Mesterséges szívbillentyűk

A klinikai alkalmazásra rendelkezésre álló modern biológiai mesterséges szívbillentyűk – a pulmonális autograftok kivételével – életképtelen struktúrák, amelyekből hiányzik a növekedés és a szövetreparáció potenciálja. Ez jelentős korlátozásokat szab a billentyűpatológia korrekciójára való alkalmazásuknak, különösen gyermekeknél. A szövetmérnökség az elmúlt 15 évben fejlődött. Ennek a tudományos iránynak a célja, hogy mesterséges körülmények között olyan struktúrákat hozzon létre, mint a tromborezisztens felülettel és életképes intersticiummal rendelkező mesterséges szívbillentyűk.

[ 1 ], [ 2 ]

Hogyan fejlesztik a mesterséges szívbillentyűket?

A szövetmérnökség tudományos koncepciója azon az elképzelésen alapul, hogy élő sejteket (fibroblasztok, őssejtek stb.) szintetikus vagy természetes, felszívódó állványzatban (mátrixban) benépesítenek és növesztenek, ami egy háromdimenziós szelepszerkezet, valamint olyan jeleket használnak, amelyek szabályozzák a transzplantált sejtek génexpresszióját, szerveződését és termelékenységét az extracelluláris mátrix kialakulásának időszakában.

Az ilyen mesterséges szívbillentyűket a beteg szövetébe integrálják szerkezetük és működésük végső helyreállítása és további fenntartása érdekében. Ebben az esetben a sejtek (fibroblasztok, miofibroblasztok stb.) működésének eredményeként egy új kollagén-elasztin váz, vagy pontosabban egy extracelluláris mátrix alakul ki az eredeti mátrixon. Ennek eredményeként a szövetmérnökség által létrehozott optimális mesterséges szívbillentyűknek anatómiai szerkezetük és funkciójuk tekintetében közel kell állniuk az eredetihez, valamint biomechanikai alkalmazkodóképességgel, reparációs és növekedési képességgel kell rendelkezniük.

A szövetmérnökség mesterséges szívbillentyűket fejleszt különféle sejtgyűjtési források felhasználásával. Így xenogén vagy allogén sejtek is használhatók, bár az előbbiek a zoonózisok emberre történő átvitelének kockázatával járnak. Az allogén sejtek genetikai módosításával csökkenthető az antigenicitás és megelőzhetők a szervezet kilökődési reakciói. A szövetmérnökség megbízható sejtforrást igényel. Ilyen források az autogén sejtek, amelyeket közvetlenül a betegből vesznek, és amelyek nem váltanak ki immunreakciókat a reimplantáció során. A hatékony mesterséges szívbillentyűket a vérerekből (artériákból és vénákból) nyert autológ sejtek alapján állítják elő. A fluoreszcencia-aktivált sejtszortírozás - FACS - alkalmazásán alapuló módszert fejlesztettek ki tiszta sejtkultúrák előállítására. A vérerekből nyert vegyes sejtpopulációt acetilezett, alacsony sűrűségű lipoprotein markerrel jelölik, amely szelektíven abszorbeálódik az endoteliociták felületén. Az endoteliális sejtek ezután könnyen elválaszthatók az erekből nyert sejtek tömegétől, amely simaizomsejtek, miofibroblasztok és fibroblasztok keveréke lesz. A sejtek forrása, legyen az artéria vagy véna, befolyásolja a végső konstrukció tulajdonságait. Így a vénás sejtekkel beoltott mátrixú mesterséges szívbillentyűk jobbak a kollagénképződés és a mechanikai stabilitás tekintetében, mint az artériás sejtekkel beoltott konstrukciók. A perifériás vénák választása a sejtek gyűjtésének kényelmesebb forrásának tűnik.

A miofibroblasztok carotis artériákból is kinyerhetők. Az érből származó sejtek azonban jelentősen eltérnek a természetes intersticiális sejtek tulajdonságaitól. Alternatív sejtforrásként autológ köldökzsinórsejtek is használhatók.

