlan plaszticitása potenciális alkalmazási lehetőségeket nyit meg az idegsejtek regenerálására vagy géntermékek központi idegrendszerbe juttatására. Ez elvileg leegyszerűsíti az idegrendszeri károsodások sejtterápiáját, mivel nincs szükség autológ emberi idegi őssejtek beszerzésére. A csontvelői sejtek potenciális alkalmazásairól beszámoltak mind valódi stromális, mind extrastromális eredetű kardiomiociták és miogén progenitor sejtek előállítására.

Kísérletet folytatnak csontvelői stromális sejtek szisztémás transzplantációjával gyakori csontvázbetegségek kezelésére. Kétségtelen, hogy a csontvelői stromális sejtek felelősek a csontvázbetegségek genetikai rendellenességeiért, amit jól illusztrál a genetikai információk vektoros átvitele ezen sejtek segítségével, ami kóros csontszövet kialakulásához vezet kísérleti állatokban. Azonban a stromális sejtek azon képessége, hogy a véráramba jutás után beágyazódnak, megtapadnak, szaporodnak és differenciálódnak a vázizomzatban, még nem bizonyított.

Ez részben annak köszönhető, hogy a standard csontvelő-transzplantáció során a sztrómát nem a vérképző szövettel együtt ültetik át, így a szisztémásan beadott strómasejtek sikeres beágyazódásának értékelésére szolgáló szigorú kritériumokat még nem dolgozták ki. Nem szabad elfelejteni, hogy a marker gének jelenléte a szövetkivonatokban vagy a donor eredetű sejtek izolálása tenyészetben nem jelzi a sejtek beágyazódását, hanem csak a túlélésüket. Még a csontvelői strómasejtek egér végtagba történő intraarteriális injekciója is gyakorlatilag nulla beágyazódáshoz vezethet, annak ellenére, hogy a donor eredetű sejtek nagy számban találhatók a csontvelő mikrovaszkulatúrájában. Sajnos az ilyen sejteket általában „beágyazódottnak” nevezik egyszerűen a donor sejtek marker génjeinek ex vivo tenyészetben történő kimutatása alapján. Ezenkívül meggyőző bizonyítékokat kell szolgáltatni a donor eredetű differenciált és funkcionálisan aktív sejtek hosszú távú integrációjáról a vizsgált szövetekbe. Számos publikált cikkben, amelyek a csontvelői strómasejtek csontvázba történő beágyazódásáról számolnak be, feltűnő az ilyen jellegű egyértelmű adatok hiánya. Meg kell azonban jegyezni, hogy néhány helyes állatkísérlet valóban megállapította a stromális progenitor sejtek korlátozott, de valódi beágyazódását szisztémás beadásukat követően.

Ezek az adatok összhangban vannak a csontvelő miogén progenitor sejtjeinek az érrendszeren keresztül az izomba juttatásának lehetőségét vizsgáló tanulmányok eredményeivel. Nem szabad azonban elfelejteni, hogy mind a váz-, mind az izomszövet a fejlődés és növekedés során extravaszkuláris sejtmozgások alapján képződik, amelyek olyan migrációs folyamatokat használnak, amelyek nem járnak vérkeringéssel. Ha létezik egy független keringési út a progenitor sejtek szilárd fázisú szövetekbe juttatására, feltételezhető-e fiziológiásan keringő mezenchimális progenitor sejtek létezése? Mi ezeknek a sejteknek az eredete mind a fejlődő, mind a posztnatális szervezetben, és hogyan hatolnak be az érfalba? E kérdések megoldása feltétlenül szükségesnek tűnik, és a lehető legkörültekintőbb preklinikai elemzést igényli. Még a kérdésekre adott válaszok megtalálása után is megoldatlanok maradnak a csontváz növekedésével és a kötőszövet átalakulásával kapcsolatos problémás kinetikai szempontok. Ugyanakkor az oszteogenezis rendellenességeinek kezelése a mutált csontváz progenitor sejtek teljes populációjának egészséges stromális elemekkel való helyettesítésével valódi klinikai kilátásnak tűnik. Ebben az esetben a patológiás oszteogenezis okozta lokális törési zónák vagy deformációk, valamint a csontszövet destruktív változásai korrigálhatók in vitro tenyésztett stromális őssejtekkel. Ezért célszerű a jövőbeli kutatásokat az autológ mutált osteogén progenitor sejtek ex vivo transzformációjának vagy genetikai korrekciójának problémáira összpontosítani.

