A sejtátültetés korlátai, veszélyei és szövődményei

A regeneratív plasztikai medicina az embrionális és progenitor őssejtek toti- és pluripotens tulajdonságainak klinikai megvalósításán alapul, amelyek lehetővé teszik in vitro és in vivo olyan specifikus sejtvonalak létrehozását, amelyek újra benépesítik a beteg személy sérült szöveteit és szerveit.

Az emberi embrionális őssejtek és a definitív szövetekből származó őssejtek (az úgynevezett „felnőtt” őssejtek) terápiás célú felhasználásának valódi lehetősége már nem kétséges. Az USA Nemzeti és Orvosi Akadémiájának (Őssejtek és a jövő regeneratív orvoslása, National Academy Press) és az USA Nemzeti Egészségügyi Intézetének (Őssejtek és a jövő kutatási irányai, Nat. Inst, of Health USA) szakértői azonban az őssejtek tulajdonságainak részletesebb vizsgálatát javasolják megfelelő biológiai modelleken végzett kísérletekben, valamint a transzplantáció összes következményének objektív értékelését, és csak ezt követően javasolják az őssejtek klinikai alkalmazását.

Megállapították, hogy az őssejtek mindhárom csíralemez szöveti származékainak részét képezik. Az őssejtek megtalálhatók a retinában, a szaruhártyában, a bőr hámrétegében, a csontvelőben és a perifériás vérben, az erekben, a fogbélben, a vesében, a gyomor-bélrendszeri hámban, a hasnyálmirigyben és a májban. Modern módszerekkel bebizonyosodott, hogy az idegi őssejtek egy felnőtt agyában és gerincvelőjében lokalizálódnak. Ezek a szenzációs adatok különös figyelmet keltettek a tudósok és a média körében, mivel az agyban lévő neuronok klasszikus példái voltak a statikus sejtpopulációnak, amely nem áll helyre. Mind az ontogenezis korai, mind a késői szakaszában neuronok, asztrociták és oligodendrociták képződnek az állatok és az emberek agyában az idegi őssejtek hatására (Őssejtek: tudományos fejlődés és jövőbeli kutatási irányok. Nat. Inst, of Health USA).

Normál körülmények között azonban a definitív szövetek őssejtjeinek plaszticitása nem nyilvánul meg. A definitív szövetek őssejtjeinek plaszticitási potenciáljának kiaknázásához azokat izolálni, majd citokineket (LIF, EGF, FGF) tartalmazó táptalajon tenyészteni kell. Ezenkívül az őssejt-származékok csak akkor tapadnak be sikeresen, ha legyengült immunrendszerű állat szervezetébe ültetik át őket (γ-besugárzás, citosztatikumok, buszulfán stb.). A mai napig nem sikerült meggyőző bizonyítékot találni az őssejt-plaszticitás megvalósulására olyan állatokban, amelyeket nem tettek ki sugárzásnak vagy más, mély immunszuppressziót okozó hatásoknak.

Ilyen körülmények között az ESC-k veszélyes potenciálja mindenekelőtt az ektópiás területekre történő átültetésük során nyilvánul meg - az ESC-k immunhiányos egerekbe történő szubkután injekciózása során teratokarcinómák alakulnak ki az injekció beadásának helyén. Ezenkívül az emberi embrió fejlődése során a kromoszóma-rendellenességek gyakorisága magasabb, mint az állatok embriogenezise során. A blasztociszta stádiumban az emberi embrióknak csak 20-25%-a áll normális kariotípusú sejtekből, és az in vitro megtermékenyítés után kapott korai emberi embriók túlnyomó többsége kaotikus kromoszóma-mozaikizmust mutat, és nagyon gyakran találkoznak numerikus és szerkezeti rendellenességekkel.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Az őssejtek jótékony hatásai

A klinikai vizsgálatok előzetes eredményei megerősítik az őssejtek jótékony hatását a betegre, de a sejtátültetés hosszú távú hatásairól még mindig nincsenek információk. A szakirodalmat kezdetben a Parkinson-kórban az embrionális agytöredékek átültetésének pozitív eredményeiről szóló beszámolók dominálták, de aztán elkezdtek megjelenni olyan adatok, amelyek tagadták a betegek agyába átültetett embrionális vagy magzati idegszövet hatékony terápiás hatását.

