A tuberkulózis laboratóriumi diagnózisa

A tuberkulózis egy olyan betegség, amely modern körülmények között és a tudományos eredmények ismeretében könnyen diagnosztizálható. A tuberkulózis laboratóriumi diagnosztikája központi helyet foglal el a többi diagnosztikai módszer között, a röntgenvizsgálati módszerek után a második helyen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinikai vérvizsgálat

Tuberkulózisos betegeknél a vérvizsgálat általános változásai nem patognómikusak. A tuberkulózis korlátozott és alacsony aktivitású formáiban a normál számú eritrociták hipokrómiája jellemző. Masszív infiltrátumok vagy eseti tüdőgyulladás, széles körben elterjedt eseti nyirokcsomó-gyulladás, specifikus bélkárosodás, valamint nagy tüdő- vagy posztoperatív vérzés esetén eritropénia és mikrocitózis, oligokromácia és polikromácia figyelhető meg. A makrocitózis, és különösen a poikilocitózis sokkal ritkábban fordul elő, általában súlyos vérszegénység esetén. A retikulociták száma a tuberkulózis kompenzált stádiumában 0,1-0,6%, a szubkompenzált stádiumban 0,6-1,0%, a dekompenzált stádiumban pedig a retikulociták 1%-a jellemző.

A tuberkulózis egyes eseteiben mérsékelt leukocitózis (akár 15 ezer leukocita) figyelhető meg, ritkábban leukopénia, amely az esetek 2-7%-ában fordul elő a folyamat korlátozott és enyhe formáiban szenvedő betegeknél, és 12,5%-ában a destruktív és progresszív tüdőtuberkulózisban.

Leggyakrabban a leukocita-képletben fordulnak elő eltolódások. Mind relatív, mind abszolút neutrofília megfigyelhető, a leukocita-képlet mérsékelt eltolódása balra a promyelocyták felé. A mielociták nagyon ritkán fordulnak elő szövődménymentes tuberkulózis esetén. A patológiás szemcsézettségű neutrofilek számának növekedése a tuberkulózisos beteg hemogramjában mindig a folyamat időtartamát jelzi: súlyos tuberkulózisban szenvedő betegeknél szinte az összes neutrofil patológiás szemcsézettséget mutat. Amikor a tuberkulózis-járvány alábbhagy, a sejtmag-eltolódás viszonylag gyorsan normalizálódik. A neutrofilek patológiás szemcsézettsége általában tovább fennáll, mint a hemogram egyéb változásai.

Az eozinofilek tartalma a perifériás vérben a folyamat fázisától és a szervezet allergiás állapotától függően is ingadozik. Számuk a betegség súlyos és elhúzódó kitöréseiben aneozinofíliáig csökken, és fordítva, az infiltrátumok és a pleurális folyadékgyülem felszívódása, valamint a primer tuberkulózis korai formáiban növekszik.

A primer tuberkulózis legtöbb formáját limfopénia kíséri, amely néha évekig is megfigyelhető specifikus elváltozások hegesedése után. A másodlagos tuberkulózis az akut fázisban, a folyamat súlyosságától függően, normális limfocitaszámmal vagy limfopéniával járhat.

A tuberkulózis folyamatának felmérésére szolgáló tesztek között különleges helyet foglal el az eritrocita ülepedési sebesség (ESR) meghatározása, amely fontos a tuberkulózis folyamatának lefolyásának felmérésében és aktív formáinak azonosításában. Az ESR növekedése kóros folyamat (fertőző-gyulladásos, gennyes, szeptikus, hemoblastózis, limfogranulomatózis stb.) jelenlétét jelzi, és annak súlyosságának indikátoraként szolgál, de a normál ESR-értékek nem mindig jelzik a patológia hiányát. Az eritrocita ülepedés gyorsulását elősegíti a globulinok, a fibrinogén, a koleszterin tartalmának növekedése a vérben, valamint a vér viszkozitásának csökkenése. Az eritrocita ülepedés lassulása a hemokoncentrációval, az albumin- és epesavak tartalmának növekedésével járó állapotokra jellemző.

A tuberkulózisos betegek hemogramja a kezelés során megváltozik. Minél sikeresebb a terápiás beavatkozás, annál gyorsabban tűnnek el a hematológiai elváltozások. Ugyanakkor szem előtt kell tartani a különböző antibakteriális gyógyszerek vérképzésre gyakorolt hatását is. Gyakran eozinofíliát, egyes esetekben leukocitózist, gyakrabban leukopéniát, egészen agranulocitózisig és limfoid-retikuláris reakcióig okoznak. A beteg klinikai állapotának, a folyamat dinamikájának és a kezelés hatékonyságának felméréséhez elengedhetetlen a szisztematikus hematológiai monitorozás és a kapott adatok helyes elemzése.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinikai vizeletelemzés

Húgyúti tuberkulózis esetén a vizeletvizsgálat a fő laboratóriumi diagnosztikai módszer. Leukocituria, eritrocituria, proteinuria, hipoizosztenuria, tuberkulózisos mycobacteriumiria, nem specifikus bakteriuria figyelhető meg.

A leukocituria a húgyúti tuberkulózis leggyakoribb tünete specifikus kemoterápia előtt, és csak kivételes esetekben hiányzik, például a húgyvezeték lumenének teljes elzáródása esetén. A Nechiporenko-teszt (a leukociták számának meghatározása 1 ml vizeletben) segít objektívebben felmérni a leukocituria mértékét nephrotuberculosisban, és bizonyos esetekben kimutatni azt normál általános vizeletvizsgálattal. Azonban figyelembe kell venni, hogy a leukocituria előfordulhat akut és krónikus pyelonephritisben, cystitisben, húgycsőgyulladásban, vesekőben és húgyvezetékekben.

Az eritrocituria, a leukocituriához hasonlóan, a húgyúti tuberkulózis egyik leggyakoribb laboratóriumi tünetének tekinthető. A vérvizelés gyakorisága a folyamat prevalenciájától függ; a vesében kialakuló destruktív tuberkulózisos folyamattal együtt növekszik. A leukocituria nélküli eritrocituria a vese tuberkulózisának korai szakaszára jellemzőbb. A leukocituriával szemben domináló vérvizelés fontos érv a vese tuberkulózisa mellett a nem specifikus pyelonephritistől való megkülönböztetéskor.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biokémiai vérvizsgálat

Tuberkulózis esetén egyes biokémiai mutatók változásai elsősorban a folyamat fázisától, a szövődményektől és a különféle társbetegségektől függenek. Inaktív tüdő- és egyéb szervtuberkulózisban szenvedő betegeknél a vérszérum teljes fehérje- és fehérjefrakciói nem változnak, és meghatározzák normál tartalmukat.

A betegség akut formáiban, valamint a tuberkulózis krónikus formáinak súlyosbodásában és progressziójában az albumin-globulin együttható csökken.

A tuberkulózisban és szövődményeiben a máj funkcionális állapotának és szerves károsodásának felmérésében jelentős jelentőséggel bír a direkt és teljes bilirubin, az aszpartát-aminotranszferáz (AST) és az alanin-aminotranszferáz (ALT) meghatározása a vérszérumban. Az aminotranszferázok szintjének dinamikus meghatározása. A bilirubinszint a tuberkulózisban szenvedő betegek, különösen súlyos formáinak kezelésében a tuberkulózisos betegek biokémiai vizsgálatának kötelező része, és havonta történik.

A vesék funkcionális állapotának értékelése magában foglalja a szérum kreatininszintjének meghatározását és a glomeruláris filtrációs ráta kiszámítását a Cockcroft-Gault képlet segítségével. A glomeruláris filtrációs ráta kiszámítása a Reberg-teszttel kevésbé pontos eredményeket ad.

A tuberkulózisban szenvedő betegek dinamikus biokémiai vizsgálatainak fő célja a folyamat lefolyásának nyomon követése, a gyógyszerek mellékhatásainak időben történő felismerése és a kialakuló homeosztázis zavarok megfelelő korrekciója.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Biokémiai kutatási módszerek alkalmazása extrapulmonális tuberkulózisban

A leginformatívabb mutatónak a biológiai folyadékokban található tuberkulosztearinsav tartalmát tekintik, azonban meghatározása technikai nehézségekkel jár (gázkromatográfia és tömegspektrometria szükségessége).

Ígéretes az adenozin-deamináz aktivitásának mérése - egy enzim, amelyet folyadékokban határoznak meg: szinoviális, szívburok-, ascites- vagy agy-gerincvelői folyadékokban. Az adenozin-deamináz fő termelői a limfociták és a monociták. Az adenozin-deamináz aktivitásának meghatározása biológiai folyadékokban megkönnyíti a tuberkulózisos synovitis, a nyirokcsomó-tuberkulózis, a tuberkulózisos meningitis és a tuberkulózisos serositis diagnózisát.

Néhány biokémiai indikátort – nem specifikus jellegük miatt – csak a lézióhoz közeli biológiai folyadékokban lehet meghatározni. Az indikátorok szintjét a tuberkulin szubkután vagy intradermális adagolására adott válaszként mérik (általában a beadás előtt, valamint 48 és 72 órával utána). Ezt követően kiszámítják a marker szintjének növekedésének mértékét (%-ban) a kezdeti szinthez képest.

Optimális esetben a szervspecifikus transzamidináz enzim aktivitását a vizeletben határozzák meg; megjelenése különböző eredetű vesekárosodásban figyelhető meg. A transzamidináz vizsgálata csak akkor indokolt, ha a tuberkulint szubkután adják be a helyi gyulladásos folyamat súlyosbítása érdekében. A transzamidináz aktivitását a vizeletben kezdetben és az 50 TE tuberkulin beadása után 24-72 órával határozzák meg. A fermenturia kétszeres vagy annál nagyobb növekedése az esetek 82%-ában lehetővé teszi a vesék aktív tuberkulózisának megkülönböztetését a krónikus pyelonephritis súlyosbodásától.

Női nemi szervek tuberkulózisa esetén a haptoglobin és a malondialdehid koncentrációját a vérben provokatív tuberkulin teszttel határozzák meg. A tuberkulint 50 TE dózisban szubkután adják be, és 72 óra elteltével ismételt biokémiai vizsgálatot végeznek. Tuberkulózisos etiológia esetén a haptoglobinszint növekedésének mértéke legalább 28%, a malondialdehid szintje pedig 39% vagy több. Az adenozin-deamináz aktivitásának meghatározását a Douglas-tasakból nyert peritoneális folyadékban is alkalmazzák. A punkciót 72 órával a tuberkulin 0,1 TE és 0,01 TE dózisú intradermális beadása után ismételten megvizsgálják a belső nemi szervek elülső hasfalra vetített területén. Az adenozin-deamináz aktivitásának a kezdeti értékhez képest 10%-os vagy nagyobb növekedése tuberkulózisos folyamatra utal.

Szemkárosodás esetén az antigén stimulációra adott válaszként a szemben fellépő fokális reakciót vizsgálják. Ebben az esetben nem kívánatos az élesen kifejezett válasz kialakulása, amelyet a vizuális funkciók csökkenése kísér. Mivel a minimális fokális reakciók értékelése gyakran nehézkes, a következtetés objektív alátámasztása érdekében ajánlott párhuzamosan a haptoglobin vagy az adenozin-deamináz szintjének növekedésére összpontosítani a vérszérumban.

Minden biokémiai vizsgálatot más módszerekkel kombinálva kell elvégezni.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

A véralvadási rendszer vizsgálata

A véralvadási rendszer állapotának vizsgálata a fitíziológiában a hemoptysis vagy tüdővérzés jelenlétének, valamint a tuberkulózis sebészeti kezelésében fellépő hemokoagulációs szövődményeknek köszönhető. Ezenkívül a természetes módon kísérő látens intravaszkuláris hemokoaguláció befolyásolja a betegség lefolyását és a kemoterápia hatékonyságát.

A domináns exudatív gyulladásos komponenssel rendelkező tüdőtuberkulózisban szenvedő betegeknél a vér antikoaguláns aktivitásának csökkenése figyelhető meg. Alacsony prevalenciájú specifikus tüdőkárosodás esetén, domináns produktív gyulladásos komponenssel, az intravaszkuláris hemokoaguláció jelentéktelen. Vérköpéssel és tüdővérzéssel járó tüdőtuberkulózisban szenvedő betegeknél a véralvadási rendszer állapota eltérő: a vérzés csúcspontján vagy közvetlenül annak megszűnése után kisebb vérveszteség esetén a vér koagulációs kapacitásának hirtelen növekedése figyelhető meg a trombinképződési folyamatok kifejezett fokozódása miatt, miközben a megnövekedett "strukturális" koagulálhatóság megmarad. Masszív vérveszteség esetén a koagulációs potenciál csökkenése figyelhető meg a fibrinogén koncentrációjának, a XIII. faktor aktivitásának és a vérlemezkeszámnak a csökkenése miatt. A korlátozott formájú tüdőtuberkulózisban szenvedő betegek sebészeti kezelésének szakaszában a homeosztázis rendszerében nem jelentkeznek jelentős zavarok. Széles körben elterjedt folyamatokban szenvedő betegeknél pneumonectomia vagy pleuropneumonectomia esetén gyakran kialakul a DIC-szindróma, amely "második betegség" formájában jelentkezhet.

A tüdőtuberkulózisban szenvedő betegek véralvadási rendszerének állapotának monitorozásához meg kell határozni az aktivált parciális tromboplasztin időt (APTT), a fibrinogént, a trombin időt, a protrombin indexet, valamint a vérzési időt és a véralvadási időt.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonális vizsgálatok

Modern kísérleti és klinikai megfigyelések a hormonális állapot változásainak jelenlétét jelzik a tüdő specifikus tuberkulózisos gyulladásaiban. Bizonyított, hogy az agyalapi mirigy-mellékvese, az agyalapi mirigy-pajzsmirigy rendszerek és a hasnyálmirigy működésének diszfunkciójának korrekciója a tuberkulózis elleni terápiával kombinálva hozzájárul a fibrogenezis és a reparációs folyamatok aktiválódásához a specifikus gyulladás fókuszában.

Az agyalapi mirigy-pajzsmirigy rendszer funkcionális állapotát a vérszérum trijód-tironin (T3), tiroxin (T4) és agyalapi mirigy-stimuláló hormon (TSH) tartalma alapján ítélik meg _{.Megállapították}, hogy a szubklinikai hipotireózis a tüdőtuberkulózisban szenvedő betegek 38-45%-ánál fordul elő, és leggyakrabban a folyamat disszeminált és fibrosus-kavernózus formáiban diagnosztizálják. Ezekben a formákban mind a T3, mind a T4 szintje a legjelentősebben csökken _, és ezen hormonok _{egyensúlyhiánya a T4/} T3 _arány növekedése formájában jelentkezik.

