Az enzimek és citokinek szerepe az osteoarthritis patogenezisében

Az utóbbi években a kutatók nagy figyelmet fordítottak az ízületi porc ECM-jének lebontásáért felelős proteázok azonosítására oszteoartrózis esetén. A modern elképzelések szerint a mátrix metalloproteinázok (MMP-k) fontos szerepet játszanak az oszteoartrózis patogenezisében. Osteoartrózisban szenvedő betegeknél három MMP-szint emelkedését észlelik - a kollagenázok, a stromelizinek és a zselatinázok szintjének emelkedését. A kollagenáz a natív kollagén, a stromelizin a IV-es típusú kollagén, a proteoglikánok és a laminin, a zselatináz pedig a zselatin, a IV-es és a Vh-XI-es típusú kollagének és az elasztin lebontásáért felelős. Ezenkívül feltételezik egy másik enzim, az aggrekanáz jelenlétét is, amely az MMP-k tulajdonságaival rendelkezik, és a porcos proteoglikán aggregátumok proteolíziséért felelős.

Háromféle kollagenázt azonosítottak az emberi ízületi porcban, amelyek szintje jelentősen emelkedett osteoarthritisben szenvedő betegeknél: kollagenáz-1 (MMP-1), kollagenáz-2 (MMP-8) és kollagenáz-3 (MMP-13). A három különböző típusú kollagenáz együttes jelenléte az ízületi porcban arra utal, hogy mindegyiknek megvan a saját specifikus szerepe. Valójában a kollagenáz-1 és -2 főként az ízületi porc felszíni és felső közbenső zónájában lokalizálódik, míg a kollagenáz-3 az alsó közbenső zónában és a mély zónában található. Ezenkívül az immunhisztokémiai vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy az osteoarthritis előrehaladtával a kollagenáz-3 szintje eléri a platót, sőt csökken, míg a kollagenáz-1 szintje fokozatosan emelkedik. Bizonyítékok vannak arra, hogy osteoarthritisben a kollagenáz-1 főként az ízületi porc gyulladásos folyamatában vesz részt, míg a kollagenáz-3 a szövetek átalakulásában. Az OA-ban szenvedő betegek porcában expresszálódó kollagenáz-3 intenzívebben bontja le a II. típusú kollagént, mint a kollagenáz-1.

A metalloproteinázok második csoportjának képviselői közül hármat azonosítottak az emberi stromelizinben is: stromelizin-1-et (MMP-3), stromelizin-2-t (MMP-10) és stromelizin-3-at (MMP-11). Ma már ismert, hogy csak a stromelizin-1 vesz részt az oszteoartrózis kóros folyamatában. A stromelizin-2 nem detektálható az oszteoartrózisos betegek szinoviális membránjában, de nagyon kis mennyiségben megtalálható a reumatoid artritiszben szenvedő betegek szinoviális fibroblasztjaiban. A stromelizin-3 szintén megtalálható a reumatoid artritiszben szenvedő betegek szinoviális membránjában a fibroblasztok közelében, különösen a fibrózisos zónákban.

Az emberi porcszövetben található zselatinázok csoportjában csak kettőt azonosítottak: a 92 kD-os zselatinázt (zselatináz B vagy MMP-9) és a 72 kD-os zselatinázt (zselatináz A vagy MMP-2); osteoarthritisben szenvedő betegeknél a 92 kD-os zselatináz szintjének emelkedését figyelték meg.

Nemrégiben azonosítottak egy másik MMP-csoportot, amelyek a sejtmembránok felszínén lokalizálódnak, és membrán típusú MMP-knek (MMP-MT) nevezik őket. Ez a csoport négy enzimet tartalmaz - MMP-MT1 - MMP-MT-4. Az MMP-MT expresszióját kimutatták az emberi ízületi porcban is. Bár az MMP-MT-1 kollagenáz tulajdonságokkal rendelkezik, mind az MMP-MT-1, mind az MMP-MT-2 enzim képes aktiválni a zselatináz-72 kDa és a kollagenáz-3 enzimeket. Az MMP-csoport szerepe az OA patogenezisében tisztázásra szorul.