A sejtek géntechnológiája, legyen az rövid távú vagy állandó, a sejtbiológia és a molekuláris biológia alapjává vált, számos tudományos felfedezés forrása az egyes fehérjék szerepével kapcsolatban a sejtek anyagcseréjében in vitro és in vivo. A molekuláris technológiák alkalmazása az örökletes patológiák és az emberi betegségek korrekciójára nagyon ígéretes a gyakorlati orvoslás számára, mivel a csontvelő stromális őssejtjeinek tulajdonságai lehetővé teszik egyedi transzplantációs sémák kidolgozását a csontváz genetikai betegségeinek korrekciójára. Ugyanakkor a mezenchimális prekurzor sejtek könnyen kinyerhetők a leendő recipienstől, genetikai manipulációra alkalmasak, és rövid idő alatt nagy mennyiségben képesek szaporodni. A mezenchimális őssejtek használata lehetővé teszi a genetikai információanyag intravaszkuláris vektorkonstrukciókon keresztüli közvetlen betegbe juttatásával járó korlátozások és kockázatok elkerülését. Hasonló stratégia alkalmazható az embrionális őssejtekre is, de az autológ posztnatális csontvelő stromális sejtek előnyösebb anyagnak számítanak, mivel bejuttatásuk kizárja a transzplantáció utáni lehetséges immunológiai szövődményeket. Rövid távú hatás eléréséhez, például a csontregeneráció felgyorsításához, a legoptimálisabb módszer a mezenchimális őssejtek genetikai módosítása elektroporáció, kémiai fúzió, lipofekció, plazmidok és adenovirális konstrukciók alkalmazásával. Különösen a BMP-2 csontvelői stromális sejtekbe történő vírustranszfekció bizonyult hatékonynak a csontregeneráció felgyorsításában kísérleti politraumákban. Az adenovirális vektor konstrukciók létrehozása előnyösebb a toxicitás hiánya miatt. A csontvelői stromális sejtek genetikai módosítását azonban ebben az esetben rendkívül alacsony stabilitás jellemzi. Ezenkívül a normál transzformált csontvelői stromális sejtekhez genetikai információ vektorhordozók használata szükséges, amelyek tízszer fertőzőképesebbek, mint más sejttípusok, ami jelentősen növeli a transzfektált sejtek pusztulásának százalékos arányát.

Bizonyos gének alacsony vagy nulla biológiai aktivitása által okozott recesszív betegségek kezelése a mezenchimális őssejtek hosszú távú vagy állandó módosítását igényli, amelyhez adeno-asszociált vírusok, retrovírusok, lentivírusok vagy adeno-retrovirális kimérák alkalmazása szükséges. Ezen vírusok transzportrégiói képesek nagy DNS-transzfektumok (akár 8 kb) átvitelére. A tudományos szakirodalom már beszámolt a szabályozó és marker molekulák - IL-3, CD2, VIII. faktor, valamint az L-DOPA szintézisében részt vevő enzimek - szintézisét kódoló retrovirális konstrukciókkal transzfektált csontvelői stromális sejtek exogén biológiai aktivitásáról. A szerzők azonban még ezekben a tanulmányokban is számos olyan korlátozásra mutatnak rá, amelyeket le kell küzdeni a technológia gyakorlati alkalmazása előtt. Az első probléma az MSC-módosítás folyamatának ex vivo optimalizálása. Ismert, hogy a csontvelői stromális sejtek hosszú távú (3-4 hetes) in vitro proliferációja csökkenti transzfekciójukat. Ugyanakkor az MSC-k magas szintű genetikai módosításának eléréséhez több transzfekciós ciklust kell végrehajtani. A második probléma a terápiás génexpresszió időtartamával kapcsolatos, amely még nem haladja meg a négy hónapot. A hatékony génexpresszió természetes csökkenését a promóterek inaktiválása és a módosított sejtek pusztulása okozza. A genetikai információ mezenchimális őssejtek segítségével történő átvitelének általános kilátásaival az előzetes vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy szükség van az ex vivo transzfekciós módszerek további optimalizálására, a kívánt irányba szabályozó megfelelő promóter kiválasztására, valamint a módosított csontvelői stromális sejtek in vivo önfenntartó képességének növelésére a transzplantáció után. Meg kell jegyezni, hogy a csontvelői stromális sejtek kívánt irányú módosítására szolgáló retrovirális konstrukciók alkalmazása nem mindig igényli azok kötelező beágyazódását. A transzfektált mezenchimális őssejtek stabil rezidenciával és a kötőszövetbe való kötelező aktív fizikai beépülés és működés nélkül is korrekciós funkciót tölthetnek be. Ebben az esetben biológiai mini-pumpaként kell tekinteni őket, amelyek in vivo egy olyan faktort termelnek, amelynek hiánya meghatározza a genetikai patológia megnyilvánulását.