A mellékvesekéreg működését a szérum kortizolszintje, a hasnyálmirigy endokrin funkcióját pedig az immunreaktív inzulin koncentrációja méri. A fertőző betegségek akut fázisában megnő az endogén kortizol és inzulin iránti igény. A hiperinzulinémia a testszövetek inzulinrezisztenciáját is jelzi, ami jellemző minden aktív gyulladásos folyamatra, különösen egy specifikus folyamatra. A mellékvesék glükokortikoid funkciójának meghatározása aktív tüdőtuberkulózisban lehetővé teszi a hiperkorticizmus jelenlétének kimutatását a legtöbb betegnél. A fertőző gyulladásban szenvedő betegek normális vérkortizol-koncentrációját az akut időszakban a mellékvesekéreg glükokortikoid funkciójának relatív elégtelenségének kell tekinteni, amely alapul szolgálhat a megfelelő dózisú glükokortikoidokkal végzett helyettesítő terápia alapjául.

A tüdőtuberkulózisban szenvedő betegek közel egyharmadánál alacsony, a normálérték alsó határához közelítő inzulinémia figyelhető meg, míg 13-20%-uknál jelentős hiperinzulinizmus figyelhető meg. Mind a relatív hipo-, mind a hiperinzulinizmus magas kockázati tényező a különböző súlyosságú szénhidrát-anyagcsere-zavarok kialakulásában. A hasnyálmirigy B-sejtjeinek funkcionális aktivitásában bekövetkező ezen változások rendszeres glikémiás monitorozást igényelnek a tuberkulózisban szenvedő betegeknél, valamint a cukorbetegség időben történő megelőzését. Ezenkívül ez további indoklást nyújt a fiziológiás dózisú inzulin alkalmazásának helyénvalóságára a tuberkulózis komplex terápiájában.

Általánosságban elmondható, hogy a pajzsmirigyhormonok szintjének csökkenése, egyensúlyhiányuk, hiperkortizolémia és hiperinzulinizmus a legsúlyosabb a tuberkulózisos folyamat súlyos lefolyásában szenvedő betegeknél, kiterjedt tüdőelváltozásokkal és a tuberkulózis-mérgezés kifejezett tüneteivel.

A tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikája

A mikrobiológiai vizsgálatok szükségesek a tuberkulózisos betegek azonosításához, a diagnózis ellenőrzéséhez, a kemoterápia monitorozásához és korrigálásához, a kezelés eredményeinek értékeléséhez, vagyis attól a pillanattól kezdve, hogy a tuberkulózisos beteget regisztrálják, egészen addig, amíg a nyilvántartásból nem törlik.

Minden epidemiológiai program és projekt a baktériumkiválasztók számának felmérésén alapul, ami lehetetlen a tuberkulózis mikobaktériumok kimutatására szolgáló laboratóriumi módszerek alkalmazása nélkül. Az úgynevezett nem szervezett populáció vonzerejének vizsgálatakor a baktériumkiválasztók százalékos aránya eléri a 70-et vagy többet, ami a laboratóriumi módszereket meglehetősen hatékony eszközzé teszi a tuberkulózisos betegek azonosítására ebben a populációs csoportban.

A tuberkulózis diagnosztizálásának hagyományos mikrobiológiai módszerei a bakterioszkópos és a tenyésztési vizsgálatok. A modern módszerek közé tartozik a tuberkulózis mikobaktériumok tenyésztése automatizált rendszerekben és a PCR. Ezeket a módszereket azonban szükségszerűen kombinálják a klasszikus bakteriológiai módszerekkel.

Diagnosztikai anyag gyűjtése

A laboratóriumi vizsgálatok hatékonysága nagymértékben függ a diagnosztikai anyag minőségétől. A diagnosztikai anyagok gyűjtésére, tárolására és szállítására vonatkozó szabályok betartása, valamint a betegvizsgálati algoritmus pontos végrehajtása közvetlenül befolyásolja az eredményt és biztosítja a biológiai biztonságot.

A tuberkulózis vizsgálatára különféle anyagokat használnak. Mivel a tüdőtuberkulózis a tuberkulózisfertőzés leggyakoribb formája, a vizsgálat fő anyaga a köpet és a tracheobronchiális fa egyéb váladékai: felső légúti váladékok aeroszolos belégzés után; hörgőmosó folyadékok; bronchoalveoláris mosófolyadékok; bronchoszkópia, transztracheális és intrapulmonális biopszia során nyert anyagok: hörgőaspirátum, gégekenetek, váladékok, sebkenetek stb.

A kutatás hatékonysága növekszik, ha a betegtől ellenőrzött anyaggyűjtést végeznek. Erre a célra egy speciálisan felszerelt szobát jelölnek ki, vagy speciális fülkéket vásárolnak. Az anyaggyűjtés veszélyes eljárás, ezért a kutatáshoz szükséges anyagot a fertőzésvédelmi szabályok betartásával kell gyűjteni.

A Mycobacterium tuberculosis vizsgálatához szükséges anyagot steril, szorosan csavaros kupakkal ellátott fiolákba gyűjtik, hogy megakadályozzák a környezet szennyeződését és megvédjék a gyűjtött anyagot a szennyeződéstől.

A diagnosztikai anyagok gyűjtésére szolgáló fioláknak a következő követelményeknek kell megfelelniük:

• ütésálló anyagból kell készülnie;
• autoklávozáskor könnyen megolvadnia kell;
• elegendő térfogatúnak kell lennie (40-50 ml):
• széles nyílással rendelkezik a köpet összegyűjtésére (átmérője legalább 30 mm);
• könnyen kezelhető, átlátszó vagy áttetsző legyen, hogy a gyűjtött minta mennyisége és minősége a fedél kinyitása nélkül is megállapítható legyen.

A kutatás optimális eredményeinek eléréséhez a következő feltételeknek kell teljesülniük:

• az anyaggyűjtést a kemoterápia megkezdése előtt kell elvégezni;
• a vizsgálathoz szükséges anyagot reggel étkezés vagy gyógyszerszedés előtt kell összegyűjteni;
• A vizsgálathoz legalább 3 reggeli köpetminta gyűjtése ajánlott. A köpetet 3 egymást követő napon gyűjtik;
• A begyűjtött anyagot a lehető leggyorsabban a laboratóriumba kell szállítani:
• azokban az esetekben, amikor az anyagot nem lehet azonnal laboratóriumba szállítani, hűtőszekrényben, 4 °C-os levegőhőmérsékleten tárolják legfeljebb 48 órán át;
• Az anyag szállításakor különös figyelmet kell fordítani a palackok integritására.

A helyesen gyűjtött köpet nyálkás vagy mukopurulens jellegű. A köpet vizsgált részének optimális térfogata 3-5 ml.

A köpetgyűjtés egészségügyi dolgozó felügyelete mellett történik. A köpetgyűjtésért felelős személyeknek bizonyos szabályok betartását kell biztosítaniuk:

• El kell magyarázni a betegnek a vizsgálat célját, és azt, hogy nem nyálat vagy orrgarati nyákot, hanem a légutak mély szakaszainak tartalmát kell felköhögni. Ez a több (2-3) mély lélegzetvétel után fellépő produktív köhögés eredményeként érhető el. Azt is figyelmeztetni kell a beteget, hogy először forralt vízzel ki kell öblítenie a száját, hogy eltávolítsa a szájüregben vegetáló mikroflóra fő részét és az ételmaradékokat, amelyek megnehezítik a köpet vizsgálatát;
• A köpetgyűjtésben részt vevő egészségügyi dolgozónak a köpeny és a sapka mellett maszkot, gumikesztyűt és gumikötényt is kell viselnie;
• A beteg mögött állva azt tanácsoljuk, hogy a palackot a lehető legközelebb tartsa az ajkához, és köhögéskor azonnal válassa ki a váladékot, miközben ügyelni kell arra, hogy a légáramlás az egészségügyi dolgozótól elfelé irányuljon:
• Miután a köpetvétel befejeződött, az egészségügyi dolgozónak gondosan le kell zárnia az üveget a kupakkal, és fel kell mérnie a begyűjtött köpet mennyiségét és minőségét. Az üveget ezután felcímkézik, és egy speciális dobozba helyezik a laboratóriumba szállításhoz.

Ha a beteg nem termel köpetet, akkor a mintavétel előtti este és napján kora reggel köptetőt kell adni neki: ziliz gyökérkivonatát (mukaltin), brómhexint, ambroxolt stb. - vagy irritáló inhalációt kell alkalmazni, a köpetvételre szolgáló helyiségben felszerelt berendezéssel. Az így gyűjtött anyag nem tartósítható, és a gyűjtés napján meg kell vizsgálni. A laboratóriumi "kiutasítás" elkerülése érdekében a beutalón külön megjegyzést kell tenni.

Amennyiben az adott intézményben nem végeznek mikrobiológiai vizsgálatokat, a begyűjtött diagnosztikai anyagot központilag kell a laboratóriumba szállítani, azzal a feltétellel, hogy a szállítások között az anyagot hűtőszekrényben vagy tartósítószerrel tárolják. Az anyagot könnyen fertőtleníthető szállítódobozokban szállítják a laboratóriumba. Minden mintát megfelelő címkével kell ellátni, a teljes tételhez pedig kitöltött kísérőlap szükséges.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

A betegek vizsgálatának módjai és gyakorisága

A beteg tuberkulózisos kezdeti, úgynevezett diagnosztikai vizsgálata során legalább 3 adag köpetet kell megvizsgálni, amelyeket orvosi személyzet felügyelete alatt gyűjtöttek 2 vagy 3 nap alatt, ami növeli a mikroszkópia hatékonyságát.

A tuberkulózis elsődleges szűrését az egészségügyi rendszer minden orvosi és diagnosztikai intézményének el kell végeznie. Az utóbbi időben az elsődleges vizsgálatok hatékonyságának növelése érdekében úgynevezett mikroszkópos központokat szerveztek a klinikai diagnosztikai laboratóriumok alapján, amelyek modern mikroszkópokkal és berendezésekkel vannak felszerelve a járványbiztonság biztosítása érdekében.

A tuberkulózisellenes intézmények olyan felmérési rendszert alkalmaznak, amely a köpet vagy más diagnosztikai anyag legalább háromszoros vizsgálatát írja elő 3 napon belül. A kezelés során a mikrobiológiai vizsgálatokat rendszeresen, legalább havonta egyszer végzik az intenzív kemoterápiás fázisban. A követési fázisba való áttéréskor a vizsgálatokat ritkábban - 2-3 hónapos időközönként - végzik, míg a vizsgálatok gyakorisága kettőre csökken.

Az extrapulmonális tuberkulózis diagnosztikai anyagának gyűjtésének jellemzői

A tuberkulózis extrapulmonális formáiban a kóros anyag egyik jellemzője a mycobacteriumok tuberculosisának alacsony koncentrációja, amely érzékenyebb mikrobiológiai kutatási módszereket igényel, elsősorban a táptalajra vetés módszereit.

Urogenitális tuberkulózis esetén a vizelet a legkönnyebben hozzáférhető vizsgálati anyag. A vizeletgyűjtést speciálisan képzett ápolónak kell végeznie.

A külső nemi szerveket vízzel és szappannal vagy gyenge kálium-permanganát oldattal mossák. A húgycső külső nyílását gondosan kezelik. A reggeli vizelet középső részét steril üvegbe gyűjtik: férfiaknál - természetesen, nőknél - katéter segítségével. A vesemedencéből származó vizeletet steril kémcsövekbe gyűjtik egy vagy két vese katéterezése során, utóbbi esetben - szükségszerűen külön-külön mindkét vesétől. Ebből a vizeletből kis mennyiséget centrifugálnak, az üledéket megvizsgálják.

Férfiaknál a spermiumokat, a herék punkcióit és a prosztata váladékát centrifugálják az üledék kinyerése érdekében. A nemi szervek területén található specifikus folyamat bármely lokalizációja esetén a prosztata masszázs elősegítheti a tuberkulózis mycobacteriumokat tartalmazó váladék felszabadulását.

A menstruációs vért szívással vagy Kafka-sapka segítségével gyűjtik össze a nőktől. A kapott anyagot desztillált vízzel történő mosással, majd centrifugálással tisztítják meg az eritrocitáktól. Az üledéket megvizsgálják.

A méhnyakcsatornából származó váladékot valamilyen tartályba vagy Kafka-kupakba gyűjtik, vagyis kívánatos 1-2 ml kóros anyagot felhalmozni.

A veséken, nemi szerveken végzett sebészeti beavatkozások, biopsziák, méhnyálkaparék során nyert anyagot homogenizálják. Ehhez steril mozsárba helyezik, és steril ollóval alaposan összetörik. A kapott szuszpenzióhoz tömegének megfelelő mennyiségben steril folyami homokot adnak, majd 0,5-1,0 ml izotóniás nátrium-klorid-oldatot adnak hozzá, és mindent addig őrölnek, amíg pépes masszát nem kapnak izotóniás nátrium-klorid-oldat (4-5 ml) hozzáadásával. Ezután a masszát 1-1,5 percig hagyják ülepedni, majd a felülúszót megvizsgálják.

Csont- és ízületi tuberkulózis. A steril fecskendővel szúrt gennyet (tályogokból származó gennyet) steril tartályba helyezik, és azonnal a laboratóriumba szállítják. Steril pipettával, amelyet előzőleg steril izotóniás nátrium-klorid-oldattal megnedvesítettek, 2-5 ml gennyet vesznek, gyöngyökkel ellátott palackba öntik, és további 2-3 ml izotóniás nátrium-klorid-oldatot adnak hozzá. A palackot dugóval lezárják, és 8-10 percig rázógépben rázzák. A homogenizált szuszpenziót megvizsgálják.

Az osteoartikuláris tuberkulózis sipolyos formái esetén gennyet vesznek a sipolyból. A bőséges váladékot közvetlenül egy kémcsőbe gyűjtik. Kevés gennyváladék esetén a sipoly útvonalát steril izotóniás nátrium-klorid-oldattal mossák, és a mosófolyadékot egy kémcsőben vagy egy gennyel átitatott tampondarabban gyűjtik össze, majd vizsgálatra küldik.

A csontokon és ízületeken végzett sebészeti beavatkozások során nyert sebészeti anyag gennyes-nekrotikus tömegekből, granulátumokból, hegszövetből, csontszövetből, ízületi membrán szövetéből és egyéb szubsztrátumokból állhat. Feldolgozása a vesetuberkulózishoz hasonlóan történik.

A szinoviális folyadék mikrobiológiai vizsgálatát 3%-os nátrium-citrát oldatban (1:1 arányban) végezzük a véralvadás megelőzése érdekében közvetlenül a punkció után.

Nyirokcsomó-tuberkulózis. A nyirokcsomók punkciója során kivont gennyet ugyanúgy vizsgálják, mint a tályogokból származó gennyet. A sebészeti beavatkozások és biopsziák során nyert nyirokcsomó-szövetet a tuberkulózis más formáihoz hasonlóan vizsgálják.