A proteinázok zimogén formájában választódnak ki, amelyet más proteinázok vagy szerves higanyvegyületek aktiválnak. Az MMP-k katalitikus aktivitása a cink jelenlététől függ az enzim aktív zónájában.

Az MMP-k biológiai aktivitását specifikus TIMP-ek szabályozzák. A mai napig háromféle TIMP-et azonosítottak, amelyek az emberi ízületi szövetekben találhatók: TIMP-1–TIMP-3. Egy negyedik TIMP-típust is azonosítottak és klónoztak, de azt még nem mutatták ki emberi ízületi szövetekben. Ezek a molekulák specifikusan kötődnek az MMP-k aktív helyéhez, bár némelyikük képes kötődni a 72 kD-os progelatináz (TIMP-2, -3, -4) és a 92 kD-os progelatináz (TIMP-1 és -3) aktív helyéhez. A bizonyítékok arra utalnak, hogy OA esetén az MMP-k és a TIMP-ek között egyensúlyhiány van az ízületi porcban, ami az inhibitorok relatív hiányához vezet, valószínűleg részben az aktív MMP-k szintjének növekedése miatt a szövetben. A TIMP-1 és -2 az ízületi porcban található, és a porcsejtek szintetizálják őket. Osteoarthrosis esetén csak az I. típusú TIMP detektálható az ízületi membránban és az ízületi folyadékban. A TIMP-3 kizárólag az ECM-ben található meg. A TIMP-4 aminosav-szekvenciájának közel 50%-ában megegyezik a TIMP-2-vel, és 38%-ában a TIMP-1-gyel. Más célsejtekben a TIMP-4 felelős a 72 kD-os progelatináz aktivációjának modulálásáért a sejtfelszínen, ami fontos szerepet jelez az ECM átrendeződés szövetspecifikus szabályozójaként.

Az MMP-k biológiai aktivitását szabályozó másik mechanizmus a fiziológiai aktiválásuk. Úgy vélik, hogy a szerin és cisztein proteáz családba tartozó enzimek, mint például az AP/plazmin és a katepszin B, az MMP-k fiziológiai aktivátorai. Az osteoarthritisben szenvedő betegek ízületi porcában megnövekedett urokináz (uAP) és plazmin szintet találtak.

Annak ellenére, hogy az ízületi szövetekben többféle katepszin található, a katepszin-B-t tartják az MMP-k legvalószínűbb aktivátorának a porcban. Az emberi ízületi szövetekben kimutatták a szerin- és ciszteinproteázok fiziológiás inhibitorait. Az AP-1 inhibitor (IAI-1), valamint a ciszteinproteázok aktivitása csökken osteoarthritisben szenvedő betegeknél. Az MMP/TIMP-hez hasonlóan a szerin- és ciszteinproteázok, valamint inhibitoraik közötti egyensúlyhiány magyarázhatja az MMP-k fokozott aktivitását az osteoarthritisben szenvedő betegek ízületi porcában. Ezenkívül az MMP-k képesek aktiválni egymást. Például a stromelysin-1 aktiválja a kollagenáz-1-et, a kollagenáz-3-at és a 92 kD-os zselatinázt; a kollagenáz-3 aktiválja a 92 kD-os zselatinázt; az MMP-MT aktiválja a kollagenáz-3-at, és a zselatináz-72 kDa fokozza ezt az aktivációt; az MMP-MT szintén aktiválja a zselatinázt 72 kDa-ban. A citokinek három csoportra oszthatók: destruktív (gyulladásos), szabályozó (beleértve a gyulladáscsökkentőket) és anabolikus (növekedési faktorok).

