A herpesz diagnózisa

A herpesz diagnózisa a klasszikus vírusizoláláson alapul érzékeny sejtkultúrákon, immunfluoreszcens és szerológiai módszereken, kolposzkópos vizsgálaton, valamint modern molekuláris biológiai módszerek (PCR, dot hibridizáció) alkalmazásán, amelyek lehetővé teszik a herpeszvírusok teljes csoportjának, beleértve a HHV-6 és HHV-7 típusokat is, diagnosztizálását.

Laboratóriumi módszerek herpeszfertőzés diagnosztizálására

A HSV izolálására vagy a vírusrészecskék és/vagy azok komponenseinek kimutatására irányuló fő módszerek	Kiegészítő módszerek a HSV elleni antitestek kimutatására az emberi test biológiai folyadékaiban
HSV izolálása érzékeny sejtkultúrákban és állatkultúrákban Direkt és immun elektronmikroszkópia Az IPA közvetlen és közvetett változatai IFA Molekuláris biológiai módszerek Latex agglutinációs reakció	Semlegesítési reakció RSC A HSV-1,2 nem strukturális fehérjéi elleni antitestek meghatározása

Kimutatták, hogy a betegek 76%-ánál a HSV-2, 24%-ánál pedig a HSV-1 típus okozza a genitális herpeszet (GH). Ezenkívül a GH monoinfekcióként csak a betegek 22%-ánál fordult elő, az esetek 78%-ában mikrobiális asszociációt mutattak ki. Az egyének 46%-ánál két kórokozó okozta parazitocenózist észleltek, köztük a klamidiát az esetek 40%-ában. A Gardnerella, a Trichomonas és a gonokokkusz ritkábban volt kimutatható a kenetekben.

A betegek 27%-ánál a parazitocenózist három kórokozó, 5,2%-ánál négy kórokozó képviselte. Ezenkívül leggyakrabban a klamidia, a gardnerella és a Candida gombák kombinációját figyelték meg. Ezek az adatok alátámasztják a GH-ban szenvedő betegek alapos bakteriológiai vizsgálatának szükségességét a kórokozók kombinációinak azonosítása, valamint az urogenitális traktus vegyes fertőzéseinek patogenezisének mélyreható tanulmányozása érdekében, amely lehetővé teszi a herpeszfertőzés differenciált komplex terápiáját.

A HSV izolálására vizsgált anyagok a herpés elváltozások lokalizációjától függően

A sérülések lokalizációja	Hólyagok tartalma	Sejtkaparás				CSF	Bronchiális aspirátum	Biopszia	Vér
		1	2	3	4
Bőr	+								+
Szemek			+						+
Nemi szervek				+					+
Végbélnyílás	+				+				+
Száj	+	+							+
Központi idegrendszer	+					+		+	+
Tüdő		+					+		+
Máj								+	+
Veleszületett herpesz	+	+	+				+		+

A citomegalovírus fertőzés laboratóriumi diagnosztikai módszerei

Mód	Az eredmények eléréséhez szükséges idő	Megjegyzések
VIROLÓGIAI
Elektronmikroszkópia	3 óra	Nem túl könnyen megközelíthető
Vírusizolálás sejtkultúrában (VCI)	4-20 nap	Normál, Lassú
Korai AG immunfluoreszcens festése monoklonális antitestekkel	6 óra	Kevésbé specifikus
CITOLÓGIAI	2-3 óra	Kevésbé specifikus
SZEROLÓGIAI
RSC	2 nap	Standard
RGA	1 nap	Munkaigényes
ZÁTONY	6 óra	Egyszerű, konkrét
NRIF	6 óra	Nehéz
RIMP	6 óra	Nehéz
ELISA (IgM, DO)	6 óra	Gyors, egyszerű
Immunoblot	6 óra	Drága
MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI
MG	5-7 nap	Drága, munkaigényes
PCR	3 óra	Drága