Őssejteken alapuló mesterséges szívbillentyűk

Az utóbbi években az őssejt-kutatás elősegítette a szövetmérnökség fejlődését. A vörös csontvelői őssejtek alkalmazásának megvannak az előnyei. Különösen a bioanyag-gyűjtés és az in vitro tenyésztés egyszerűsége, valamint a későbbi, különféle típusú mezenchimális sejtekké történő differenciálódás lehetővé teszi az ép erek használatának elkerülését. Az őssejtek a sejtvonalak pluripotens forrásai, és egyedi immunológiai jellemzőkkel rendelkeznek, amelyek hozzájárulnak stabilitásukhoz allogén körülmények között.

Az emberi vörös csontvelői őssejteket szegycsont- vagy csípőtaréj-punkcióval nyerik. 10-15 ml szegycsont-aspirátumból izolálják őket, elválasztják a többi sejttől és tenyésztik. A szükséges sejtszám elérése után (általában 21-28 napon belül) mátrixokra helyezik (kolonizálják), és táptalajban, statikus helyzetben tenyésztik (7 napig párásított inkubátorban, 37 °C-on, 5% CO2 jelenlétében). Ezt követően a sejtnövekedést a táptalaj (biológiai ingerek) vagy a szövetnövekedés fiziológiai feltételeinek megteremtésével stimulálják izometrikus deformációja során pulzáló áramlású reprodukciós készülékben - bioreaktorban (mechanikai ingerek). A fibroblasztok érzékenyek a mechanikai ingerekre, amelyek elősegítik növekedésüket és funkcionális aktivitásukat. A pulzáló áramlás mind a radiális, mind a kerületi deformációk növekedését okozza, ami a benépesített sejtek orientációjához (megnyúlásához) vezet az ilyen feszültségek irányába. Ez viszont a billentyűk orientált rostos szerkezetének kialakulásához vezet. Az állandó áramlás csak tangenciális feszültségeket okoz a falakon. A pulzáló áramlás jótékony hatással van a sejtek morfológiájára, proliferációjára és az extracelluláris mátrix összetételére. A táptalaj áramlásának jellege, a bioreaktor fizikai-kémiai körülményei (pH, pO2 és pCO2) szintén jelentősen befolyásolják a kollagéntermelést. Így a lamináris áramlás, a ciklikus örvényáramok fokozzák a kollagéntermelést, ami a mechanikai tulajdonságok javulásához vezet.

A szöveti struktúrák növesztésének egy másik megközelítése az embrionális körülmények bioreaktorban történő létrehozása az emberi test fiziológiai körülményeinek szimulálása helyett. Az őssejtek alapján növesztett szöveti biobillentyűk mozgékony és rugalmas lebenyekkel rendelkeznek, amelyek funkcionálisan képesek nagy nyomás és a fiziológiai szintet meghaladó áramlás hatására működni. Ezen struktúrák lebenyeinek szövettani és hisztokémiai vizsgálata a mátrix biodestrukciójának aktív folyamatait és életképes szövettel való helyettesítését mutatta ki. A szövet réteges típus szerint szerveződik, az extracelluláris mátrixfehérjék jellemzői hasonlóak a natív szövet jellemzőihez, I. és III. típusú kollagén és glükózaminoglikánok jelenléte jellemzi. A lebenyek tipikus háromrétegű szerkezetét - kamrai, szivacsos és rostos rétegek - azonban nem sikerült megfigyelni. Az összes fragmensben található vimentint expresszáló ASMA-pozitív sejtek a miofibroblasztokhoz hasonló jellemzőkkel rendelkeztek. Az elektronmikroszkópia olyan sejtes elemeket tárt fel, amelyek az életképes, szekréciósan aktív miofibroblasztokra jellemző tulajdonságokkal rendelkeznek (aktin/miozin filamentumok, kollagén szálak, elasztin), valamint endotélsejteket a szövet felszínén.