A Mycobacterium tuberculosis székletvizsgálatát rendkívül ritkán végzik a pozitív eredmények szinte teljes hiánya miatt.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mycobacteriumok mikroszkópiája

A köpetmikroszkópia egy viszonylag gyors, egyszerű és olcsó módszer, amelyet minden tuberkulózis gyanúja esetén alkalmazni kell. Ezenkívül ezt a vizsgálatot a kemoterápia hatékonyságának felmérésére, valamint a tenyésztési eredmények hiányában a gyógyulás vagy a kezelés sikertelenségének megerősítésére végzik.

A mikroszkópos vizsgálatnak két módszerét alkalmazzák:

• közvetlen mikroszkópos módszer, amikor a kenetet közvetlenül a diagnosztikai anyagból készítik;
• dekontaminálószerekkel kezelt anyagból előállított üledék mikroszkópos vizsgálatának módszere kulturális kutatás céljából.

Az első módszert azokban a laboratóriumokban alkalmazzák, ahol csak mikroszkópos vizsgálatokat végeznek (az általános orvosi hálózat klinikai diagnosztikai laboratóriumai).

A mikroszkópos vizsgálat legjobb eredményeit a diagnosztikai anyag koncentrálásával (például centrifugálással) kapjuk.

Ahhoz, hogy a Mycobacterium tuberculosis mikroszkóppal 50%-os valószínűséggel kimutatható legyen, 1 ml köpetnek több mint 5000 mikrobiális sejtet kell tartalmaznia. A tuberkulózis tüdőformájában szenvedő betegek köpetében általában jelentős számú saválló baktérium található, ami lehetővé teszi azok megbízható kimutatását bakterioszkópiával. A módszer diagnosztikai érzékenysége növelhető egy betegtől származó több köpetminta vizsgálatával. A negatív bakterioszkópos vizsgálati eredmény nem zárja ki a tuberkulózis diagnózisát, mivel egyes betegek köpetében kevesebb Mycobacterium található, mint amennyit mikroszkóppal kimutatni lehet. A köpetkenetek nem megfelelő elkészítése is okozhatja a negatív bakterioszkópos vizsgálati eredményt.

A saválló mikobaktériumok kenetben történő kimutatásának leggyakoribb módszere a Ziehl-Neelsen festés. A módszer azon alapul, hogy a karbol-fukszin egy viasz-lipid réteget tartalmazó membránon keresztül behatol a mikrobiális sejtbe, a melegítés és a fenol erős maró hatásának egyidejű hatására. A kenet ezt követő elszíntelenítése 25%-os kénsavoldattal vagy 3%-os sósavoldattal az összes nem saválló szerkezet elszíneződéséhez vezet. A kenet elszíntelenített elemeit 0,3%-os metilénkék oldattal festjük meg. A mikobaktériumok nem érzékelik a hagyományos anilinfestékeket, aminek következtében a saválló mikobaktériumok málnavörösre, más mikrobák és sejtelemek pedig kékre festődnek.

A Ziehl-Neelsen szerint festett kenetvizsgálathoz immerziós objektívvel (90- vagy 100-szoros nagyítású) ellátott fény binokuláris mikroszkópot és 7- vagy 10-szeres nagyítású okulárt kell használni. 100 látómezőt vizsgálnak, ami elegendő egyetlen mikobaktérium kimutatására a kenetben. Ha egy ilyen vizsgálat eredménye negatív, további 200 látómező vizsgálata javasolt a megerősítés érdekében. Az eredményeket feljegyzik, feltüntetve a kimutatott saválló mikobaktériumok (AFB) számát.

Ezen módszer mellett a lumineszcens mikroszkópiához fluorokróm festést is alkalmaznak, amely lehetővé teszi a legjobb eredmények elérését. Ennek a módszernek az alkalmazása 10-15%-kal növeli a mikroszkópia hatékonyságát. Amikor a mikobaktériumokat lumineszcens festékekkel (auramin, rodamin stb.) kezelik, ezek az anyagok szintén kötődnek a mikrobiális sejt viaszszerű szerkezeteihez. Amikor a festett sejteket gerjesztő fényforrással (egy bizonyos ultraibolya sugárzás spektrumával) besugározzák, narancssárgán vagy élénkvörösen kezdenek izzani fekete vagy sötétzöld háttér előtt. A látható kép nagy fényereje és kontrasztja miatt a mikroszkóp teljes nagyítása 4-10-szeresére csökkenthető, ami kiterjeszti a látómezőt és csökkenti a készítmény vizsgálati idejét. Ezzel együtt a jelentősen nagyobb mélységélesség miatt a vizsgálat kényelme is növelhető.

Fluoreszcens mikroszkópia alkalmazása esetén egy kenet ugyanazon területének vizsgálata lényegesen kevesebb időt vesz igénybe, mint a Ziehl-Neelsen szerint festett kenet fénymikroszkópos vizsgálata. Ha egy mikroszkópos egy munkanapon körülbelül 20-25 ilyen kenetet tekint meg, akkor fluoreszcens mikroszkópia segítségével több mint 60-80 mintát tud megvizsgálni ugyanennyi idő alatt. A tapasztalt mikroszkóposok tudják, hogy a sejtek auramin és rodamin keverékével történő festése valamilyen módon specifikus a saválló mikobaktériumokra, amelyek ebben az esetben aranyszínű pálcák megjelenését mutatják. A szaprofiták zöldesre festődnek.

A fluoreszcens mikroszkópos módszer további fontos előnye, hogy képes kimutatni a megváltozott mikobaktériumokat, amelyek számos kedvezőtlen tényező, különösen az intenzív kemoterápia hatására elvesztették saválló tulajdonságaikat, és ezért a Ziehl-Neelsen festéssel nem mutathatók ki.

A fluoreszcens mikroszkópos módszer hátrányai közé tartozik a mikroszkóp és üzemeltetésének viszonylag magas költsége. Azonban központosított vagy más nagyméretű laboratóriumokban, ahol a munkaterhelés meghaladja a három laboratóriumi technikus és három hagyományos mikroszkóp közötti munkát, olcsóbb egy fluoreszcens mikroszkópot használni.

A bakterioszkópos módszerek meglehetősen magas specificitással rendelkeznek (89-100%). A mikroszkópos módszerrel kapott pozitív eredmények mintegy 97%-át a vetés eredményei egyértelműen megerősítik.

Meg kell jegyezni, hogy a kóros anyag kenetének mikroszkópos vizsgálata nem teszi lehetővé a kimutatott savrezisztens mikobaktériumok fajának meghatározását. A mikroszkópos módszer csak a savrezisztens mikroorganizmusok jelenlétére vagy hiányára vonatkozóan tesz lehetővé következtetést a készítményben, amit a természetben található nagyszámú, nem tuberkulózisos, savrezisztens mikroorganizmus jelenléte magyaráz, amelyek morfológiailag hasonlóak a tuberkulózis komplex mikobaktériumaihoz.

A mikroszkópos eredmények kiértékelését szemikvantitatív egységekben végezzük.

A különböző mikroszkópos módszerek eredményeinek összehasonlításához empirikus együtthatókat vezetnek be. Például egy fluoreszcens festékekkel festett kenet eredményeinek és egy fénymikroszkópos vizsgálat (1000-szeres nagyítás) adatainak összehasonlításához a fluoreszcens mikroszkóppal kimutatott saválló mikobaktériumok számát el kell osztani a megfelelő együtthatóval: a mikroszkóp 250-szeres nagyításánál - 10-zel, 450-szeresnél - 4-gyel, 630-szorosnál - 2-vel.

A mikroszkópia jellemzői extrapulmonális tuberkulózisban

Direkt mikroszkópiát, valamint a dúsítás után elkészített kenetminták mikroszkópiáját is elvégezzük, majd Ziehl-Neelsen vagy fluoreszcens festékekkel festjük. A kenetminták közvetlen mikroszkópiája nem hatékony az anyagban található mikobaktériumok alacsony koncentrációja miatt, ezért racionálisabb a dúsítási módszerek alkalmazása. A centrifugálás a leghatékonyabb. Ha a biológiai anyag viszkózus, akkor centrifugálást alkalmazunk az anyag egyidejű homogenizálásával és cseppfolyósításával, amelyet 3000 g centrifugális erővel rendelkező nagysebességű centrifugákkal és hipoklorit oldatokkal végzünk. Más dúsítási módszerek, például a mikroflotáció, jelenleg nem használatosak a biológiailag veszélyes aeroszolok képződése miatt.

[ 37 ]

Kulturális módszer a tuberkulózis diagnosztizálására

A tenyésztési módszer, vagy más néven oltási módszer érzékenyebb, mint a kenetmikroszkópia, és számos előnnyel rendelkezik az utóbbival szemben. Lehetővé teszi több tucat életképes mikobaktérium kimutatását a vizsgált anyagban, és magas diagnosztikai értékkel rendelkezik. Ez különösen fontos az újonnan diagnosztizált vagy kezelt, kis számú mikobaktériumot ürítő betegekből származó anyag vizsgálatakor.

A mikroszkópiával összehasonlítva a tenyésztéses kutatás lehetővé teszi a kimutatott tuberkulózisos betegek számának több mint 15-25%-kal történő növelését, valamint a tuberkulózis korábbi stádiumokban történő igazolását, amikor a betegség még könnyen kezelhető. A tenyésztéses kutatás egyik nagyon fontos előnyének tekintik a kórokozó tenyészetének előállításának lehetőségét, amely azonosítható és vizsgálható a gyógyszerérzékenység, a virulencia és más biológiai tulajdonságok tekintetében.

A tenyésztési módszerek hátrányai közé tartozik az időtartamuk (az anyagok várakozási ideje eléri a 10 hetet), a magasabb költségek és a diagnosztikai anyag feldolgozásának összetettsége.

A diagnosztikai anyag vetés előtti kezelésének alapelvei

A hagyományos mikrobiológiai módszerek nem alkalmazhatók tuberkulózis-tesztek elvégzésére. Ez annak köszönhető, hogy a tuberkulózis mikobaktériumai nagyon lassan szaporodnak, és a legtöbb klinikai minta gyorsan növekvő gennyes és rothadó mikroorganizmusokat és gombákat tartalmaz. Gyors növekedésük gazdag táptalajon akadályozza a mikobaktériumok fejlődését, és nem teszi lehetővé a tuberkulózis kórokozójának izolálását, ezért a diagnosztikai anyagot vetés előtt elő kell kezelni. Ezenkívül a beteg légzőrendszeréből felszabaduló mikobaktériumokat általában nagy mennyiségű nyálka veszi körül, ami megnehezíti a koncentrálásukat. E tekintetben a köpet és más hasonló anyagok vetés előtt cseppfolyósítani és fertőtleníteni kell azokat.

Minden mosó- és fertőtlenítőszer többé-kevésbé kifejezett toxikus hatással van a mikobaktériumokra. A kezelés eredményeként a mikobaktériumok akár 90%-a is elpusztulhat. A mikobaktérium-populáció megfelelő részének megőrzése érdekében olyan kíméletes kezelési módszereket kell alkalmazni, amelyek lehetővé teszik egyrészt a gyorsan növekvő gennyes és rothadó mikroorganizmusok elnyomását, másrészt az anyagban jelen lévő mikobaktériumok életképességének maximális megőrzését.

Az anyagtól, homogenitásától és szennyezettségi szintjétől függően különféle fertőtlenítőszereket alkalmaznak az oltás előtti kezeléshez: köpet esetén - 4%-os nátrium-hidroxid oldat, 10%-os trinátrium-foszfát oldat, benzalkónium-klorid-trinátrium-foszfát, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisztein-nátrium-hidroxid) 1%-os végső NaOH koncentrációval, vizelet és egyéb folyékony anyagok esetén - 3%-os kénsavoldat, szennyezett minták, zsírtartalmú anyagok esetén - legfeljebb 5%-os oxálsavoldat. Ezenkívül bizonyos esetekben enzimeket és felületaktív anyagokat (detergenseket) is használnak. A Tween és néhány más detergens használata a mikobakteriális sejtek kisebb mértékű pusztulásával jár (40-50%-uk túléli). Ezek azonban csak folyékony anyagokhoz alkalmazhatók. A készletekben előállított NALC-NaOH a világon a legszélesebb körben használt. Ez a módszer lehetővé teszi a mikobakteriális sejtpopuláció több mint 85%-ának izolálását. A szövetet tartalmazó szilárd anyagok dekontaminálása nehezebb, mivel nehéz megbecsülni az anyag diszperziójának mértékét a homogenizálás során. Például a nyirokcsomó-biopsziák feldolgozása gyakran együtt jár az idegen flórával való szennyeződés fokozott gyakoriságával. Ebben az esetben 1%-os etónium használható.

A nem homogén anyagot üveggyöngyökkel homogenizálják dekontaminálószerek jelenlétében. A folyékony anyagokat előcentrifugálják, és csak az üledéket dolgozzák fel.

Vetés és keltetés technikája

Az előzetes feldolgozás után az anyagot centrifugálják, ami kicsapja a mikobaktériumokat és növeli azok mennyiségét az üledékben ("üledékdúsulás"). A kapott üledéket semlegesítik, és sűrű táptalajok vagy folyékony (félfolyékony) táptalajt tartalmazó kémcsövek felületére oltják. A maradék üledékből keneteket készítenek a mikroszkópos vizsgálathoz. A vetéstechnikának meg kell akadályoznia a diagnosztikai anyag keresztszennyeződését.

A mikrobiológiai kutatások eredményeinek megbízható klinikai értelmezéséhez a következő szabályt kell betartani: a mikroszkópos és kulturális vizsgálatokat párhuzamosan kell elvégezni ugyanazon diagnosztikai anyagmintából.

^{A beoltott csöveket 2 napig 37 °} C -os termosztátban, vízszintes helyzetben helyezik el. Ez biztosítja az anyag egyenletesebb felszívódását a táptalajba. 2 nap elteltével a csöveket függőleges helyzetbe állítják, és gumi- vagy szilikondugóval hermetikusan lezárják, hogy megakadályozzák a beoltott táptalaj kiszáradását.

^{A növényeket 10-12 héten keresztül 37 °} C-os termosztátban tartják, rendszeres heti ellenőrzés mellett. Minden egyes ellenőrző vizsgálat során a következő paramétereket rögzítik:

• a vetés napjától számított vizuálisan megfigyelhető növekedési időszak;
• növekedési ütem (CFU száma);
• a tenyészet szennyeződése idegen mikrobiális flórával vagy gombákkal (az ilyen kémcsöveket eltávolítják);
• nincs látható kinövés. A csöveket a következő ellenőrzésig a termosztátban hagyják.