A citokinek típusai (van den Berg WB és munkatársai szerint)

Pusztító	Interleukin-1 TNF-α Leukémia gátló faktor Interleukin-17
Szabályozó	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Enzim inhibitorok
Anabolikus	Mnsulin-szerű növekedési faktorok TGF-b Csontmorfogenetikus fehérjék Porcból származó morfogenetikus fehérjék

A destruktív citokinek, különösen az IL-1, fokozzák a proteázok felszabadulását, és gátolják a porcsejtek proteoglikánok és kollagének szintézisét. A szabályozó citokinek, különösen az IL-4 és az IL-10, gátolják az IL-1 termelést, fokozzák az IL-1 receptor antagonista (IL-1RA) termelését, és csökkentik a NO szintáz szintjét a porcsejtekben. Így az IL-4 három irányban hat az IL-1-re: 1) csökkenti a termelést, megakadályozva annak hatásait, 2) növeli a fő "eltávolító" IL-1RA termelését, és 3) csökkenti a fő másodlagos "hírvivő" NO termelését. Ezenkívül az IL-4 csökkenti a szövetek enzimatikus lebontását. In vivo az optimális terápiás hatást az IL-4 és az IL-10 kombinációjával érik el. Az anabolikus faktorok, mint például a TGF-β és az IGF-1, valójában nem zavarják az IL-1 termelését vagy hatását, hanem ellentétes aktivitást mutatnak, például serkentik a proteoglikánok és a kollagén szintézisét, elnyomják a proteázok aktivitását, és a TGF-β gátolja az enzimek felszabadulását és stimulálja azok inhibitorait.

A gyulladáskeltő citokinek felelősek az MMP-k fokozott szintéziséért és expressziójáért az ízületi szövetekben. Ezek az ízületi membránban szintetizálódnak, majd az ízületi folyadékon keresztül diffundálnak az ízületi porcba. A gyulladáskeltő citokinek aktiválják a porcsejteket, amelyek viszont szintén képesek gyulladáskeltő citokinek termelésére. Az oszteoartrózis által érintett ízületekben a gyulladás effektorának szerepét főként az ízületi membrán sejtjei töltik be. A makrofág típusú szinovociták választják ki a proteázokat és a gyulladásos mediátorokat. Közülük az IL-f, a TNF-a, az IL-6, a leukémia-gátló faktor (LIF) és az IL-17 a leginkább „részesedő” az oszteoartrózis patogenezisében.

Biológiailag aktív anyagok, amelyek serkentik az ízületi porc lebomlását osteoarthritisben

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-α
• Kolóniastimuláló faktorok: makrofág (monocita) és granulocita-makrofág
• P anyag
• 2. _oldal
• Plazminogén aktivátorok (szöveti és urokináz típusú) és plazmin
• Metalloproteinázok (kollagenázok, ellastázok, stromelizinek)
• Katepszin A és B
• Trilsin
• Bakteriális lipopoliszacharidok
• Foszfolipáz Ag

Az irodalmi adatok arra utalnak, hogy az IL-1 és esetleg a TNF-α az ízületi szövetek károsodásának fő mediátorai oszteoartrózis esetén. Azonban még mindig nem ismert, hogy egymástól függetlenül hatnak-e, vagy van-e funkcionális hierarchia közöttük. Az oszteoartrózis állatmodelljei kimutatták, hogy az IL-1 blokádja hatékonyan megakadályozza az ízületi porc pusztulását, míg a TNF-α blokádja csak a gyulladás csökkenéséhez vezet az ízületi szövetekben. Mindkét citokin megnövekedett koncentrációját találták a betegek ízületi membránjában, ízületi folyadékában és porcában. A porcsejtekben nemcsak a proteázok (főleg az MMP és az AP), hanem a kisebb kollagének, például az I. és III. típusúak szintézisét is képesek fokozni, és csökkenteni a II. és IX. típusú kollagének és a proteoglikánok szintézisét. Ezek a citokinek stimulálják a reaktív oxigénfajtákat és a gyulladásos mediátorokat, például a PGE2 _-t is. Az ilyen makromolekuláris változások eredménye az ízületi porcban oszteoartrózis esetén a reparatív folyamatok hatástalansága, ami a porc további lebomlásához vezet.