A vitorlákon I. és III. típusú kollagént, ASMA-t és vimentint mutattak ki. A szöveti és a természetes struktúrák vitorláinak mechanikai tulajdonságai összehasonlíthatók voltak. A szöveti mesterséges szívbillentyűk 20 hét alatt kiváló teljesítményt mutattak, és mikroszerkezetükben, biokémiai profiljukban és fehérjemátrix-képződésükben hasonlítottak a természetes anatómiai struktúrákhoz.

Az összes szövetmérnöki úton előállított mesterséges szívbillentyűt pulmonális pozícióban ültették be állatokba, mivel mechanikai jellemzőik nem felelnek meg az aorta pozíciójában fellépő terheléseknek. Az állatokból eltávolított szövetbillentyűk szerkezetükben közel állnak a természetesekhez, ami további fejlődésükre és átszervezésükre utal in vivo. Azt, hogy a szövetek átszervezésének és érésének folyamata fiziológiás körülmények között is folytatódik-e a mesterséges szívbillentyűk beültetése után, ahogyan azt az állatkísérletekben megfigyelték, további vizsgálatok fogják bizonyítani.

Az ideális mesterséges szívbillentyűknek legalább 90%-os porozitással kell rendelkezniük, mivel ez elengedhetetlen a sejtek növekedéséhez, a tápanyagok szállításához és a sejtek anyagcsere-termékeinek eltávolításához. A biokompatibilitás és a biológiai lebonthatóság mellett a mesterséges szívbillentyűknek kémiailag kedvező felülettel kell rendelkezniük a sejtek betelepüléséhez, és meg kell egyezniük a természetes szövet mechanikai tulajdonságaival. A mátrix biodegradációjának szintjének szabályozhatónak és az új szövetek képződésének szintjével arányosnak kell lennie, hogy az időbeli mechanikai stabilitás biztosított legyen.

Jelenleg szintetikus és biológiai mátrixokat fejlesztenek. A mátrixok létrehozásának leggyakoribb biológiai anyagai a donor anatómiai struktúrák, a kollagén és a fibrin. A polimer mesterséges szívbillentyűket úgy tervezik, hogy a beültetés után biológiailag lebomoljanak, miután a beültetett sejtek elkezdik termelni és szervezni saját extracelluláris mátrixhálózatukat. Az új mátrixszövet képződését növekedési faktorok, citokinek vagy hormonok szabályozhatják vagy stimulálhatják.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Donor mesterséges szívbillentyűk

Mátrixként használhatók emberből vagy állatból származó, és immunogenitásuk csökkentése érdekében decellularizációval a sejtes antigénektől megtisztított donor mesterséges szívbillentyűk. Az extracelluláris mátrix konzervált fehérjéi képezik az alapját a beoltott sejtek későbbi tapadásának. A sejtes elemek eltávolítására (acellularizáció) a következő módszerek léteznek: fagyasztás, tripszin/EDTA-val történő kezelés, detergensek - nátrium-dodecil-szulfát, nátrium-dezoxikolát, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20 -, valamint többlépcsős enzimes kezelési módszerek. Ebben az esetben a sejtmembránokat, nukleinsavakat, lipideket, citoplazmatikus struktúrákat és oldható mátrixmolekulákat távolítják el, miközben megőrzik a kollagént és az elasztint. Ideális módszert azonban még nem találtak. Csak a nátrium-dodecil-szulfát (0,03-1%) vagy a nátrium-dezoxikolát (0,5-2%) eredményezte a sejtek teljes eltávolítását 24 órás kezelés után.

Egy állatkísérletben (kutya és sertés) eltávolított, sejttelenített biobillentyűk (allograft és xenograft) szövettani vizsgálata részleges endotelializációt és a recipiens miofibroblasztok benövését mutatta ki a bázisba, meszesedés jelei nélkül. Mérsékelt gyulladásos infiltrációt figyeltek meg. A sejttelenített SynerGraftTM billentyű klinikai vizsgálatai során azonban korai elégtelenség alakult ki. A bioprotézis mátrixában kifejezett gyulladásos reakciót észleltek, amely kezdetben nem volt specifikus, és limfocitás reakcióval járt. A bioprotézis egy év alatt diszfunkciója és degenerációja alakult ki. A mátrix sejtkolonizációját nem észlelték, de a billentyűk meszesedése és a beültetés előtti sejtmaradványok kimutathatók voltak.