Tápanyagközeg

A mikobaktériumok tenyésztésére különféle táptalajokat használnak: szilárd, félfolyékony, folyékony. Azonban az ismert táptalajok egyike sem rendelkezik olyan tulajdonságokkal, amelyek biztosítanák az összes mikobaktériumsejt növekedését. E tekintetben a hatékonyság javítása érdekében ajánlott 2-3 különböző összetételű táptalajt egyszerre használni.

A tuberkulózis kórokozó elsődleges izolálására és gyógyszerérzékenységének meghatározására szolgáló standard táptalajként a WHO a Lowenstein-Jensen táptalajt ajánlja. Ez egy sűrű, tojásos táptalaj, amelyen a mikobaktériumok növekedése a bakterioszkóposan pozitív anyag elvetése után 20-25. napon történik. A bakterioszkóposan negatív anyag elvetése hosszabb inkubációs időt igényel (akár 10-12 hétig).

Hazánkban az ER Finn által javasolt Finn-II tojástáptalaj terjedt el széles körben. Ez abban különbözik, hogy L-aszparagin helyett nátrium-glutamátot használ, amely más aminosav-szintézisutakat indít el a mikobaktériumokban. A növekedés ezen a táptalajon valamivel korábban jelentkezik, és a mikobaktériumok izolálásának gyakorisága 6-8%-kal magasabb, mint a Lowenstein-Jensen táptalajon.

Az extrapulmonális tuberkulózis bakteriológiai diagnosztikájának hatékonyságának növelése érdekében célszerű módosított Finn-II táptalajokat beépíteni a táptalajok komplexébe. A növekedés gyorsítása érdekében a Finn-II táptalajhoz további 0,05%-os nátrium-tioglikolátot adnak, ami csökkenti az oxigénkoncentrációt. A mikobaktériumok enzimrendszereinek a lipidperoxidáció toxikus termékeitől való védelme érdekében antioxidáns α-tokoferol-acetátot adnak a Finn-II táptalajhoz 0,001 μg/ml koncentrációban. A diagnosztikai anyagot standard módszerrel vetik be.

Az oroszországi tuberkulózisellenes laboratóriumokban a sűrű táptalajok más módosításait is használják: a GG Mordovsky által javasolt "Novaya" táptalajt, az VA Anikin által kifejlesztett A-6 és A-9 táptalajokat stb.

Mivel a kemoterápia során a mikrobiális sejt különböző anyagcsere-rendszerei károsodnak, a mikobaktérium-populáció egy része elveszíti a képességét, hogy normálisan fejlődjön a hagyományos táptalajon, és ozmotikusan kiegyensúlyozott (félfolyékony vagy folyékony) táptalajon van szüksége.

Diagnosztikai anyagtenyésztési eredmények értékelése és rögzítése

Egyes mikobaktériumtörzsek és -típusok lassan növekednek, a növekedés akár a 90. napra is megjelenhet. Az ilyen kultúrák száma kicsi, de ez arra kényszeríti a vetéseket, hogy 2,5-3 hónapig termosztátban tartsák őket.

A Mycobacterium tuberculosis virulens tenyészetei általában szilárd, tojás alapú táptalajon nőnek, különböző méretű és megjelenésű R-formájú telepek formájában. A telepek szárazak, ráncosak, elefántcsont színűek és enyhén pigmentáltak. Más táptalajon a Mycobacterium tuberculosis telepek nedvesebbek lehetnek. Kemoterápiás kúra után vagy a kezelés alatt sima, nedves növekedésű telepek (S-formák) izolálhatók.

A tenyészetek izolálásakor speciális vizsgálatok sorozatát alkalmazzák a tuberkulózis mikobaktériumok megkülönböztetésére a nem tuberkulózis mikobaktériumoktól és a saválló szaprofitoktól.

Pozitív választ adunk a Ziehl-Neelsen szerint festett, kinőtt telepekből származó kenet kötelező mikroszkópos vizsgálata után. Mikobaktériumok növekedése esetén élénkvörös pálcák találhatók a kenetekben, amelyek egyesével vagy csoportosan fekszenek, filc vagy fonat formájában fürtöket alkotva. Fiatal tenyészetekben, különösen azokban, amelyeket hosszú ideig kemoterápiával kezelt betegekből izoláltak, a mikobaktériumokat kifejezett polimorfizmus jellemzi, egészen a rövid, szinte coccoid vagy hosszúkás, gombás micéliumra emlékeztető változatokig, valamint pálcika alakú formákig.

A mikobaktériumok növekedésének intenzitását a következő séma szerint jelöljük: (+) - 1-20 CFU kémcsőben (alacsony baktériumkiválasztás); (++) - 20-100 CFU kémcsőben (mérsékelt baktériumkiválasztás); (+++) - >100 CFU kémcsőben (bőséges baktériumkiválasztás). A tuberkulózis laboratóriumi diagnosztikájában nem elegendő azt a választ adni, hogy egy adott módszerrel kimutattak-e mikobaktériumokat vagy sem. Szükséges a mikobaktérium-populáció mennyiségének és jellegének, összetételének és tulajdonságainak részletes ismerete is. Ezek az adatok teszik lehetővé a folyamat állapotának helyes értelmezését, a taktika megtervezését és a kezelés időben történő módosítását.

Az utóbbi években agar alapú táptalajokat javasoltak különféle növekedési adalékokkal és speciális gázkeverék használatával a mikobaktériumok növekedésének felgyorsítására. A mikobaktériumok ilyen táptalajokon történő növekedésének eléréséhez a tenyésztés során megnövelt szén-dioxid-tartalmú (4-7%) atmoszférát hoznak létre. Erre a célra speciális CO2 inkubátorokat használnak _. Azonban az automatizált mikobaktérium-tenyésztő rendszerek értek el a legnagyobb fejlődést: az MGIT-BACTEC-960 és az MB/Bact.

Az egyik ilyen rendszer az MGIT (mycobacterium growth indicating tube) rendszer, amely egy high-tech fejlesztés, és a tuberkulózis gyorsított bakteriológiai diagnosztikájára, valamint a mikobaktériumok első vonalbeli és néhány másodvonalbeli gyógyszerrel szembeni érzékenységének meghatározására szolgál. Az MGIT-t a VASTEC-960 készülék részeként való használatra tervezték. A mikroorganizmusokat speciális kémcsövekben tenyésztik módosított Middlebrook-7H9 táptalaj alapú folyékony táptalajban. A mikobaktériumok növekedésének serkentésére és az idegen mikroflóra növekedésének elnyomására MGIT növekedési kiegészítőt és PANTA antibakteriális gyógyszerek keverékét használják.

A mikroorganizmusok növekedését optikailag regisztrálják. A módszer a fluoreszcencián alapul, amely akkor következik be, amikor a mikobaktériumok oxigént fogyasztanak növekedésük során. Egy speciális kémcső alján egy oxigénfüggő fluorokróm festék található, amelyet szilikonréteg borít. A mikobaktériumok szaporodása a kémcsőben lévő oxigén mennyiségének csökkenéséhez és koncentrációjának csökkenéséhez vezet, ami a fluoreszcencia növekedését okozza, amely akkor válik láthatóvá, amikor a kémcsövet ultraibolya fénnyel besugározzák, és amelyet a VASTES-960 készülékbe épített fotoszenzorok automatikusan regisztrálnak. A lumineszcencia intenzitását növekedési egységekben (GU) regisztrálják. A növekedési adatok automatikusan bekerülnek egy számítógépbe, ahol menthetők. A növekedési görbék számítógépes elemzése információt nyújthat a különböző mikobaktérium-készletek, beleértve a nem tuberkulózisos mikobaktériumokat is, jelenlétéről, és segít a mikobaktériumok növekedési tulajdonságainak értékelésében is.

Az ilyen rendszerek bevezetésének eredményeként a mikobaktériumok növekedési ideje jelentősen lecsökkent, átlagosan 11 nap a VASTEC-960-on és 19 nap az MB/Bact-on, szemben a standard sűrű táptalajon mért 33 nappal. Meg kell jegyezni, hogy ezek a rendszerek magasan képzett személyzetet igényelnek. A folyékony táptalajon történő vetést szükségszerűen a Lowenstein-Jensen táptalajon történő vetés is kíséri, amely tartalék szerepet játszik azokban az esetekben, amikor a tuberkulózis mikobaktériumok nem szaporodnak más táptalajon.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

A mikobaktériumok gyógyszerérzékenységének meghatározása

A mikobaktériumok tuberkulózisellenes gyógyszerekkel szembeni spektrumának és érzékenységi fokának meghatározása nagy klinikai jelentőséggel bír, valamint a gyógyszerrezisztens tuberkulózis terjedésének epidemiológiai értékeléséhez is. Ezenkívül a gyógyszerrezisztencia monitorozása lehetővé teszi a tuberkulózisellenes program egészének hatékonyságának felmérését, mivel szerves mutatója a tuberkulózisellenes intézkedések minden összetevőjének munkájának.

A gyógyszerérzékenységi vizsgálatok gyakorisága és időzítése:

• a kezelés megkezdése előtt, egyszer a kezelési stratégia és taktika meghatározása érdekében:
• Amikor egy betegből különböző anyagokból (köpet, BAL, vizelet, váladékok, agy-gerincvelői folyadék stb.) tenyészeteket izolálunk, minden izolált törzset megvizsgálunk:
• a kezelés intenzív fázisának végén klinikai és radiológiai dinamika hiányában:
• ha a kezelési rend megváltoztatása szükséges a következő esetekben:
  • a köpet negativitásának hiánya;
  • ismételt tenyésztés a köpet negativitása után;
  • az AFB mennyiségének hirtelen növekedése a kenetben a kezdeti csökkenés után. Közismert, hogy a tuberkulózisos beteg anyagából különböző gyógyszerérzékenységű Mycobacterium tuberculosis törzseket izolálnak. A törzsek tuberkulózisellenes gyógyszerekkel szembeni érzékenysége a gyógyszerek spektrumában, a rezisztencia kialakulásának mértékében, gyakoriságában és sebességében eltérő lehet.

A Mycobacterium tuberculosis gyógyszerrezisztenciájának mértékét a megállapított kritériumok szerint határozzák meg, amelyek a rezisztencia klinikai jelentőségére összpontosítanak, és a gyógyszer tuberkulózisellenes aktivitásától, farmakokinetikájától, a lézióban lévő koncentrációtól, a maximális terápiás dózistól stb. függenek.

A mikobaktériumok gyógyszerérzékenységének meghatározását jelenleg mikrobiológiai módszerekkel végzik:

• abszolút koncentrációk (hígítási módszer szilárd vagy folyékony táptalajokon),
• arányok,
• ellenállási együttható.

A rezisztencia általában a mycobacterium tuberculosis telepek vizuálisan megfigyelhető növekedésében nyilvánul meg, azonban vannak olyan módszerek, amelyek a mycobacterium sejtosztódásának korai szakaszában színreakciók formájában indukálják a növekedést. Ezek a módszerek 3-4 hétről 2 hétre csökkentik a tesztidőt.

A WHO Kemoterápiás Bizottsága által ajánlott abszolút koncentrációs módszer egységes módszerként elterjedt Oroszországban. Módszertani szempontból a legegyszerűbb, de magas szintű szabványosítást és laboratóriumi eljárások pontosságát igényli. A gyógyszerérzékenységi teszt egy sor kémcsőből áll, amelyek tuberkulózisellenes gyógyszerekkel módosított táptalajt tartalmaznak. A készlet 2-3 kémcsőből áll, amelyekben az egyes használt gyógyszerek különböző koncentrációi vannak, egy kontroll kémcsőből, amelyben a táptalaj nem tartalmazza a gyógyszert, és egy kémcsőből, amely 1000 μg/ml nátrium-szalicilátot vagy 500 μg/ml paranitrobenzoesavat tartalmaz a nem tuberkulózisos mikobaktériumok növekedésének kimutatására.

A táptalajok előkészítéséhez módosított Lowenstein-Jensen táptalajt (keményítő nélkül) használunk, amelyet lombikokba öntünk. Mindegyik lombikba hozzáadunk egy bizonyos térfogatú, megfelelő hígítású tuberkulózisellenes gyógyszert. A lombikok tartalmát alaposan összekeverjük, kémcsövekbe öntjük, és ferde helyzetben 40 percig 85 °C hőmérsékleten koaguláljuk. A táptalaj koagulálása ajánlott automatikus hőmérséklet-szabályozással rendelkező elektromos koagulátorban. Táptalaj tuberkulózisellenes gyógyszerekkel

Az első sor gyógyszerei hűtőszekrényben 2-4 °C-on 1 hónapig, a második sor gyógyszerei legfeljebb 2 hétig tárolhatók. A gyógyszereket tartalmazó táptalajok szobahőmérsékleten történő tárolása elfogadhatatlan. A tuberkulózis elleni gyógyszerek oldatainak elkészítésekor figyelembe veszik azok aktivitását, a koncentráció kiszámításakor figyelembe veszik a gyógyszer nem specifikus részének molekulatömegét, a tisztaságot stb. A gyógyszerérzékenység meghatározásához csak kémiailag tiszta anyagokat használnak.

A módszer alapelve egy tuberkulózis elleni gyógyszer azon koncentrációjának meghatározása, amely a mikobaktérium-populáció jelentős részének növekedését gátolja. Helyes végrehajtás esetén ez a módszer jó megbízhatósággal rendelkezik.

A teszt elvégzése előtt meg kell győződni arról, hogy az izolált Mycobacterium tuberculosis tenyészet nem tartalmaz idegen mikroflórát. A mikobaktérium-tenyészetből 0,9%-os nátrium-klorid-oldatban homogén szuszpenziót készítenek, amely 1 ml-ben 500 millió mikrobiális testet tartalmaz (optikai turbiditási standard 5 egység). A kapott szuszpenziót 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal (1:10) hígítják, és a táptalajkészlet minden kémcsövéhez 0,2 ml szuszpenziót adnak. A beoltott kémcsöveket 37 °C-os termosztátba helyezik, és 2-3 napig vízszintesen tartják, hogy a táptalaj ferde felülete egyenletesen beoltódjon a Mycobacterium tuberculosis szuszpenziójával. Ezután a kémcsöveket függőleges helyzetbe állítják, és 3-4 hétig inkubálják. Az eredményeket 3-4 hét elteltével rögzítik.

Mivel a kórokozó táptalajon lévő klinikai anyagból történő izolálása legalább 1-1,5 hónapig tart, a gyógyszerérzékenység meghatározásának eredményeit ezzel a módszerrel legkorábban 2-2,5 hónappal az anyag bevetése után lehet megkapni. Ez a módszer egyik fő hátránya.