A fent említett gyulladáskeltő citokinek modulálják az MMP-szupresszió/aktiváció folyamatait oszteoartrózisban. Például az oszteoartrózisban a porcban a TIMP-1 és az MMP szintje közötti egyensúlyhiányt az IL-1 közvetítheti, mivel egy in vitro vizsgálat kimutatta, hogy az IL-1 béta koncentrációjának növekedése a TIMP-1 koncentrációjának csökkenéséhez és a porcsejtek MMP-szintézisének növekedéséhez vezet. Az AP szintézisét is az IL-1 béta modulálja. Az ízületi porc porcsejtjeinek in vitro stimulálása IL-1-gyel dózisfüggő növekedést okoz az AP szintézisében és az iAP-1 szintézis hirtelen csökkenését. Az IL-1 azon képessége, hogy csökkenti az iAP-1 szintézist és stimulálja az AP szintézist, hatékony mechanizmus a plazmin képződéséhez és az MMP aktiválásához. Ezenkívül a plazmin nemcsak egy olyan enzim, amely más enzimeket aktivál, hanem közvetlen proteolízissel is részt vesz a porc lebomlásának folyamatában.

Az IL-ip inaktív prekurzorként szintetizálódik, 31 kD tömeggel (pre-IL-ip), majd a szignálpeptid hasítása után egy 17,5 kD tömegű aktív citokinné alakul. Az ízületi szövetekben, beleértve az ízületi membránt, az ízületi folyadékot és az ízületi porcot, az IL-ip aktív formában található meg, és in vivo vizsgálatok kimutatták, hogy az ízületi membrán oszteoartrózisban képes ezt a citokint kiválasztani. Egyes szerin proteázok képesek a pre-IL-ip-t bioaktív formájává alakítani. Emlősökben ilyen tulajdonságokat csak egyetlen proteázban találtak, amely a cisztein-aszpartát-specifikus enzimek családjába tartozik, és IL-1β-konvertáló enzimnek (ICF vagy kaszpáz-1) nevezik. Ez az enzim képes specifikusan a pre-IL-ip-t biológiailag aktív, 17,5 kD tömegű, "érett" IL-ip-vé alakítani. Az ICF egy 45 kD-os proenzim (p45), amely a sejtmembránban lokalizálódik. A p45 proenzim proteolitikus hasítása után két alegység, p10 és p20 keletkezik, amelyeket enzimatikus aktivitás jellemez.

A TNF-α membránhoz kötött prekurzorként is szintetizálódik, 26 kDa tömeggel; proteolitikus hasítással szabadul fel a sejtből 17 kDa tömegű aktív, oldható formában. A proteolitikus hasítást a TNF-α-t konvertáló enzim (TNF-AC) végzi, amely az adamalizin családba tartozik. AR Amin és munkatársai (1997) a TNF-AC mRNS fokozott expresszióját találták osteoarthritisben szenvedő betegek ízületi porcában.