A herpes zoster vírus diagnosztikai módszerei

Diagnosztikai módszerek	Laboratóriumi technikák
KÖZVETETT
Kiválasztás	Szövettenyészet, csirkeembriók, laboratóriumi állatok, ko-tenyészet permisszív sejtekkel vagy helpervírusokkal
Izolátumok azonosítása	Semlegesítési reakció, RSC, IF, PIEF, izolátumok reakciója, kicsapódás, agglutináció, IF
KÖZVETLEN
Citológia	Kenetvizsgálatok: színes immunfluoreszcencia
Szövettan	A sejt patomorfológiája
Szerkezet	Embrionális mikroszkópia, immunelektronmikroszkópia
Antigének meghatározása	HA, PIEF, RIM, IFA
A helyi antitesttermelés meghatározása	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Molekuláris biológiai megközelítések	Molekuláris hibridizáció, PCR

A herpes zoster vírus okozta fertőzés laboratóriumi diagnosztikája

Diagnosztikai problémák	Mód	Várható eredmények
Akut primer fertőzés	1	2 órán belüli észlelés
	2	Az antitestszint lassan emelkedik
	3	A fertőzés után 3 nappal jelentkezik
Akut reaktiválódott fertőzés	1	UUU kimutatása 2 óra elteltével
	2	Az antitestszint lassan emelkedik
	4	A kiütés megjelenése után 4 nappal jelentkezik

1. a VEGF vezikulák meghatározása folyadékban;
2. szerológia: CSC, ELISA, kimutatásra irányuló
3. szerológia: IgM kimutatására irányuló ELISA;
4. szerológia: IgA és IgM kimutatására irányuló ELISA.

A herpes zoster vírusfertőzésre adott immunválasz jelzésére szolgáló módszerek

Megközelítés	Módszer
Az antitest titer növekedésének kimutatása a második szérumban	RSK, RTGA, RPGA, IF neutralizációs reakció, RIM, ELISA
Ig G és Ig A osztályspecifikus antitestek kimutatása az első szérummintában	ELISA, IF, RIM, latex agglutináció

A betegek szérumainak herpeszvírus-fertőzések szerológiai vizsgálatának (ELISA) eredményeinek értelmezése

Fertőzés/marker neve	Fertőzések átlagos küszöbértékei
	Az elemzés eredményei	Értelmezés
Citomegalia elleni CMV IgG (1-20 U/ml) CMV-ellenes IgM (100-300%)	Pozitív 1-6 Pozitív 6-10 Pozitív >10 Negatív Pozitív 100-300 Negatív <90 Kétes 90-100	Remisszió A betegség súlyosbodása A betegség akut fázisa Nincs fertőzés (betegség) A betegség akut fázisa Ismételje meg az elemzést 2-3 hét múlva
Herpes simplex 1,2 szerotípus Anti-HSV 1/2 összesen (100-900%)	Pozitív 100-400 Pozitív 400-800 Pozitív >800 Negatív <100	Remisszió A betegség súlyosbodása A betegség akut fázisa Nincs fertőzés (betegség)

A táblázat a herpeszvírus-fertőzések laboratóriumi diagnosztikájának főbb módszereit, valamint az ajánlott biológiai anyagokat mutatja be, amelyeket a HSV izolálásakor vizsgálnak, figyelembe véve a herpeszes elváltozások lokalizációját.

Megbízható herpes simplex és CMV vírusok izolálása érzékeny sejtkultúrák fertőzésével. Így 26 beteg virológiai vizsgálata során a relapszus időszakában 23 esetben (88,4%) izoláltak HSV-t érzékeny Vero sejtkultúrában. A fertőzött tenyészetek a HSV-re jellemző citopatogén hatás képét mutatták - többmagvú óriássejtek képződését vagy lekerekített és megnagyobbodott sejtek felhalmozódását klaszterek formájában. Az esetek 52,1%-ában a vírus citopatogén hatásának gócai már a fertőzés után 16-24 órával kimutathatók voltak. A fertőzött tenyészetek 48-72 órás inkubációja után a sejtek specifikus pusztulását okozó anyagok százalékos aránya 87%-ra nőtt. És csak az esetek 13%-ában észleltek pozitív eredményt a fertőzés után 96 órával vagy később, illetve ismételt passzázsok során.