A mikobakteriális gyógyszerérzékenységi vizsgálatok eredményeit bizonyos kritériumok alapján értelmezik. Szilárd táptalajon egy tenyészetet akkor tekintünk érzékenynek a táptalajban lévő gyógyszer koncentrációjára, ha egy adott kémcsőben a gyógyszerrel kinőtt mikobakteriális telepek száma nem haladja meg a 20-at, a gyógyszer nélküli kontroll kémcsőben pedig bőséges növekedés tapasztalható. Csak akkor tekintjük a tenyészetet egy adott koncentrációval szemben rezisztensnek, ha a telepek száma meghaladja a 20-at. A gyakorlatban, amikor a kémcsövekben közel 20 CFU növekedési eredményt kapunk, értesíteni kell a klinikai egységet, hogy az érzékenység vagy rezisztencia ebben az esetben határeset, mivel ez néha magyarázhatja a klinikai indikátorok nem egyértelmű dinamikáját.

Különböző készítmények esetében meghatároznak egy bizonyos koncentrációt, amelynél a mikobaktérium-populáció kritikus hányadának szaporodása megfigyelhető. Ezeket a koncentrációkat „kritikusnak” nevezik. A stabilitás kritériumaként a mikobaktérium-populáció növekedésének mértékét használják egy táptalajon, amelyben a készítmény kritikus koncentrációban van.

A hazai fitiziológiai gyakorlatban a gyógyszerrezisztencia meghatározásakor nem korlátozódnak csak a kritikus koncentrációk meghatározására. Ez annak köszönhető, hogy a kórokozó gyógyszerrezisztenciájának szintjének kibővített meghatározása lehetővé teszi a klinikus számára, hogy helyesebben fogalmazza meg a kemoterápiás taktikát, felhasználva a gyógyszerkombinációk potencírozó hatásának ismeretét, előre jelezze a keresztrezisztenciát, vagy a használt tuberkulózisellenes gyógyszerek csoportjából hatékonyabb gyógyszereket alkalmazzon.

Az abszolút koncentrációs módszer a legegyszerűbb, de egyben a legérzékenyebb a megvalósítása során elkövetett hibákra is. Megbízhatóbb, különösen a másodvonalbeli gyógyszerekkel szembeni érzékenység meghatározásakor, és Oroszországon kívül is elterjedtebb az arányos módszer. Figyelembe veszi az abszolút koncentrációs módszer hiányosságait, de megvalósítása munkaigényesebb.

A módszer nagyon hasonlít az abszolút koncentrációs módszerhez. A gyógyszeres kémcsövek előkészítése megegyezik az abszolút koncentrációs módszerrel. A tuberkulózis mycobacterium szuszpenzió oltóanyag-dózisa azonban 10-szeresére csökken, ami kiküszöböli egyes tuberkulózis mycobacterium törzsek spontán rezisztenciájának gyakoriságát olyan gyógyszerekkel szemben, mint az etambutol, a protionamid, a kapreomicin. Kontrollként 2 vagy 3 kémcsövet használunk, amelyek oltóanyag-dózisa megegyezik a kémcsövekben lévővel, és amelyeket egymás után 10-szeresére, illetve 100-szorosára hígítunk. A rezisztencia kritériuma a tuberkulózis mycobacterium vizuálisan megfigyelt növekedésének aránya. Az első vonalbeli gyógyszerek esetében a rezisztencia kritériuma a kezdeti populáció 1%-ának megfelelő túlzott növekedés, a másodvonalbeli gyógyszerek esetében pedig a kezdeti populáció 1%-ának vagy több mint 10%-ának megfelelő növekedés, a kiválasztott kritikus koncentrációtól függően.

1997-ben a WHO és a Nemzetközi Tuberkulózis Elleni Unió tuberkulózisellenes gyógyszerrezisztencia kimutatásával foglalkozó munkacsoportja módosította ezeket a kritériumokat, és azt javasolta, hogy a sűrű Lowenstein-Jensen tojástáptalajon a következő koncentrációkban növekvő mikobaktériumokat tekintsék rezisztensnek:

• dihidrosztreptomicin - 4 μg/ml;
• izoniazid - 0,2 µg/ml:
• rifampicin - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

2001-ben a következő másodvonalbeli gyógyszerek kritikus koncentrációit javasolták (1%-os kritikus arányban):

• kapreomicin - 40 mcg/ml;
• protionamid - 40 mcg/ml;
• kanamicin - 30 μg/ml;
• viomicin - 30 μg/ml;
• cikloszerin - 40 mcg/ml;
• aminoszalicilsav - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacin - 2 mcg/ml.

A növekedési eredményeket 4 hét elteltével értékelik előzetesen, és 6 hét termesztés után véglegesen.

A modern tuberkulózis kemoterápiában széles körben alkalmazott pirazinamiddal szembeni gyógyszerérzékenység meghatározásához az ajánlott kritikus koncentráció 200 μg/ml. Azonban még mindig nincs általánosan elfogadott módszer a gyógyszerrel szembeni rezisztencia meghatározására szilárd táptalajon, mivel antibakteriális aktivitása csak savas környezetben (pH <6) nyilvánul meg, amelyet technikailag nehéz fenntartani. Ezenkívül a Mycobacterium tuberculosis számos klinikai tenyészete vonakodva növekszik savas környezetű tojásalapú táptalajon.

A mikobaktériumok gyógyszerérzékenységének meghatározásával kapott eredmények minőségének felmérése érdekében ajánlott a Lowenstein-Jensen táptalaj minden új tételét a standard múzeumi H37Rv törzs érzékenységének párhuzamos meghatározásával ellenőrizni. Ezenkívül bizonyos mikrobiológiai kritériumoknak is meg kell felelni, hogy a módszerek jól reprodukálható és helyesen értelmezhető eredményt adjanak. Ezek közé tartozik a tuberkulózis mikobaktérium-tenyészet életképessége, a homogén szuszpenzió és szuszpenzió előállításának szabályai, a tuberkulózis mikobaktérium-tenyészetek kiválasztásának szabályai, valamint a kiválasztott baktériumtömeg reprezentativitása. A gyógyszerrezisztencia meghatározásának megbízhatósága csökken a rendkívül gyenge baktériumkiválasztás esetén.

Az utóbbi időben ígéretesnek bizonyult az automatizált rendszerek segítségével történő gyógyszerérzékenység-meghatározás módszere. Ezen a területen a legfejlettebbek a VASTEC MGIT-960-on alapuló fejlesztések. Ebben az esetben a tuberkulózis mikobaktériumok gyógyszerérzékenységét módosított arányos módszerrel határozzák meg. A meghatározás során összehasonlítják a tuberkulózis mikobaktériumok növekedési ütemét a kontrollcsőben és a gyógyszeres csövekben. A sztreptomicin, izoniazid, rifampicin és etambutol iránti érzékenység meghatározásához a SIRE készletben található dúsító adalékanyagokat és antibiotikumokat használják. A pirazinamid iránti érzékenység meghatározásához a PZA készletet használják. A vizsgálat során a gyógyszeres kémcsöveket tuberkulózis mikobaktériumok szuszpenziójával, valamint a kontrollcsöveket a szuszpenzió 100-szoros hígításával oltják be minden gyógyszer esetében, kivéve a pirazinamidot, ahol a szuszpenzió hígítása 10-szeres. A stabilitás kritériuma a 100 GU mikobaktérium növekedési mutató, amikor a kontrollcsőben a növekedés eléri a 400 GU-t (lásd "Tenyésztési módszerek mikobaktériumok izolálására"). Az eredményeket automatikusan rögzíti és értelmezi a rendszer, és a beírt vagy kiválasztott program állítja be őket.

A folyékony táptalajjal ellátott kémcsőben lévő végső koncentrációkat használják kritikus koncentrációként. Jelenleg mind az első vonalbeli gyógyszerek, mind néhány másodvonalbeli gyógyszer esetében kidolgoztak kritikus koncentrációkat. Meg kell jegyezni, hogy a tuberkulózis mycobacteriumok cikloszerinnel és aminoszalicilsavval szembeni érzékenységének meghatározását csak tojás táptalajokon végzik.

A leírt rendszerrel végzett munka részletes protokollja lehetővé teszi a gyógyszerérzékenységi vizsgálatot mind izolált tenyészeten (sűrű táptalajjal), mind a mikobaktériumok elsődleges tenyészetének felhasználásával MGIT kémcsőben. Ez utóbbi lehetőség jelentősen csökkenti a tenyésztési vizsgálatok elvégzéséhez szükséges időt, lehetővé téve a tuberkulózis mikobaktériumok tenyésztésére vonatkozó teljes eredmény (beleértve a gyógyszerérzékenységre vonatkozó információkat is) az anyaggyűjtéstől számított 3 héten belül történő megszerzését, míg a hagyományos módszer ezt csak a 3. hónapra tudja biztosítani. Az időben érkező eredmények, amikor a beteg a kezelés intenzív szakaszában van, kompenzálhatják a vizsgálatok relatív magas költségeit.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

A mikobaktériumok differenciálódása

Tekintettel arra, hogy a felhasznált táptalajok nem szigorúan szelektívek, az izolált mikobaktériumok későbbi differenciálása kötelezőnek tekinthető. A mikobaktériumok differenciálásának szükségességét a nemzetség képviselői által okozott kóros folyamatok számos jellemzője okozza: a tuberkulózis és a mikobakteriózis eltérő lefolyása és kimenetele, valamint bizonyos tuberkulózisellenes gyógyszerekkel szembeni természetes gyógyszerrezisztencia jelenléte.

Elismert tény, hogy az M. tuberculosis komplex mikobaktériumainak nem tuberkulózisos mikobaktériumokból való elsődleges azonosítását a következő jellemzők alapján végzik: növekedési sebesség sűrű táptalajon, pigmentképződés, telepmorfológia, savrezisztencia megléte és a növekedéshez optimális hőmérséklet.

Sajnos nincs egyetlen laboratóriumi módszer, amely megbízhatóan megkülönböztetné az M. tuberculosis komplex mikobaktériumait más saválló mikobaktériumoktól; azonban a fent leírt jelek és az alábbiakban bemutatott számos biokémiai vizsgálat eredményeinek kombinációja lehetővé teszi az M. tuberculosis komplex mikobaktériumainak azonosítását akár 95%-os valószínűséggel.

Az M. tuberculosis komplex mikobaktériumainak (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii és mások) a lassan növekvő, nem tuberkulózisos mikobaktériumoktól való elkülönítésére alapvető biokémiai vizsgálatokat alkalmaznak a következő tünetek kimutatására:

• nikotinsav termelésének képessége (niacinteszt):
• nitrát-reduktáz aktivitás;
• termostabil kataláz;
• nátrium-szalicilátot (1 mg/ml) tartalmazó táptalajon történő növesztés.

Kiegészítő tesztként 500 μg/ml para-nitrobenzoesavat vagy 5%-os nátrium-kloridot tartalmazó táptalajon végzett növekedési tesztek is alkalmazhatók.

Sok bakteriológiai laboratórium csak komplex szinten azonosítja ezeket a mikroorganizmusokat, ami a laboratóriumok korlátozott képességeinek és a szakemberek módszertani képességeinek köszönhető.

A gyakorlatban a legtöbb esetben a következő tesztek elegendőek az M. tuberculosis és az M. bovis elkülönítéséhez: niacin, nitrát-reduktáz, pirazinamidáz, valamint növekedés regisztrációja 2 μg/ml tiofén-2-karbonsav-hidrazidot tartalmazó táptalajon. Figyelembe veszik, hogy az M. tuberculosis komplex mikobaktériumait a következő jellemzők jellemzik:

• lassú növekedés (több mint 3 hét);
• növekedési hőmérséklet 35-37 ^° C-on belül;
• pigmentáció hiánya (elefántcsont színű);
• kifejezett saválló elszíneződés;
• pozitív niacin teszt;
• pozitív nitrát-reduktáz teszt;
• termostabil kataláz hiánya (68 ^° C).
• növekedés hiánya Lowenstein-Jensen táptalajon, amely a következőket tartalmazza:
  • 1000 µg/ml nátrium-szalicilsav,
  • 500 mcg/ml para-nitrobenzoesav,
  • 5%-os nátrium-klorid:
• növekedés 1-5 μg/ml tiofén-2-karbonsav jelenlétében.

Az izolált mikobaktériumok differenciálásának jelentősége jelentősen megnő a tuberkulózissal vagy mikobakteriózissal összefüggő HIV/AIDS esetek regisztrációs gyakoriságának növekedésével. Jelenleg nincs abszolút bizonyosság a gyakorlati regionális laboratóriumok felkészültségét illetően ekkora munkamennyiség helyes elvégzésére.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

A tuberkulózis immunológiai diagnosztikája

Számos univerzális jelenség, készítmény és immunológiai teszt létezik, amelyeket eredetileg kifejezetten a tuberkulózisban vagy a mikobaktériumokra adott immunválasz modelljében fedeztek fel. Ilyenek például a BCG és a tuberkulin, olyan jelenségek, mint a bőr DST (tuberkulin tesztek - Pirquet és Mantoux reakciók), a tuberkulin szubkután beadására adott reakció szenzibilizált állatokban (Koch-jelenség). A fertőző betegségekben előforduló első antitestek némelyikét is a tuberkulózisban fedezték fel. Természetesen minél mélyebb a tuberkulózis elleni immunitás mechanizmusainak és genetikai kontrolljának megértése, annál szélesebb körben alkalmazhatók az immunitást befolyásoló immunológiai módszerek és készítmények a gyógyászat gyakorlati problémáinak megoldására.

Jelenleg a legfontosabb és legösszetettebb gyakorlati problémának a tuberkulózis kimutatását tekintik a lakosság tömeges szűrésének folyamatában. Azonban a számos „sikerjelentés” ellenére (korlátozott anyagon) nem létezik erre a célra alkalmas immunológiai módszer („bármely kézben reprodukálható”) vagy gyógyszer.

Az immunológiai módszereket, különösen a szerológiai vizsgálatokat (antigének, antitestek meghatározása) és a tuberkulin provokációs teszteket széles körben alkalmazzák a klinikai gyakorlatban.

A differenciáldiagnosztikában alkalmazott immunológiai vizsgálatok között az első helyen állnak a szerológiai módszerek, amelyek az antigéneket és antitesteket határozzák meg a test különböző környezeteiben.

A mycobacteriumok tuberculosis elleni antitestek meghatározásának specificitása az immunanalízisben használt antigénektől függ. Jelentős számú antigént javasoltak, amelyek közül az első a tuberkulin PPD:

• PPD és egyéb komplex készítmények táptalajból;
• ultrahangos szétesést elősegítő szer;
• Triton kivonat és más komplex sejtfalkészítmények;
• 5-antigén (Daniel);
• 60-antigén (Coccito);
• lipoarabinomannán;
• kordfaktor (trehalóz-6,6-di-mikolát);
• fenolos és egyéb glikolipidek;
• lipopoliszacharidok;
• fibronektin-kötő antigén;
• fehérjék (leggyakrabban rekombináns); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15, 12 KDA stb.