Az IL-1 és a TNF-α általi kondroititák és szinovociták biológiai aktiválódása a sejtfelszínen található specifikus receptorokhoz - IL-R-hez és TNF-R-hez - való kötődésen keresztül történik. Mindkét citokinhez kétféle receptort azonosítottak - az IL-IP I. és II. típusú, valamint a TNF-R I. típusú (p55) és II. típusú (p75). Az IL-1PI és a p55 felelősek a jelátvitelért az ízületi szövetek sejtjeiben. Az I. típusú IL-1R valamivel nagyobb affinitást mutat az IL-1béta iránt, mint az IL-1a iránt; ezzel szemben az IL-1R II. típusú nagyobb affinitást mutat az IL-1a iránt, mint az IL-ip iránt. Továbbra sem világos, hogy az IL-IP II. típusú közvetítheti-e az IL-1 jeleket, vagy csak az IL-1 és az I. típusú IL-1R asszociációjának kompetitív gátlására szolgál. Az oszteoartrózisban szenvedő betegek kondroitiszjei és szinoviális fibroblasztjai nagy mennyiségű IL-1PI-t és p55-öt tartalmaznak, ami viszont magyarázza ezen sejtek nagy érzékenységét a megfelelő citokinek stimulációjával szemben. Ez a folyamat mind a proteolitikus enzimek fokozott szekréciójához, mind az ízületi porc pusztulásához vezet.

Az IL-6 szerepe az osteoarthritis kóros folyamatában nem zárható ki. Ez a feltételezés a következő megfigyeléseken alapul:

• Az IL-6 növeli a gyulladásos sejtek számát az ízületi membránban,
• Az IL-6 serkenti a kondrocita-proliferációt,
• Az IL-6 fokozza az IL-1 hatását az MMP-szintézis fokozásában és a proteoglikán-szintézis gátlásában.

Az IL-6 azonban képes TIMP-ek termelődését indukálni, de nem befolyásolja az MMP-k termelődését, ezért úgy vélik, hogy ez a citokin részt vesz az ízületi porc proteolitikus lebontásának gátlásának folyamatában, amelyet egy visszacsatolási mechanizmus hajt végre.

Az IL-6 család egy másik tagja a LIF, egy citokin, amelyet az oszteoartrózisban szenvedő betegekből származó porcsejtek termelnek az IL-1p és a TNF-α gyulladáskeltő citokinek stimulációjára válaszul. A LIF serkenti a porc proteoglikán felszívódását, valamint az MMP szintézisét és a NO termelést. Ennek a citokinnek a szerepe az oszteoartrózisban még nem teljesen tisztázott.

Az IL-17 egy 20-30 kD-os homodimer, IL-1-szerű hatással, de sokkal kevésbé kifejezett. Az IL-17 számos gyulladáskeltő citokin, köztük IL-1p, TNF-α, IL-6 és MMP szintézisét és felszabadulását serkenti célsejtekben, például emberi makrofágokban. Ezenkívül az IL-17 serkenti a porcsejtek NO-termelését. A LIF-hez hasonlóan az IL-17 szerepét az OA patogenezisében kevéssé tanulmányozták.

A szervetlen szabadgyökös NO fontos szerepet játszik az ízületi porc lebomlásában oszteoartritiszben (OA). Az osteoarthritisben szenvedő betegekből izolált porcsejtek nagyobb mennyiségű NO-t termelnek mind spontán, mind gyulladáskeltő citokinekkel történő stimuláció után, mint a normál sejtek. Magas NO-tartalmat találtak osteoarthritisben szenvedő betegek ízületi folyadékában és szérumában - ez az indukált NO-szintáz (hNOC), az NO-termelésért felelős enzim fokozott expressziójának és szintézisének eredménye. Nemrégiben klónozták a porcsejtekre specifikus hNOC DNS-ét, és meghatározták az enzim aminosav-szekvenciáját. Az aminosav-szekvencia 50%-os azonosságot és 70%-os hasonlóságot mutat az endotéliumra és az idegszövetre specifikus hNOC-kal.

A NO gátolja az ízületi porc ECM-jének makromolekuláinak szintézisét és serkenti az MMP szintézisét. Ezenkívül a NO-termelés növekedését az IL-IP antagonista (IL-1RA) szintézisének csökkenése kíséri a porcsejtekben. Így az IL-1 szintjének növekedése és az IL-1RA szintjének csökkenése a NO hiperstimulációjához vezet a porcsejtekben, ami viszont a porcmátrix fokozott lebomlásához vezet. Jelentések vannak egy szelektív hNOC-gátló in vivo terápiás hatásáról a kísérletes oszteoartrózis progressziójára.