Az endotélsejtekkel beoltott, in vitro és in vivo tenyésztett, sejtmentes mátrixok koherens réteget képeztek a billentyűk felszínén, és a natív szerkezetű beoltott intersticiális sejtek differenciálódási képességüket mutatták. A bioreaktor dinamikus körülményei között azonban nem sikerült elérni a mátrixon a sejtek kolonizációjának kívánt fiziológiai szintjét, és a beültetett mesterséges szívbillentyűket a felgyorsult sejtszaporodás és az extracelluláris mátrix kialakulása miatt meglehetősen gyors (három hónapos) vastagodás kísérte. Így ebben a szakaszban a donorsejtektől mentes mátrixok sejtekkel való kolonizációjukhoz való felhasználása számos megoldatlan problémával jár, beleértve az immunológiai és fertőző problémákat is; a decellularizált bioprotézisekkel kapcsolatos munka folytatódik.

Meg kell jegyezni, hogy a kollagén a biológiailag lebomló mátrixok előállításához felhasználható potenciális biológiai anyagok egyike. Használható hab, gél vagy lemezek, szivacsok és rostalapú nyersanyag formájában. A kollagén alkalmazása azonban számos technológiai nehézséggel jár. Különösen nehéz betegtől beszerezni. Ezért jelenleg a legtöbb kollagén mátrix állati eredetű. Az állati kollagén lassú biodegradációja fokozott zoonózisokkal való fertőzés kockázatát hordozhatja magában, immunológiai és gyulladásos reakciókat válthat ki.

A fibrin egy másik biológiai anyag, amelynek szabályozott biodegradációs tulajdonságai vannak. Mivel a fibrin gélek előállíthatók a beteg véréből egy autológ mátrix későbbi előállításához, egy ilyen szerkezet beültetése nem okozza a toxikus lebomlását és gyulladásos reakcióját. A fibrinnek azonban vannak olyan hátrányai, mint a diffúzió és a kioldódás a környezetbe, valamint az alacsony mechanikai tulajdonságok.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Szintetikus anyagokból készült műszívbillentyűk

A mesterséges szívbillentyűket szintén szintetikus anyagokból készítik. Számos kísérlet történt billentyűmátrixok gyártására poliglaktin, poliglikolsav (PGA), politejsav (PLA), PGA és PLA kopolimer (PLGA), valamint polihidroxi-alkanoátok (PHA) felhasználásán alapult. A nagy porozitású szintetikus anyag fonott vagy nem fonott szálakból, sókioldási technológiával állítható elő. Egy ígéretes kompozit anyagot (PGA/P4HB) mátrixok gyártásához poliglikolsav (PGA) nem fonott hurkokból nyernek, amelyeket poli-4-hidroxi-butiráttal (P4HB) vontak be. Az ebből az anyagból gyártott mesterséges szívbillentyűket etilén-oxiddal sterilizálják. Ezen polimerek hurkainak jelentős kezdeti merevsége és vastagsága, gyors és ellenőrizetlen lebomlása, valamint savas citotoxikus termékek felszabadulása további kutatásokat és más anyagok keresését igényli.

Az autológ miofibroblaszt szövettenyésztő lemezek használata állványzaton tenyésztve, ezen sejtek termelésének stimulálásával tartómátrixok kialakítására, lehetővé tette olyan billentyűminták előállítását, amelyek aktív, életképes sejteket tartalmaznak, és amelyeket extracelluláris mátrix vesz körül. Ezen billentyűk szöveteinek mechanikai tulajdonságai azonban még mindig nem elegendőek a beültetésükhöz.