Orosz és külföldi tudósok sokéves kutatásának eredményeként azonosították az antitestképződés fő mintázatait és a tuberkulózis szerológiai diagnosztikájának hatékonyságát: minél összetettebb az antigén, annál nagyobb az érzékenység és annál alacsonyabb a tesztek specificitása. A specificitás országonként változik a populáció M. tuberculosis és nem tuberkulózisos mikobaktériumokkal való fertőzöttségétől, a BCG oltástól stb. függően. Gyermekeknél a szerodiagnosztika informatív értéke alacsonyabb, mint felnőtteknél. Primer tuberkulózisban (gyakrabban gyermekeknél) az IgM meghatározása informatívabb; másodlagos tuberkulózisban az IgG. HIV-fertőzött embereknél a szerodiagnosztika informatív értéke az antitestek meghatározásában csökken. Az antitestmeghatározás hatékonysága számos "klinikai pillanattól" függ: a folyamat aktivitásától (a mikobaktériumok "izolálásának" jelenléte vagy hiánya, a szuvas üregek jelenléte, az infiltráció mértéke), a folyamat prevalenciájától, lefolyásának időtartamától.

Az enzim immunvizsgálati (EIA) módszer érzékenysége körülbelül 70%. A vizsgálat elégtelen hatékonysága az alacsony specificitásnak köszönhető. Korábban a szerológiai szűrés alkalmazásának lehetőségeit vizsgálták a magas kockázatú csoportokban, különösen a tuberkulózis utáni tüdőelváltozásokkal rendelkezők körében.

Az ELISA specificitásának növelése érdekében specifikusabb antigéneket keresnek, beleértve a géntechnológiával előállítottakat is: ESAT-6 stb. (lásd fent). A szigorúan specifikus antigének (38 kDa, ESAT) használata növeli a specificitást, de jelentősen csökkenti az elemzés érzékenységét. Az ELISA (kísérleti laboratóriumi tesztrendszerek, például a Pathozyme ELISA készlet) mellett laterális szűréssel ellátott immunkromatográfiás készleteket (Mycodot) is kínálnak, valamint más hasonló teszteket (membránpont-analízis) a teszt eredményének vizuális értékelésével. Ezen tesztek elvégzése során az elemzés 10-30 percet vesz igénybe; nem igényelnek speciális felszerelést, az eredmények vizuális értékelését igénylik, ami bizonyos szubjektivitással jár. Ezek a módszerek megközelítőleg ugyanolyan érzékenységi és specificitási jellemzőkkel rendelkeznek (70%, illetve 90-93%), mint a hagyományos ELISA.

Az immunanalízis módszerek alkalmazása bizonyos értékkel bír, mint kiegészítő módszer, amelyet a tuberkulózis differenciáldiagnózisában alkalmazott módszerek komplexumában figyelembe vesznek, különösen az extrapulmonális formáinak diagnosztizálásában. Az ELISA módszer a leghatékonyabb a tuberkulózisos agyhártyagyulladás diagnosztizálásában, az agy-gerincvelői folyadék vizsgálatakor. Ebben az esetben az elemzés érzékenysége 80-85%, a specificitása pedig 97-98%. Vannak információk a Mycobacterium tuberculosis elleni antitestek könnyfolyadékban történő meghatározásának hatékonyságáról a tuberkulózisos uveitis diagnózisában.

Gamma-interferon szintézis indukciója in vitro

A gamma-interferon (IFN-γ) egy specifikus immunvédő tényező, amely a makrofágok enzimrendszereinek aktiválásával valósul meg. Az IFN-γ szintézisének indukcióját a szenzibilizált T-limfociták a mikobakteriális antigénekkel való kölcsönhatásuk okozza.

Antigénként mind a tuberkulin PPD-t, mind a géntechnológiával módosított specifikus antigéneket használják, különösen az ESAT-6 antigént (korai szekretált antigén, 6 kDa molekulatömeggel) és a CFP-10-et (tenyészet szűrletfehérje, 10 kDa). A géntechnológiával módosított vagy rekombináns antigének hiányoznak a BCG vakcina és más mikobaktériumok sejtjeiben. Tuberkulin alkalmazása esetén az IFN-γ indukciós teszt eredményei összehasonlíthatók a tuberkulin bőrpróba eredményeivel (közvetlen korreláció). Géntechnológiával módosított antigének alkalmazása esetén a teszteredmények specifikusabbak, és nem függenek a korábbi BCG oltástól. A tuberkulózis fertőzéssel nem érintkezett oltott egyének vizsgálatakor a teszt specificitása 99%. A teszt érzékenysége a tuberkulózisos betegek körében 81-89% között mozog.

Olyan teszteket és diagnosztikai módszereket fejlesztettek ki, amelyek a tuberkulózis mycobacterium antigénekkel in vitro teljes vérsejtek vagy vérből izolált mononukleáris sejtek rövid távú tenyésztésén alapulnak, majd az IFN-γ koncentrációjának meghatározását vagy az IFN-γ-t szintetizáló T-limfociták számának megszámlálását követik. A kémcsőben szintetizált interferon koncentrációját ELISA-val határozzák meg, IFN-γ-t kötő monoklonális antitestek felhasználásával. Ezután a standard IFN-γ kalibrálásával meghatározzák annak koncentrációját a kémcsőben vagy a lemez kutacskáiban.

Az Elispot-tesztben az IFN-γ-t szintetizáló T-sejtek számát egy IFN-γ elleni antitestekkel bevont edény felületén számolják.

Az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatala (FDA) által jóváhagyott in vitro IFN-γ indukciós diagnosztika fejlesztői azt állítják, hogy a teszt nem képes megkülönböztetni a látens tuberkulózisfertőzést az aktív tuberkulózistól. Ezért a magas fertőzési arányú régiókban a tesztnek nincs közvetlen diagnosztikai értéke. Hazánkban azonban felhasználható a gyermekek tuberkulózisfertőzésének megkülönböztetésére az oltás utáni allergiától, valamint a specifikus immunitás szintjének felmérésére a kezelés során.

Jelenleg egy hazai tesztrendszert vizsgálnak, amely specifikus tuberkulózis antigének által indukált IFN-γ szintézis meghatározására szolgál in vitro.

A tuberkulózis immunállapota és lefolyása, immunkorrekció

A tuberkulózis kezelése során az emberekben változások következnek be az antigénszintben és az immunrendszer állapotában.

A váladékokban és szövetekben bekövetkező változásokra vonatkozó adatok nagyrészt ellentmondásosak. Az egyetlen dolog, amit teljes mértékben indokoltnak lehet nevezni, hogy a tuberkulózisos granulómák általában jelentős számú aktivált T-limfocitát tartalmaznak.

Érdemes még két olyan ponton elmélkedni, amelyek szükségesek az immunológiai mechanizmusok szerepének megértéséhez az emberek tuberkulózisának kezelésében:

• Az AIDS-betegeknél különösen magas a többszörös gyógyszerrezisztencia kialakulásának előfordulása;
• Többszörös gyógyszerrezisztencia esetén (és HIV-fertőzés hiányában) az immunrendszeri rendellenességek (elsősorban a T-sejtes immunitás) különösen jelentősek.

A tuberkulózisban az immunkorrekció különböző módszereit széles körben alkalmazzák: mindenekelőtt olyan gyógyszerek, amelyek főként a T-sejtes immunitásra és a mononukleáris fagocita rendszerre (csecérmirigy hormonok, izofon, licopid, polioxidónium stb.) hatnak, valamint egész (gyengített) mikobaktériumokra és azok összetevőire.

A tuberkulózis molekuláris biológiai diagnosztikája

A fertőző betegségek diagnosztikájában alkalmazott molekuláris biológiai módszerek főként a bakteriális és vírusos kórokozók genomiális anyagainak manipulációján alapuló módszereket foglalják magukban, amelyek célja specifikus genetikai anyag - egy adott kórokozófajra vagy -törzsre specifikus nukleotidszekvenciájú DNS-szakaszok - azonosítása, a kórokozó bizonyos gyógyszerekre való érzékenységét meghatározó gének specifikus DNS-szekvenciáinak elemzése, valamint a kórokozó egyes génjeinek funkcionális aktivitásának elemzése. A molekuláris biológiai módszerek széles körben elterjedtek a tudományos kutatásban és a gyakorlati alkalmazásban a különféle bakteriális és vírusos fertőzések diagnosztikájában és monitorozásában, miután Carrie Mullis (Nobel-díjas, 1989) 1985-ben felfedezte a polimeráz láncreakciót.

A polimeráz láncreakció módszerének alapelvei és képességei

A PCR lehetővé teszi egy nukleotidszekvencia (a kórokozó DNS-fragmentumának) több milliószoros amplifikációját (sokszorozását) egy kémcsőben néhány óra alatt. A reakció egyetlen DNS-lánc jelenlétében történő végrehajtása meghatározza az analízis kivételesen magas érzékenységét.

A DNS-lánc egyes szakaszainak nukleotidszekvenciája határozza meg a mikroorganizmus genetikai egyediségét, ami magyarázza a PCR magas specificitását.

Ennek a módszernek a jelentősége a Mycobacterium tuberculosis jellemzőinek kimutatásában és tanulmányozásában a mikroorganizmus biológiai jellemzőinek köszönhető, amelyek nagyon lassú növekedésűek: a Mycobacterium tuberculosis DNS-ének megduplázódási ideje a tenyésztésük során 12-24 óra.

A PCR módszer alapelve az amplifikáció - egy adott DNS-szekvencia szakaszainak többszörös, milliószoros szorzása egy kémcső mikrotérfogatában a következő három reakciólépés ciklikus ismétlésével, amelyek mindegyike eltérő hőmérsékleti körülmények között zajlik:

• I. szakasz - a kettős szálú DNS denaturálódása melegítés közben, láncainak divergenciájával;
• II. szakasz - a primerek (priming oligonukleotidok) komplementer kötődése (hibridizációja) egy szigorúan specifikus, amplifikációra kiválasztott DNS-fragmentum láncainak végszakaszaival;
• III. szakasz – a DNS-fragmentumlánc befejezése termostabil DNS-polimeráz segítségével.

Az amplifikációhoz a kémcsőnek mátrix DNS molekulákat kell tartalmaznia. Négyféle dezoxinukleozid-trifoszfát (nukleotid), amelyek a megfelelő nitrogénbázisokat tartalmazzák: adenin (A), timin (T), guanin (G), citozin (C); mesterségesen szintetizált, 18-20 bázispárból álló primer oligonukleotidok (primerek); egy termostabil enzim, a DNS-polimeráz, amelynek hőmérsékleti optimuma 68-72 ^° C, és magnéziumionok.

A PCR specificitása a DNS-fragmentum megválasztásától függ. Ennek megfelelően szintetizálódnak a szegélyező primer oligonukleotidok. A hibridizáció és a DNS-lánc befejeződésének specificitása a következő nitrogénbázis-párok komplementaritásán alapul: adenin-timin, guanin-citozin.

A tuberkulózis komplex mikobaktériumok genomjának meghatározásához a legtöbb tesztrendszerben a leghatékonyabb amplifikációs célpont az IS6110 DNS-fragmentum, amely a legtöbb tuberkulózis mikobaktérium törzsben jelentős számú (10-20) ismétlődést tartalmaz a genomban, ami a specificitás mellett az elemzés magas érzékenységét is biztosítja. Ugyanakkor leírtak már kis számú ismétlődést tartalmazó vagy az IS6110 fragmens hiányában is tuberkulózis mikobaktérium törzseket.

DNS-molekulák kivonása biológiai mintából

A PCR elvégzéséhez a kórokozó DNS-molekuláit minimális térfogatban kell izolálni a biológiai anyagból, minimális mennyiségű nem specifikus DNS-sel és az enzim - DNS-polimeráz - különböző inhibitoraival.

A minta-előkészítést olyan körülmények között kell végezni, amelyek megakadályozzák a vizsgált minták izolált DNS-molekulákkal való keresztszennyeződését. Ehhez a helyiséget ultraibolya fénnyel, az asztalok és eszközök padlóját és munkafelületeit klórtartalmú oldatokkal kell előzetesen kezelni. Szükséges továbbá tiszta kesztyűk, eldobható kémcsövek és automata pipetták hegyének használata is.

A Mycobacterium tuberculosis DNS-ének izolálásához olyan klinikai mintákból (agy-gerincvelői folyadék, hörgőmosás), amelyek nem tartalmaznak nagyszámú leukocitát, sejttörmeléket vagy sókat, elegendő a mintát percenként 3-4 ezer fordulattal centrifugálni, az üledékhez 20-30 µl 2%-os Triton X-100 oldatot adni, és 30 percig 90 ^{° C-on melegíteni.}

A köpetminta-előkészítés hatékony cseppfolyósítást igényel, jellemzően 4%-os nátrium-hidroxidot és N-acetil-L-ciszteint (NALC) használva, mintánként 50-80 mg mennyiségben, a minta viszkozitásától függően. A NALC-oldatot ex tempore kell elkészíteni, vagy a NALC-por szárazon, közvetlenül a mintához adagolható. A cseppfolyósítás után a mintákat 15 percig 3500-4000 fordulat/perc sebességgel (3000 g) kell centrifugálni 50 ml-es csavaros tetejű kémcsövekben, azaz a köpetkultúra előtti előkészítéséhez ajánlott körülmények között.

A DNS üledékből történő kinyerésére leggyakrabban egy olyan módszert alkalmaznak, amely 5-6 mólos guanidin-izotiocianát oldatot használ lizálószerként, valamint mikroporózus szilícium-oxid részecskéket ("diatómaföldet"), amelyek adszorbeálják a DNS-molekulákat. A nem specifikus anyagokat, beleértve az esetleges inhibitorokat is, ezután 2,5 mólos guanidin-izotiocianát oldatban és etanolos oldatban mossák, majd a DNS-molekulákat vízben deszorbeálják, és ezeket a mintákat használják PCR-re. A DNS-kivonás technológiájának egyszerűsítése érdekében a "diatómaföldet" gyakran szilícium-oxiddal bevont mágneses mikrorészecskékkel helyettesítik. Ebben az esetben a mikrotubusokhoz speciális mágneses állványt használnak a részecskék kicsapására centrifugálás helyett.

Oroszországban kidolgoztak egy eredeti módszert a mikobaktériumok immunmágneses elválasztására, amelyből a kórokozó DNS-t kivonják. A tuberkulózis mikobaktériumok immunmágneses elválasztásához 3-5 μm méretű, szilícium-oxiddal bevont ferrorészecskéket használnak, amelyekhez kémiai kötéssel kapcsolódnak a tuberkulózis mikobaktériumok elleni poliklonális (nyúl) antitestek. A lúgos lízis utáni köpetmintákat savas Tris-HCl oldattal semlegesítik, és immunmágneses szorbenssel inkubálják. Ezután az immunferrorészecskéket cserélhető hegyű mágneses rúddal összegyűjtik, mikrotubusba helyezik és kicsapják. 20-30 μl 2%-os Triton X-100 oldatot adnak hozzá, és 30 percig 90 ^° C-on melegítik. A felülúszót DNS-mátrixként használják a PCR-analízishez.

