A cikk orvosi szakértője
Új kiadványok
Molekuláris genetikai módszerek az örökletes betegségek diagnosztizálására
Utolsó ellenőrzés: 06.07.2025
Minden iLive-tartalmat orvosi szempontból felülvizsgáltak vagy tényszerűen ellenőriznek, hogy a lehető legtöbb tényszerű pontosságot biztosítsák.
Szigorú beszerzési iránymutatásunk van, és csak a jó hírű média oldalakhoz, az akadémiai kutatóintézetekhez és, ha lehetséges, orvosilag felülvizsgált tanulmányokhoz kapcsolódik. Ne feledje, hogy a zárójelben ([1], [2] stb.) Szereplő számok ezekre a tanulmányokra kattintható linkek.
Ha úgy érzi, hogy a tartalom bármely pontatlan, elavult vagy más módon megkérdőjelezhető, jelölje ki, és nyomja meg a Ctrl + Enter billentyűt.
A DNS-technológiai módszereket arra használják, hogy meghatározzák egy mutáns gén lokalizációját egy adott kromoszómában, amely az örökletes patológia bizonyos formáinak eredetéért felelős. Mivel a gén a DNS egy szakasza, a génmutáció pedig a DNS elsődleges szerkezetének károsodása (mutáción a DNS-szekvencia minden változását értjük, függetlenül azok lokalizációjától és az egyed életképességére gyakorolt hatásától), akkor egy örökletes betegségben szenvedő beteg metafázisos kromoszómáinak preparátumainak vizsgálatával megállapítható a kóros gén lokalizációja. A molekuláris genetikai módszerek lehetőséget teremtenek a betegségek diagnosztizálására a megváltozott DNS-szerkezet szintjén, lehetővé teszik az örökletes rendellenességek lokalizációjának meghatározását. A molekuláris genetikai módszerek képesek azonosítani azokat a mutációkat, amelyek akár egyetlen bázis helyettesítésével is összefüggenek.
A génazonosítás legfontosabb szakasza az izolálása. A DNS bármilyen típusú szövetből és sejtmagot tartalmazó sejtből izolálható. A DNS izolálásának szakaszai a következők: a sejtek gyors lízise, a sejtszervecskék és membránok töredékeinek eltávolítása centrifugálással, a fehérjék enzimatikus roncsolása és extrakciója oldatból fenol és kloroform segítségével, valamint a DNS-molekulák koncentrálása etanolos kicsapással.
A genetikai laboratóriumokban a DNS-t leggyakrabban vérleukocitákból izolálják, ehhez 5-20 ml vénás vért vesznek a betegtől egy steril, véralvadásgátló oldattal (heparinnal) töltött kémcsőbe. Ezután a leukocitákat elválasztják és a fenti lépések szerint dolgozzák fel.
A kutatási anyag előkészítésének következő szakasza a DNS „felvágása” szigorúan specifikus bázisszekvenciájú területeken lévő fragmentumokra, amelyet bakteriális enzimek - restrikciós endonukleázok (restrikciós enzimek) segítségével végeznek. A restrikciós enzimek felismerik a kétszálú DNS-molekulában a 4-6, ritkábban 8-12 nukleotid hosszúságú specifikus szekvenciákat, és ezen szekvenciák helyén fragmentumokra osztják azokat, amelyeket restrikciós helyeknek neveznek. A DNS keletkező restrikciós fragmentumainak számát a restrikciós helyek előfordulási gyakorisága, a fragmentumok méretét pedig ezeknek a helyeknek az eredeti DNS-molekula hosszában való eloszlásának jellege határozza meg. Minél gyakrabban helyezkednek el a restrikciós helyek, annál rövidebbek a DNS-fragmenumok a restrikció után. Jelenleg több mint 500 különböző típusú bakteriális eredetű restrikciós enzim ismert, és ezek mindegyike felismeri a saját specifikus nukleotidszekvenciáját. A jövőben a restrikciós helyek a DNS genetikai markereiként használhatók. A restrikció eredményeként képződött DNS-fragmenseket agaróz vagy poliakrilamid gélben elektroforézissel hossz szerint lehet rendezni, és így molekulatömegük meghatározható. A gélben lévő DNS-t jellemzően specifikus festéssel (általában etídium-bromiddal) és a gél áteresztő ultraibolya fényben történő vizsgálatával azonosítják. A DNS lokalizációs helyei piros színűek. Emberben azonban, amikor a DNS-t több restrikciós enzim dolgozza fel, annyi különböző hosszúságú fragmens képződik, hogy elektroforézissel nem lehet elválasztani őket, azaz az elektroforézis során nem lehet vizuálisan azonosítani az egyes DNS-fragmenseket (a gél teljes hosszában egyenletes festődést kapunk). Ezért a kívánt DNS-fragmensek azonosításához egy ilyen gélben a jelölt DNS-próbákkal végzett hibridizációs módszert alkalmazzák.
Bármely egyszálú DNS- vagy RNS-szegmens képes kötődni (hibridizálni) egy komplementer szálhoz, ahol a guanin mindig a citozinhoz, az adenin pedig a timinhez kötődik. Így jön létre egy kétszálú molekula. Ha egy klónozott gén egyszálú másolatát radioaktív jelöléssel jelöljük, egy próbát kapunk. A próba képes megtalálni a DNS komplementer szegmensét, amelyet aztán autoradiográfiával könnyen azonosítani lehet. A kinyújtott kromoszómákból álló preparátumhoz adott radioaktív próba lehetővé teszi a gén lokalizálását egy adott kromoszómán: egy DNS-próba segítségével a Southern blot analízis során specifikus területek azonosíthatók. Hibridizáció akkor következik be, ha a vizsgált DNS-szakasz normális gént tartalmaz. Abban az esetben, ha abnormális nukleotidszekvencia van jelen, azaz a megfelelő kromoszóma-struktúrák mutáns gént tartalmaznak, hibridizáció nem következik be, ami lehetővé teszi a kóros gén lokalizációjának meghatározását.
DNS-próbák kinyeréséhez a génklónozási módszert alkalmazzák. A módszer lényege, hogy egy génnek vagy génszakasznak megfelelő DNS-fragmentumot egy klónozó részecskébe, általában egy bakteriális plazmidba (bakteriális sejtekben jelen lévő, antibiotikum-rezisztencia géneket hordozó gyűrűs extrakromoszómális DNS) illesztenek be, majd a beillesztett emberi gént tartalmazó plazmidba juttatott baktériumokat felszaporítják. A plazmidban lejátszódó szintézisfolyamatoknak köszönhetően az emberi génből vagy annak szakaszából több milliárd példány nyerhető.
A kapott, radioaktív jelöléssel vagy fluorokrómokkal jelölt DNS-másolatokat ezután próbaként használják a vizsgált DNS-molekulák készletében található komplementer szekvenciák keresésére.
Jelenleg számos különböző módszer létezik DNS-próbák felhasználásával a génmutációk diagnosztizálására.
[