A létrehozandó billentyű proliferációjának és szövetregenerációjának szükséges szintje nem feltétlenül érhető el kizárólag a sejtek és a mátrix kombinálásával. A sejtek génexpressziója és a szövetképződés szabályozható vagy stimulálható növekedési faktorok, citokinek vagy hormonok, mitogén faktorok vagy adhéziós faktorok mátrixokhoz és állványzatokhoz való hozzáadásával. Jelenleg vizsgálják ezen szabályozók mátrix bioanyagokba történő beépítésének lehetőségét. Összességében jelentős hiány mutatkozik a szöveti billentyűképződés biokémiai ingerekkel történő szabályozásával kapcsolatos kutatásokban.

A Matrix P nevű sejttelen sertés xenogén tüdőbioprotézis az AutoTissue GmbH speciális, szabadalmaztatott eljárásával feldolgozott, decellularizált szövetből áll, amely antibiotikumokkal, nátrium-dezoxikoláttal és alkohollal történő kezelést is magában foglal. Ez a Nemzetközi Szabványügyi Szervezet által jóváhagyott feldolgozási módszer eltávolítja az összes élő sejtet és posztcelluláris struktúrát (fibroblasztok, endotélsejtek, baktériumok, vírusok, gombák, mikoplazma), megőrzi az extracelluláris mátrix architektúráját, minimálisra csökkenti a DNS és RNS szintjét a szövetekben, ami nullára csökkenti a sertés endogén retrovírus (PERV) emberre történő átvitelének valószínűségét. A Matrix P bioprotézis kizárólag kollagénből és elasztinból áll, megőrizve a szerkezeti integrációt.

Juhkísérletekben a Matrix P bioprotézis beültetése után 11 hónappal minimális reakciót figyeltek meg a környező szövetekben, jó túlélési aránnyal, ami különösen a szívbelhártya fényes belső felszínén volt szembetűnő. Gyulladásos reakciók, a billentyűvitorlák megvastagodása és rövidülése gyakorlatilag hiányzott. A Matrix P bioprotézisben alacsony szöveti kalciumszintet is regisztráltak, a különbség statisztikailag szignifikáns volt a glutaraldehiddel kezeltekhez képest.

A Matrix P műbillentyű a beültetést követő néhány hónapon belül alkalmazkodik az egyes betegek állapotához. A kontrollidőszak végén végzett vizsgálat ép extracelluláris mátrixot és konfluens endotéliumot mutatott. A 2002 és 2004 között a Ross-eljárás során 50 veleszületett rendellenességgel élő betegbe beültetett Matrix R xenograft jobb teljesítményt és alacsonyabb transzvalvuláris nyomásgradienseket mutatott a krioprezervált és decellularizált SynerGraftMT allograftokhoz és a glutaraldehiddel kezelt állványzat nélküli bioprotézisekhez képest. A Matrix P műbillentyűket a jobb kamrai kiáramlási traktus rekonstrukciója során végzett pulmonális billentyűcserére szánják veleszületett és szerzett rendellenességek műtétei során, valamint a Ross-eljárás során végzett pulmonális billentyűcsere során. 4 méretben kaphatók (belső átmérő szerint): újszülötteknek (15-17 mm), gyermekeknek (18-21 mm), középhaladóknak (22-24 mm) és felnőtteknek (25-28 mm).

A szövetmérnöki úton előállított billentyűk fejlesztésének előrehaladása a billentyűsejtek biológiájának fejlődésétől (beleértve a génexpresszió és -szabályozás kérdéseit), az embriogén és az életkorral összefüggő billentyűfejlődés vizsgálatától (beleértve az angiogén és neurogén faktorokat), az egyes billentyűk biomechanikájának pontos ismeretétől, a beoltáshoz megfelelő sejtek azonosításától és az optimális mátrixok fejlesztésétől függ. A fejlettebb szövetbillentyűk további fejlesztéséhez alapos ismeretekre lesz szükség a natív billentyűk mechanikai és szerkezeti jellemzői, valamint az ezen jellemzők in vitro reprodukálására szolgáló ingerek (biológiai és mechanikai) közötti kapcsolatról.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]