A generalizált herpeszfertőzés laboratóriumi diagnosztikai módszerei

A herpeszvírusok, azok részecskéinek és komponenseinek kimutatására (izolálására) irányuló fő módszerek	Segédmódszerek, amelyek célja a herpeszvírusok elleni antitestek kimutatása biológiai folyadékokban, enzimatikus eltolódások kimutatása a vérszérumban
Herpeszvírusok izolálása érzékeny sejt- és állatkultúrákon Direkt és immun elektronmikroszkópia Az immunperoxidáz módszer direkt és indirekt változatai A fluoreszcens antitest módszer direkt és indirekt változatai Szilárd fázisú enzimes immunvizsgálat változatai A molekuláris (DNS-DNS) hibridizációs módszer változatai Polimeráz láncreakció Latex agglutinációs reakció	Neutralizációs teszt Komplementfixációs teszt Latex agglutinációs teszt Fluoreszcens antitest módszer indirekt változata Immunperoxidáz módszer indirekt változata Szilárd fázisú enzimes immunvizsgálat változatai Immunblot módszer Radiális komplementfixációs módszer Alanin- és aszpartát-aminotranszferáz szintek meghatározása

A fertőző mononukleózis (EBV által okozott fertőzés) diagnosztizálására szerológiai módszereket alkalmaznak. A Paul-Bunnell reakció kos vörösvértestekkel, 1:28 vagy magasabb diagnosztikai titer egyetlen vérszérumvizsgálatban, vagy az antitestek 4-szeres növekedése párosított szérumvizsgálat során. A Hoff-Bauer reakciót formalinozott ló vörösvértestek 4%-os szuszpenziójával alkalmazzák. Az eredményt 2 perc elteltével vesszük figyelembe; fertőző mononukleózis esetén a reakció nagyon specifikus.

Jelenleg egy enzim immunvizsgálati (EIA) módszer fejlesztése zajlik a fertőző mononukleózis diagnosztizálására. Ebben az esetben a beteg szérumában lévő IgG és IgM antitesteket EBV-vel fertőzött limfoblasztokkal inkubálva, majd fluoreszcens antitestekkel kezelve határozzák meg. A betegség akut időszakában a vírus kapszid antigénjével szembeni antitesteket 1:160 és magasabb titerben határozzák meg.

Számos importált kereskedelmi tesztrendszer használata esetén az ELISA képes kimutatni: az EBV burok antitestek elleni antitesteket, az EBV korai antigénje elleni antitesteket, az EBV korai antigénje elleni összes antitestet, amelyet a betegség akut fázisában határoznak meg mind a magban, mind a sejtcitoplazmában, és a korai EBV elleni korlátozott antitesteket, amelyeket a betegség akut fázisában határoznak meg mind a magban, mind a sejtcitoplazmában, az EBV korai antigénje elleni korlátozott antitesteket, amelyeket a betegség tetőpontján csak a sejtcitoplazmában határoznak meg, és az EBV nukleáris antigénje elleni antitesteket. Ezen tesztrendszerek használata lehetővé teszi számos, az EBV-vel összefüggő betegség differenciáldiagnosztikáját.

Pozitív ELISA-teszt után, amely EBV-vel szembeni antitesteket mutat ki, megerősítő immunblot reakciót végzünk, amely meghatározza az egyes EBV markerfehérjékkel (p-fehérjékkel) szembeni antitestek jelenlétét: p23, p54, p72 (ennek a fehérjének a jelenléte az EBV szaporodásának lehetőségét jelzi), p 138. A fenti laboratóriumi módszereket a kezelés hatékonyságának monitorozására is használják.

A virológiai módszerek érzékenysége 85-100%, specificitása 100%, a vizsgálati idő 2-5 nap. A gyakorlati munkában gyakran alkalmazzák a HSV-1 és HSV-2 elleni poliklonális vagy monoklonális antitestekkel végzett direkt immunfluoreszcens módszert (DIF). A DIF módszer meglehetősen könnyen reprodukálható egy hagyományos klinikai laboratóriumban, nem drága, érzékenysége 80% feletti, specificitása 90-95%. Az immunfluoreszcens mikroszkópia citoplazmatikus zárványok jelenlétét, morfológiai jellemzőket, a fertőzött sejtek százalékos arányát mutatta ki a húgycsőből, a méhnyakcsatornából, a méhnyakból és a végbélből származó kenetekben-kaparékokban.