Nehéz probléma a tuberkulózis mycobacterium DNS kivonása biopsziás mintákból. A biopsziás lízishez a proteináz K enzimet használják 200-500 mg/l végkoncentrációban, 56 ^° C hőmérsékleten, egy éjszakán át. Ezután az ismert módszerek egyikével extrahálják. A biopsziás minták PCR-analízise során a feleslegben lévő nem specifikus DNS gyakran a reakció gátlását okozza, ami ismételt DNS-kivonást igényel.

Eredményérzékelési módszerek

A reakció befejeződése után a kórokozó DNS amplifikált fragmenseit különböző módszerekkel azonosítják.

A gélelektroforézis módszere jól ismert. Ebben az esetben a kapott DNS-fragmentumot a kívánt specifikus DNS-fragmentumot tartalmazó pozitív kontroll, vagy a fragmens korábban ismert mérete (nukleotidpárok száma) alapján azonosítják, amelyet standard molekuláris markerrel határoznak meg.

Egy specifikus festék - etídium-bromid - jelenlétében, amely a kettős szálú DNS-ben található, a szintetizált DNS-fragmentum ultraibolya fény hatására világító sávként jelenik meg.

A DNS-fragmentum méretének, amelyet az indulástól megtett távolság alapján elektroforézissel határoznak meg, meg kell felelnie egy ismert molekulatömeg-markernek vagy pozitív kontrollnak.

A PCR-eredmények meghatározásának egyéb módszerei az egyszálú PCR-termékek komplementer oligonukleotiddal - biotinnal jelölt DNS-próbával - történő hibridizációján alapulnak, majd enzimatikus reakcióval történő detektáláson, például egy streptavidin-alkalikus foszfatáz konjugátum biotinhoz való kötődésével.

Az ilyen típusú detektálás alapján PCR-analizátorokat hoztak létre, amelyekben a PCR-eredmények detektálása automatikusan történik a minták optikai sűrűségének leolvasásával az enzimatikus reakció lezajlása után.

Ezen módszerek hátrányai közé tartozik a laboratóriumon belüli szennyeződés lehetősége viszonylag rövid DNS-molekula-fragmentumokkal. Amikor ezek a molekulák újonnan vizsgált mintákba kerülnek, PCR-mátrixként működnek, és álpozitív eredményekhez vezetnek.

E tekintetben a téves pozitív eredmények elkerülése érdekében szigorú szabályokat vezettek be a helyiségek elkülönítésére és izolálására: biológiai mintákból történő DNS-kivonásra szolgáló helyiségek; eredmények detektálására (elektroforézis) szolgáló helyiségek a tiszta zónától. Ezek a helyiségek a valószínűsíthető szennyeződés zónáját jelentik. Egy másik izolált zóna egy tiszta helyiség, ahol a vizsgált DNS-mintákat a PCR reakcióelegyet tartalmazó kémcsövekbe juttatják. Végül pedig feltételezik, hogy a fő eszközt - a DNS-erősítőt - egy külön, esetleg irodai helyiségbe kell kivinni.

A korábbi reakciók termékeivel - amplikonokkal - történő szennyeződés elkerülése érdekében egyes PCR tesztrendszerek dezoxinukleozid uridint tartalmaznak a dezoxinukleozid timidin helyett, amelyet az in vitro láncszintézis során a megfelelő pozícióba építenek be, azaz a natív DNS-ben jelen lévő nitrogéntartalmú timint uracil helyettesíti. Az elemzett anyag reakcióelegyéhez adott uracil DNS-glikoziláz csak a dezoxiuridinnal szennyező fragmenseket bontja le, a dezoxitimidint tartalmazó natív elemzett DNS-t nem. A későbbi 94 ^° C-on történő melegítés inaktiválja ezt az enzimet, és nem zavarja a PCR-ben az amplifikációt.

Létezik egy tesztrendszer, amely az rRNS izotermikus amplifikációján alapul, amelyhez először DNS-molekulák reverz transzkripcióját és szintézisét végzik el, amelyek viszont mátrixként szolgálnak az RNS-molekulák későbbi szintéziséhez. Az RNS-amplikonokat akridinnal festett DNS-próbával detektálják egy reakciócső oldatban történő hibridizáció során. Ennek a módszernek a nagy érzékenység mellett az az előnye is, hogy az analízist egyetlen csőben végzi, ami megakadályozza a szennyeződést. A szerzők szerint a módszer érzékenysége légúti mintákban eléri a 90%-ot, specificitása pedig 99-100%.

Új kimutatási módszereket vezettek be a valós idejű PCR-ben. Ezek a módszerek elsősorban abban különböznek, hogy a PCR-t és az eredmények kimutatását egyidejűleg, egyetlen zárt kémcsőben végzik. Ez nemcsak technológiailag egyszerűsíti az elemzési módszert, hanem megakadályozza a laboratóriumi helyiségek és a minták szennyeződését a korábbi PCR-termékekkel is.

A valós idejű PCR-ben az eredményeket egy fluorogén DNS-próba és egy PCR során amplifikált specifikus DNS-fragmentum hibridizációjából származó fluoreszcencia alapján detektálják. A fluorogén DNS-próbák szerkezete úgy van felépítve, hogy a fluoreszcens marker enzimatikus reakció eredményeként szabadul fel, vagy csak a PCR során amplifikált kívánt DNS-molekulával történő specifikus hibridizáció esetén távolodik el a fluoreszcencia-kioltó molekulától. Ahogy a próbával hibridizálódott molekulák száma növekszik, a fluoreszcencia kimutatható szintre történő növekedése arányos az amplifikált termék molekuláinak számával. Mivel a DNS-fragmentum molekulák száma minden PCR-ciklus során megduplázódik, a ciklusszám, amelytől a fluoreszcenciát detektálják és növelik, fordítottan arányos az eredeti mintában lévő DNS-molekulák számával. Ha a tuberkulózis mycobacterium DNS megfelelő fragmensének több különböző ismert koncentrációjú molekuláját vezetik be a reakcióba kalibrátorként, akkor a vizsgált anyagban lévő DNS-genomok száma számítógépes programmal kiszámítható.

Minden standard mintát megkettőznek. A mennyiségi kritérium a kimutatható fluoreszcencia kialakulásához és növekedéséhez szükséges minimális PCR-ciklusok száma. Az abszcissza tengely a ciklusok számát; az ordináta tengely a fluoreszcencia értékét jelöli. A DNS-koncentrációk fordítottan arányosak a fluoreszcencia megjelenéséhez szükséges ciklusok számával. A jobb oldali oszlopban lévő ablakok (21-32) a megfelelő koncentrációkhoz tartozó ciklusszámokat mutatják. A DNS-fragmensek 10-szeres koncentrációi (102-106 ml) közötti különbség ^3,2-3,4 ciklus ^. Két beteg esetében az IS6110 fragmensek koncentrációja körülbelül 103/ml és 104/ml volt ^. Figyelembe ^véve az elemzett fragmensek ismétlődéseinek számát (6-20) a Mycobacterium tuberculosis genomjában, a Mycobacterium tuberculosis száma a klinikai mintákban körülbelül 100, illetve 1000 sejt.

PCR alkalmazása a tuberkulózis diagnosztizálásában

A PCR módszert a legszélesebb körben alkalmazzák a tuberkulózis gyors diagnosztizálására - a Mycobacterium tuberculosis kimutatására klinikai mintákban: köpet, hörgőmosás, pleurális váladék, vizelet, agy-gerincvelői folyadék, osteolízis punkciók, női nemi szervek aspirátumai és különféle biopsziák. Egy hollandiai vizsgálatban, amely 340, igazoltan tüdőtuberkulózis diagnózisával rendelkező betegtől származó, körülbelül 500 köpet- és hörgőmosás-mintát vizsgált, a PCR, a tenyésztési és a kenetmikroszkópos módszerek összehasonlító érzékenységét vizsgálták. Az elemzés érzékenysége 92,6%, 88,9% és 52,4% volt. Az összes módszer specificitása körülbelül 99% volt.

Összehasonlították a Mycobacterium tuberculosis kimutatásának hatékonyságát kenetmikroszkópiával, Lowenstein-Jensen táptalajon történő vetésalakítással, VASTES tesztrendszerrel és PCR analízissel. A PCR érzékenysége 74,4%, a mikroszkópia érzékenysége 33,8%, a szilárd táptalajon történő vetésé 48,9%, a VASTES pedig 55,8%. A Lowenstein-Jensen táptalajon történő vetés átlagos kimutatási ideje 24 nap, a VASTES érzékenysége 13 nap, a PCR érzékenysége 1 nap.

A PCR, mint a tuberkulózis-kezelés hatékonyságának monitorozására szolgáló érzékeny és gyors módszer alkalmazásának lehetőségét is tárgyaljuk.

A Mycobacterium tuberculosis DNS PCR módszerrel történő kimutatása hatékony kemoterápiával hosszabb idő alatt történik - átlagosan 1,7 hónap a fluoreszcens mikroszkóppal meghatározott bakteriális kiválasztáshoz képest, és 2,5 hónap a bakteriológiai vizsgálathoz képest.

A tuberkulózis extrapulmonális formáinak diagnózisa

A PCR, mint érzékeny módszer fontossága különösen nagy az extrapulmonális formák esetében, mivel pontosan ezekben a formákban a klinikai és radiológiai módszerek, valamint a hagyományos bakteriológiai módszerek a Mycobacterium tuberculosis diagnosztikai anyagokban történő meghatározására hatástalanok.

A vizeletminták vizsgálatakor a PCR-analízis eredménye 17 aktív húgyúti tuberkulózisban szenvedő beteg közül 16-nál pozitívnak bizonyult, míg 4 inaktív vesetuberkulózisban szenvedő betegnél és 39 nem tuberkulózisos húgyúti betegségben szenvedő betegnél negatívnak bizonyult.

Bemutatták a PCR-analízis hatékonyságát ismeretlen eredetű lázas, tuberkulózis gyanújával kezelt betegek csontvelő-aspirátumainak vizsgálatában. A tuberkulózisos nyirokcsomó-gyulladás diagnosztizálásához gyermekeknél 67 tuberkulózis gyanújával kezelt gyermek 102 punkciós aspirátumát és biopsziás mintáját vizsgálták. Pozitív eredményeket kaptak: valós idejű PCR - 71,6%, fluoreszcens mikroszkópia - 46,3%, tenyésztési vizsgálat - 41,8%. A macskakarmolásos betegségben szenvedő betegek 50 nyirokcsomó-biopsziájának vizsgálatakor minden eredmény negatív volt. Így a PCR-analízis 100%-os specificitását igazolták. Ugyanebben a munkában kimutatták az M. avium kimutatásának lehetőségét a nyirokcsomók punkciós biopsziájában.

A női nemi szervek tuberkulózisának diagnosztizálása meddőségben az egyik legnehezebb diagnosztikai probléma. A laparoszkóposan tuberkulózis gyanújával vizsgált 25 beteg közül 14-nél (56%) pozitív eredményt kaptak az endometrium biopsziák, az endometrium aspirátumok és a Douglas-tasak folyadék minták PCR-vizsgálatai. A kenetmikroszkópia és a tenyésztési vizsgálatok 1, illetve 2 pozitív eredményt adtak. Ezek az esetek PCR-pozitívak is voltak. A PCR-pozitív eredmények többsége a szövettani vizsgálat szerint a tuberkulózis jellegzetes jegyeit mutató esetekben volt megfigyelhető; kisebb számban a laparoszkópia szerint tuberkulózis gyanújával diagnosztizált esetekben. Csak egy pozitív PCR-eredményt kaptunk laparoszkópos tuberkulózis adatok hiányában.

A tuberkulózis extrapulmonális formáinak diagnosztizálásakor a klinikusoknak gyakran felmerül a kérdés, hogy a PCR-módszerrel végzett vérminták vizsgálatakor azonosítható-e a kórokozó. Az irodalmi adatok azt mutatják, hogy a Mycobacterium tuberculosis DNS kimutatása vérmintákból a HIV-fertőzés előrehaladott formáiban is lehetséges. A Mycobacterium tuberculosis DNS-t csak transzplantált vese és immunszuppresszióban szenvedő betegek különböző szerveinek generalizált tuberkulózisában mutatták ki.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

A mikobaktériumok fajainak azonosítása

A PCR módszer igen hatékony lehet a tuberkulózis komplex mikobaktériumainak és bizonyos nem tuberkulózisos mikobaktériumtípusok gyors azonosítására az elsődleges növekedésük elérése után. Ebben az esetben a PCR alkalmazása 7-10 napot takaríthat meg, amely a pozitív eredmény későbbi tenyésztéses azonosításához szükséges. A PCR vizsgálat technikailag nagyon egyszerű, mivel nem igényel komplex klinikai anyag-előkészítést a nagy érzékenység eléréséhez. Egy ilyen tesztrendszerben (MB BacT. by Organon) 80 pozitív tenyészet vizsgálatakor minden pozitív PCR analízis eredmény szigorúan specifikus volt, és 1 napon belül elvégezték. Más típusú mikobaktériumok tenyészetben történő azonosításához a kórokozó DNS-t akridinnel jelölt specifikus DNS-próbákkal hibridizálják, és a törzseket kemilumineszcencia megjelenésével detektálják kemilumineszcencia segítségével kemilumineszcencia-mérővel vagy nitrocellulóz csíkokon, hibridizáció utáni vizuális értékeléssel. Ez a készlet korlátozott számú fajt azonosít: Mycobacterium tuberculosis komplex, M. avium, M. avium komplex, M. kansasii és M. gordonae.

A. Telenti és munkatársai egy viszonylag egyszerű és olcsó módszert fejlesztettek ki klinikailag fontos mikobaktériumok fajainak azonosítására PCR-en és két restrikciós enzimmel (olyan enzimek, amelyek képesek egy DNS-molekulát meghatározott pontokon elvágni) történő kezelésen alapulva. Ebben az esetben egy hősokkfehérjét (65 kDa) kódoló DNS-fragmentumot amplifikálnak, majd a PCR-rel kapott, 439 nukleotidpár méretű DNS-fragmentumot külön-külön két enzimmel - Bste II-vel és Nae III-mal - kezelik. Ezután agaróz gélelektroforézissel elemzik a két kapott terméket, méretüket (nukleotidpárok száma) meghatározva standard DNS-fragmentumok (molekuláris DNS-markerek) segítségével, 100-1000 nukleotidpár hosszúságban. A meghatározott fajok mindegyikében (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum) minden restrikciós enzimhez 2 vagy 3 különböző méretű DNS-fragmentum található. A kapott különböző méretű DNS-fragmentumok kombinációja lehetővé teszi ezen fajok megkülönböztetését egymástól.