A természetes citokin inhibitorok képesek közvetlenül megakadályozni a citokinek kötődését a sejtmembrán receptoraihoz, csökkentve gyulladáskeltő aktivitásukat. A természetes citokin inhibitorok hatásmechanizmusuk alapján három osztályba sorolhatók.

Az inhibitorok első osztályába tartoznak a receptor antagonisták, amelyek megakadályozzák a ligand kötődését a receptorához azáltal, hogy versengenek a kötőhelyért. A mai napig csak az IL-1 esetében találtak ilyen inhibitort - ez a fent említett IL-1/ILIP rendszer kompetitív inhibitora, az IL-1 PA. Az IL-1 PA számos olyan hatást blokkol, amelyek az osteoarthritisben az ízületi szövetekben megfigyelhetők, beleértve a prosztaglandinok szintézisét az ízületi sejtek által, a kollagenáz termelését a porcsejtek által, valamint az ízületi porc csontvázának lebomlását.

Az IL-1RA különböző formában fordul elő – egy oldható (rIL-1RA) és két sejtközi (μIL-lPAI és μIL-1RAP) formában. Az IL-1RA oldható formájának affinitása ötször nagyobb, mint az intercelluláris formáké. Az intenzív tudományos kutatások ellenére az utóbbi funkciója továbbra sem ismert. In vitro kísérletek kimutatták, hogy az IL-1béta aktivitás gátlásához az IL-1RA koncentrációjának 10-100-szor magasabbnak kell lennie a normálisnál, míg in vivo körülmények között az IL-1RA koncentrációjának ezerszeresére kell emelkednie. Ez a tény részben magyarázhatja az IL-1RA relatív hiányát és az IL-1 feleslegét az oszteoartrózisban szenvedő betegek synoviumában.

A természetes citokin-gátlók második osztályát az oldható citokin-receptorok alkotják. Emberben az osteoarthritis patogenezisével kapcsolatos ilyen inhibitorokra példa az rIL-1R és a pp55. Az oldható citokin-receptorok a normál receptorok rövidült formái; amikor citokinekhez kötődnek, megakadályozzák azok kötődését a célsejtek membránhoz kapcsolódó receptoraihoz, a kompetitív antagonizmus mechanizmusán keresztül hatva.

Az oldható receptorok fő prekurzora a membránhoz kötött IL-1RP. Az rIL-IP affinitása az IL-1 és az IL-1RA iránt eltérő. Így az rIL-1RN nagyobb affinitással rendelkezik az IL-1β iránt, mint az IL-1RA iránt, és az rIL-1PI nagyobb affinitást mutat az IL-1RA iránt, mint az IL-ip iránt.

A TNF-nek kétféle oldható receptora létezik: a pp55 és a pp75. Az oldható IL-1 receptorokhoz hasonlóan ezek is „leválás” útján képződnek. In vivo mindkét receptor megtalálható az érintett ízületek szöveteiben. Az oldható TNF-receptorok szerepe az oszteoartrózis patogenezisében vitatott. Feltételezik, hogy alacsony koncentrációban stabilizálják a TNF háromdimenziós szerkezetét és növelik a bioaktív citokin felezési idejét, míg a pp55 és pp75 magas koncentrációi kompetitív antagonizmus révén csökkenthetik a TNF aktivitását. Valószínűleg a pp75 TNF-hordozóként működhet, elősegítve annak kötődését a membránhoz kapcsolódó receptorhoz.

A természetes citokin inhibitorok harmadik osztályát a gyulladáscsökkentő citokinek csoportja képviseli, amelyek közé tartozik a TGF-béta, az IL-4, az IL-10 és az IL-13. A gyulladáscsökkentő citokinek csökkentik a gyulladáskeltő és egyes proteázok termelését, és serkentik az IL-1RA és a TIMP termelését.