A PIF módszer képet ad a sejtek morfológiai tulajdonságairól és a HSV antigének lokalizációjának változásairól. A herpeszvírusok által okozott sejtkárosodás közvetlen jelei (specifikus lumineszcencia kimutatása) mellett a PIF adatok szerint a herpeszfertőzés közvetett jelei is vannak:

• a maganyag aggregációja, a kariolemma leválása;
• az úgynevezett „lyuk” magok jelenléte, amikor csak egy kariolemma marad a sejtmagból;
• intranukleáris zárványok jelenléte - Cowdry testek.

A PIF elvégzése során az orvos nemcsak kvalitatív, hanem kvantitatív értékelést is kap a fertőzött sejtek állapotáról, amelyet az aciklovirral (AC) végzett vírusellenes terápia hatékonyságának felmérésére használtunk. Így 80 egyszerű genitális herpeszes (GH) beteget vizsgáltunk a PIF módszerrel dinamikusan. Kimutatták, hogy ha az aciklovirral történő kezelés előtt a betegek 88%-ánál magas volt a fertőzött sejtek aránya (50-75% és magasabb) a kenetekben, akkor egy aciklovir-kúra után a betegek 44%-ánál egészséges sejteket észleltek a kenetekben, az esetek 31%-ában egyetlen fertőzött sejtet figyeltek meg, a betegek 25%-ánál pedig akár 10% fertőzött sejt volt jelen.

A fertőzött sejtek tartalma aciklovirral kezelt genitális herpeszes betegek keneteiben (PIF-reakció)

Betegségi időszakok	A kenetekben található százalékos tartalom
	Fertőzött sejtek					Normál sejtek
	Több mint 75%	50-75%	40-50%	10%	Egyedülálló sejtek a látómezőben
Relapszus (kezelés előtt)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remisszió (kezelés után)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

A PIF és a ponthibridizációs módszer évek óta történő alkalmazásával megfigyelték, hogy a vizsgálat eredményei az esetek közel 100%-ában egybeesnek. Meg kell jegyezni, hogy a herpesz diagnózisának megbízhatóságának növelése érdekében, különösen a herpesz szubklinikai és alacsony manifesztációs formái esetén, ajánlott 2-3 laboratóriumi diagnosztikai módszert alkalmazni a munkában, különösen terhes nők, kedvezőtlen szülészeti előzményekkel rendelkező nők és meghatározatlan nőgyógyászati diagnózissal rendelkező személyek vizsgálatakor.

Így az urogenitális traktus vírusos és bakteriális fertőzéseinek PCR-diagnosztikájában a pozitív eredményeket az anamnézis, a betegség specifikus klinikai tüneteinek jelenléte (vagy hiánya) figyelembevételével kell értékelni. Ha PCR-rel klamidiát mutatnak ki, akkor ebben az esetben nagy a fertőzés valószínűsége, és a terápia kérdései ennek megfelelően oldhatók meg. Mikoplazmák (ureaplazmák) kimutatása esetén, amelyek opportunista mikroorganizmusok, további tenyésztési vizsgálatokra van szükség a diagnózis megerősítéséhez, azaz a betegből vett anyag érzékeny sejtkultúrákra történő vetésére. Csak akkor beszélhetünk a mikoplazmózis diagnózisának laboratóriumi megerősítéséről, ha a tenyésztési elemzés pozitív eredményeket mutat. Ugyanez a módszer lehetővé teszi, ha szükséges, az izolált mikoplazmák érzékenységének meghatározását a gyakran használt gyógyszerformákkal (antibiotikumok, fluorokinolonok stb.) szemben.

Lehetséges a Herpesviridae családba tartozó több vírussal való egyidejű fertőzés. Gyakran észleltünk egy betegnél HSV-1, HSV-2 és CMV vírusfertőzést. A másodlagos IDS klinikai és laboratóriumi manifesztációival rendelkező betegek (onkohematológiai, onkológiai, HIV-fertőzött betegek) szignifikánsan gyakrabban fertőződtek meg több herpeszvírussal. Így kimutatták, hogy a HIV-fertőzésben progresszív klinikai és immunológiai rendellenességek a molekuláris hibridizációs módszerrel kimutatott herpeszvírusok számának növekedésével járnak. Ebben az esetben a legprognosztikailag legjelentősebbnek a HSV-1, CMV és HHV-6 típusú DNS komplex, egyidejű kimutatása tekinthető.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]