Egy biológiai DNS-mikrochip technológiát fejlesztenek, amely egyetlen vizsgálatban több mint 100 mikobaktériumfaj azonosítását segíti elő.

A fajok azonosítása a 16S rRNA variábilis régiójának PCR-amplifikációjával is elvégezhető, majd az amplikonok szekvenálásával összehasonlítva a megfelelő elsődleges szerkezettel, ami lehetővé teszi több mint 40 mikobaktériumfaj azonosítását.

A PCR a tuberculosis mycobacterium komplexen belüli fajok azonosítására is használható, beleértve az M. bovis és az M. bovis BCG közötti megkülönböztetést. Ezt bizonyos gének jelenlétének vagy hiányának elemzésével végzik az RD1, RD9 és RD10 genomiális régiókban. Az RD1 hiányzik az M. bovis BCG-ből, de jelen van a virulens fajokban, beleértve az M. bovist is.

Mycobacterium tuberculosis gyógyszerérzékenységének meghatározása PCR-rel

A Mycobacterium tuberculosis gyógyszerérzékenységének vagy rezisztenciájának meghatározására szolgáló molekuláris genetikai módszerek feladatai az ismert gének bizonyos nukleotidszekvenciáiban mutációk azonosítására redukálódnak. A fő módszerek vagy ezen szekvenciák közvetlen leolvasásán (szekvenálásán) alapulnak amplifikáció után, vagy a PCR során amplifikált biotinnal jelölt DNS-fragmensek hibridizációján DNS-próbákkal. Mindkét lehetőség magában foglalja a nukleotidszekvenciákban lévő szubsztitúciók azonosítását, amelyek DNS-próbák használatakor a nitrocellulóz membránon történő hibridizáció hiányához vagy hiányoshoz vezetnek egy enzimkonjugátum (sztreptavidin-alkalikus foszfatáz) segítségével - a LIPA-Rif-TB módszerrel.

A PCR-rel amplifikált, gyógyszerérzékenységért vagy -rezisztenciáért felelős génrégiók ismert mutációival komplementer mikrorégiókon lokálisan rögzített DNS-próbákban történő fluoreszcencia mérésének módszerét mikrobiochip-módszernek nevezik. A vizsgálat elvégzésének alapvető algoritmusa a következő. Miután a DNS-t izolálták egy klinikai mintából vagy mikobakteriális tenyészetből, PCR-t kell végezni a rifampicinnel szembeni gyógyszerérzékenységért felelős groB gén megfelelő fragmenseinek, vagy az izoniaziddal szembeni érzékenységért felelős mikobakteriális fehérjéket kódoló katG és inhA gének amplifikálására. A PCR-eredményeket agaróz gélelektroforézissel értékelik, amely megerősíti a kívánt hosszúságú megfelelő DNS-fragmensek megérkezését. Ezután egy második PCR-kört hajtanak végre, hogy fluoreszcens jelölést vigyenek be a DNS-be. A PCR-eredményeket ismét gélelektroforézissel erősítik meg. Ezt követően hibridizációt (éjszakás inkubáció) végeznek, majd a kapott anyagot egy biochipen mossák, amely nagyszámú rövid DNS-lánc (próbák) egy kis üveglapon rögzítve, amelyek komplementerek a gyógyszerérzékeny tuberkulózis mikobaktériumok nukleotidszekvenciáival a lehetséges mutációk pontjain. valamint a gyógyszerrezisztenciáért felelős mutáns szekvenciákra. A DNS-próbák helye a lemezen szigorúan meghatározott, és a hibridizáció során megfigyelt fluoreszcencia szintjét egy speciális leolvasó eszközzel határozzák meg az eredmény meghatározásához. E tekintetben az elemzés eredményeit egy speciális számítógépes program segítségével határozzák meg.

Az utóbbi években alternatív módszereket fejlesztettek ki a Mycobacterium tuberculosis gyógyszerérzékenységének meghatározására a valós idejű PCR technológián alapulva, lehetővé téve ezeknek a vizsgálatoknak a zárt kémcsőben történő elvégzését.

A 13-13. ábra a Mycobacterium tuberculosis klinikai tenyészeteinek rifampicinnel szembeni gyógyszerrezisztencia valós idejű PCR-rel történő meghatározásának elemzésének eredményét mutatja: 218 - kontrollminta (rifampicinre érzékeny); 93 - pozitív kontroll a Ser-Trp TCG-TGG mutációra; 4482 - pozitív kontroll a Ser-Leu TCG-TTG mutációra; 162-322 - kísérleti minták. A 4 csatorna amplifikációjának kinetikai görbéinek kiszámításának eredménye: 1. csatorna: 393 - pozitív kontroll a Ser-Trp TCG-TGG mutációra; 2. csatorna: 4482 - pozitív kontroll a Ser-Leu TCG-TTG mutációra; 162, 163, 172, 295 - kísérleti minták; 4. csatorna: a kísérletben részt vevő összes minta amplifikációjának kinetikai görbéi. Az amplifikációs reakció pozitív kontrollja. Következtetések: Az elemzés a következő, rifampicinnel szembeni rezisztenciát meghatározó mutációkat tárta fel: a 162, 163, 172, 295 mintákban - Ser-Leu TCG-TTG. Ugyanezt az elvet alkalmazták az izoniaziddal szembeni gyógyszerrezisztencia meghatározására a katG és inhA gének segítségével, amelyek a leggyakoribb mutációkat határozzák meg.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

A Mycobacterium tuberculosis törzsének azonosítása

A Mycobacterium tuberculosis törzsazonosításának leggyakrabban tanulmányozott módszere a restrikciós fragmens hossz polimorfizmusnak (RFLP) nevezett technológia, amely a Mycobacterium tuberculosis DNS Pvu II enzim általi fragmentációján (restrikcióján) és a kapott fragmensek ezt követő hibridizációján alapul, amely az IS6110 ismétlődő elem DNS-én található bizonyos specifikus szekvenciákkal történik. Az intraspecifikus variabilitás az IS6110 ismétlődések eltérő száma és a DNS-en való elhelyezkedésük, valamint a restrikciós enzim bizonyos támadási pontjai (restrikciós helyek) és az IS6110 elem közötti távolságok eltérése miatt valósul meg. Ez a technológia nagyon összetett és munkaigényes. A tuberculosis mycobacterium tenyészetből izolált DNS restrikciós enzimmel történő kezelése után gélelektroforézist végeznek, majd a különböző hosszúságú DNS-fragmenseket nitrocellulóz membránra viszik át, hibridizálják az IS6110 elem fragmenseivel, és az eredményeket enzimatikus reakcióval detektálják. A kapott specifikus sávmintázat jellemzi egy specifikus tuberculosis mycobacterium törzs DNS-ét. A számítógépes elemzés feltárja a törzsek azonosságát vagy rokonságát. Annak ellenére, hogy az RFLP módszer a leginkább diszkriminatív, azaz a vizsgált törzsek között a legtöbb különbséget mutatja, hatástalan a néhány törzsnél megfigyelt kis számú (5-nél kevesebb) IS6110 ismétlődés esetén. A 13-14. ábra a törzsek RFLP tipizálásának eredményeit mutatja.

Alternatív megoldásként szolgálhat a spoligotípus-meghatározás – a spacer DNS-szekvenciák polimorfizmusának elemzése –, amelyek a DR régió közvetlen ismétlődései között helyezkednek el. A törzsek spoligotípus-meghatározásakor a PCR-t a DR régiót korlátozó primerekkel végzik, majd különböző hosszúságú fragmensek képződnek, amelyek hibridizálnak a változó köztes DNS-régiókkal. A DR régió spacer szekvenciáinak elemzése a kutatók szerint egyszerűbbnek, produktívabbnak és alkalmasabbnak tűnik a törzsek elsődleges szűrésére és előzetes epidemiológiai elemzésére, valamint a klinikai anyagok közvetlen tanulmányozására.

Nyilvánvalóan egy hatékonyabb és technológiailag elérhetőbb módszer a VNTR (angol szavak rövidítése), vagyis a Mycobacterium tuberculosis DNS-ében található pontos tandem ismétlődések változó számának meghatározására szolgáló módszer. Ez a módszer kizárólag PCR használatán alapul, és nem igényel további manipulációkat. Mivel a tandem ismétlődések száma a különböző törzsekben és a különböző lokuszokban eltérő, a PCR-termékek kapott elektroforegramján különböző méretű fragmenseket határoznak meg és elemeznek. A kutatók szerint a VNTR segítségével a törzsek nagyobb mértékű megkülönböztetése érhető el, mint az RFLP módszerrel.

Az utóbbi években nagy figyelmet fordítottak a W-Beijing családba tartozó Mycobacterium tuberculosis törzsek (néha pekingi törzsként is emlegetik) terjedésére, amelyek nagyrészt gyógyszerrezisztensek.

A molekuláris biológiai kutatások minőségének alapvető követelményei

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

A PCR lefolytatásának főbb szabályozási dokumentumai

Az Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériumának rendeletei: 45. sz., 2000.02.07.; 109. sz., 2003.03.21.; 64. sz., 2000.02.21. Irányelvek: 1.3.1888-04 "A III-IV patogenitási csoportba tartozó patogén biológiai ágensekkel fertőzött anyagok PCR-kutatása során végzett munka megszervezése"; 1.3.1794-03 "Az I-II patogenitási csoportba tartozó mikroorganizmusokkal fertőzött anyagok PCR-kutatása során végzett munka megszervezése". 2003; 3.5.5.1034-01 "Az I-IV patogenitási csoportba tartozó baktériumokkal fertőzött vizsgálati anyag fertőtlenítése PCR módszerrel végzett munka során", 2001. A tuberkulózis kimutatására, diagnosztizálására és kezelésére szolgáló egységes mikrobiológiai kutatási módszerekről szóló utasítások 11. függeléke.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Személyzet

A molekuláris biológiai vizsgálatokat klinikai laboratóriumi diagnosztikai orvosok, bakteriológusok, virológusok, klinikai diagnosztikai laboratóriumi biológusok, valamint középfokú orvosi végzettséggel rendelkező szakemberek végezhetik, akik a megállapított módon szakosodtak és továbbképzésen vettek részt.

Laboratóriumi helyiségek elrendezése

A következő laboratóriumi felszerelésekre van szükség:

• Mintafeldolgozó terület - a III-IV. patogenitási csoportba tartozó fertőző ágensekkel való munkavégzésre alkalmas laboratórium, a 13.1888-04. számú módszertani irányelveknek megfelelően.
• A PCR reakcióelegyek előkészítésére szolgáló terület egy laboratóriumi helyiség, amely védelmet nyújt a belső laboratóriumi szennyeződéstől – egy „tiszta” terület.
• • Ha PCR-termékek elemzéséhez elektroforézist vagy hibridizációt alkalmaznak, akkor a laboratóriumi helyiséget, amelyben az amplifikált DNS-fragmenseket az amplifikációs csőből kivonják, és ennek megfelelően a környezetbe juthatnak, a PCR-laboratóriumokra vonatkozó követelményeknek (1.3.1794-03. sz. Módszertani Útmutató, 1.3.1888-04. sz. Módszertani Útmutató) megfelelően teljesen el kell különíteni az előző bekezdésekben meghatározott helyiségektől. Ki kell zárni a személyzet, a berendezések, az anyagok és tárgyak mozgását az elektroforézis területéről a mintafeldolgozó területre és a „tiszta” területre, valamint a levegő áramlását a szellőzőrendszeren keresztül vagy huzat következtében. Ez a terület nem szükséges a PCR-termékek fluorimetriás kimutatásához.
• A dokumentációra és az eredmények feldolgozására szolgáló helyiség számítógépekkel és a szükséges irodai felszereléssel van felszerelve. Ez a helyiség olyan berendezéseket tartalmazhat, amelyek biztosítják a PCR-termékek kimutatását a cső kinyitása nélkül. - fluoreszcens PCR-detektorok és termociklerek valós idejű PCR-hez.

A köpet elsődleges feldolgozására vonatkozó egészségügyi és járványügyi követelmények hasonlóak a Mycobacterium tuberculosis-szal való munkavégzés standard mikrobiológiai követelményeihez.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Teljes laboratóriumi felszerelés PCR diagnosztikához

A laboratóriumi készlet a következő helyiségek felszerelését tartalmazza.

• mintaelőkészítő helyiség, a következő felszerelést tartalmazza: II. "SP-1.2" védettségi osztályú lamináris áramlású fülke: fűtött fedéllel ellátott szilárdtest termosztát Eppendorf kémcsövekhez; 13 000 fordulat/perc sebességű mikrocentrifuga; centrifuga ("Vortex"); -20 ^° C és +10 ^° C közötti hőmérséklet-tartománnyal rendelkező hűtőszekrény; "Proline" sorozatú változtatható térfogatú pipetták; OM-1 csapdalombikos pumpa; pipettatartó; 200x0,5 ml-es munkaállomás-állvány; 50x1,5 ml-es munkaállomás-állvány; 80x1,5 ml-es kémcsövek tárolására szolgáló állványok;
• reakcióelegy előkészítő helyiség: védőkamra PCR doboz ("Laminar-C. 110 cm"); "Vortex" centrifuga; "Proline" sorozatú változó térfogatú pipetták; pipettatartó; munkaállomás-állvány 200x0,2 ml; állványok kémcsövek tárolására 80x1,5 ml; hűtőszekrény -20 ^° C és +10 ^° C közötti hőmérsékleti tartománnyal;
• Elektroforézis szoba: vízszintes elektroforézis kamra; áramforrás; transzilluminátor;
• DNS-erősítő vagy nukleinsav-analizátor (valós idejű PCR) számítógéppel és szoftverrel; bármely rendelkezésre álló helyiségben elhelyezhető. Valós idejű PCR technológia alkalmazása esetén elektroforézis szobára nincs szükség.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Külső minőségellenőrzés

Annak érdekében, hogy objektíven megbízható eredményeket kapjanak, a laboratóriumoknak részt kell venniük egy külső laboratóriumi kutatási minőségértékelési rendszerben.

A minőségellenőrzési rendszerben résztvevők a következőket kapják: 12 ampulla liofilizált baktériumsejt-szuszpenziókat, melyek közül kettő E. colit tartalmaz, 3 ampulla tuberkulózis mycobacteriumot (avirulens törzs) 102/ml koncentrációban ^{; 3 ampulla hasonló törzs sejtjeit104} /ml koncentrációban; 2 ampulla egyenként nem tuberkulózis mycobacterium M. avium-intracellulare és M. kansasii baktériumokat ¹⁰⁵ /ml koncentrációban.

A külső minőségellenőrzésre kiküldött teszteket két független, ezen a területen széleskörű tapasztalattal rendelkező laboratóriumban előzetesen tesztelik.

[ 85 ], [ 86 ]