A transzformált csontvelő stromális sejtjeinek alkalmazása a domináns genetikai patológia kezelésére, amelyet egy kóros vagy rendellenes biológiai aktivitással rendelkező gén expressziója jellemez, sokkal problematikusabb, mivel ebben az esetben blokkolni kell a torzított genetikai információ átvitelét vagy megvalósítását. A géntechnológia egyik módszere az embrionális őssejtek homológ rekombinációja transzgénikus állatok létrehozása érdekében. Azonban a homológ rekombináció rendkívül alacsony foka, valamint az ilyen rekombinánsok azonosításának, elválasztásának és terjeszkedésének problémái valószínűleg nem járulnak hozzá a módszer széles körű elterjedéséhez a közeljövőben, még akkor sem, ha új technológiai módszereket fejlesztenek ki. A domináns patológia génterápiájának második megközelítése a sérült DNS automatikus korrekcióján alapul, mivel a genetikai mutációk korrigálhatók a kívánt szekvenciájú exogén DNS (rövid DNS-oligonukleotidok vagy kiméra RNS/DNS-oligonukleotidok) bevitelével, amely a sérült genomban lévő homológokhoz kötődik. A harmadik lehetőség a kóros információk átvitelének blokkolása, amelyet kifejezetten erre a célra tervezett oligonukleotidok alkalmazásával érnek el, amelyek egy specifikus génhez kötődve egy háromkomponensű helikális szerkezetet képeznek, amely kiküszöböli a transzkripció lehetőségét.

Bár a genetikai betegségek genomszintű korrekciója továbbra is a legoptimálisabb és legelőnyösebb terápiás módszer, az mRNS ígéretes vektor (talán még könnyebben hozzáférhető) egy domináns negatív gén blokkolására is. Az antiszensz oligonukleotiddal vagy teljes szekvenciákkal rendelkező fehérjemolekulákat, amelyek blokkolják az mRNS kötődését a sejtes bioszintetikus apparátushoz, régóta használják a transzláció gátlására és/vagy az mRNS lebomlásának fokozására. Ezenkívül a kétszálú RNS gyors mRNS lebomlást indukál, amelynek mechanizmusa továbbra sem tisztázott. Azonban nem valószínű, hogy a rövid vagy egyetlen mutációval rendelkező mutáns allélról átírt mRNS-ek puszta eliminációja elősegíti a normál allél mRNS-ének expresszióját. Alternatív megoldásként alkalmazhatók a kalapácsfej- és hajtűriboszintézisek, amelyek képesek az mRNS nagyon specifikus régióihoz kötődni, majd a transzláció során azok hasítását és inaktiválását idézik elő. Jelenleg vizsgálják ennek a módszernek a kóros oszteogenezis terápiájában való alkalmazásának lehetőségét. Függetlenül attól, hogy pontosan mi a célpont - genomiális vagy citoplazmatikus elemek -, az új génterápiás technológiák sikerét a reagensek csontvelői stromális sejtekbe ex vivo történő beépítésének hatékonysága, egy specifikus vektor optimális megválasztása és a mezenchimális őssejtek stabil képessége fogja meghatározni a szükséges faktorok in vivo expressziójára.

Így a mezenchimális őssejtek felfedezése és váratlan tulajdonságai új fogalmi sémát teremtenek a sejtvonalak fejlesztéséhez. További interdiszciplináris kutatásokra van azonban szükség a stromális őssejtek biológiai szerepének, természetének, transzdifferenciálódási vagy dedifferenciálódási képességének, fiziológiai jelentőségének megértéséhez az embrionális fejlődés, a posztnatális növekedés, az érés és az öregedés során, valamint az emberi betegségekben.