A 20. század közepén fedezték fel először a vérképzés helyreállítását halálosan besugárzott állatokban a csontvelősejtek intravénás transzfúziója után, és 1969-ben az amerikai kutató, D. Thomas elvégezte az első csontvelő-transzplantációt emberben. A donor és a recipiens csontvelősejtek immunológiai inkompatibilitásának mechanizmusaival kapcsolatos ismeretek hiánya akkoriban magas halálozási arányhoz vezetett a gyakori transzplantációs kudarc és a graft-versus-host reakció kialakulása miatt. A fő hisztokompatibilitási komplex, amely magában foglalja az emberi leukocita antigéneket (HbA), felfedezése és tipizálási módszereinek fejlesztése lehetővé tette a csontvelő-transzplantáció utáni túlélés jelentős növelését, ami a kezelési módszer széles körű elterjedéséhez vezetett az onkohematológiában. Egy évtizeddel később elvégezték a perifériás vérből leukaferézissel nyert hematopoietikus őssejtek (HSC-k) első transzplantációját. 1988-ban Franciaországban először használtak köldökzsinórvért HSC-k forrásaként egy Fanconi-vérszegénységben szenvedő gyermek kezelésére, és 2000 vége óta a sajtóban megjelentek beszámolók a HSC-k azon képességéről, hogy különböző szövettípusú sejtekké differenciálódnak, ami potenciálisan bővíti klinikai alkalmazásuk körét. Kiderült azonban, hogy a transzplantációs anyag a HSC-kkel együtt jelentős számú, nem hematopoietikus sejtszennyeződést tartalmaz, amelyek különböző természetűek és tulajdonságokkal rendelkeznek. E tekintetben kidolgozzák a transzplantátum tisztítására szolgáló módszereket és a sejttisztaság értékelésére szolgáló kritériumokat. Különösen a CD34+ sejtek pozitív immunszelekcióját alkalmazzák, amely lehetővé teszi a HSC-k izolálását monoklonális antitestek segítségével.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Az őssejt-terápia szövődményei

A csontvelő-transzplantáció szövődményei leggyakrabban hematológiai jellegűek, és hosszú ideig tartó iatrogén pancitopéniával járnak. Leggyakrabban fertőzéses szövődmények, vérszegénység és vérzés alakul ki. E tekintetben rendkívül fontos a csontvelőgyűjtés, -feldolgozás és -tárolás optimális módjának kiválasztása az őssejtek maximális megőrzése érdekében, ami biztosítja a vérképzés gyors és stabil helyreállítását. A transzplantáció jellemzésekor jelenleg a következő paramétereket értékelik általában: a mononukleáris és/vagy magvas sejtek száma, a telepképző egységek száma és a CD34-pozitív sejtek tartalma. Sajnos ezek a mutatók csak közvetett értékelést nyújtanak a transzplantátum őssejt-populációjának valódi vérképző kapacitásáról. Napjainkban nincsenek abszolút pontos paraméterek annak meghatározására, hogy a transzplantáció elegendő-e a betegek vérképzésének hosszú távú helyreállításához, még autológ csontvelő-transzplantáció esetén is. Az általános kritériumok kidolgozása rendkívül nehéz a transzplantáció feldolgozására, krioprezerválására és vizsgálatára vonatkozó szigorú szabványok hiánya miatt. Ezenkívül figyelembe kell venni az egyes betegeknél a vérképzés sikeres helyreállításának paramétereit befolyásoló tényezők teljes skáláját. Az autológ csontvelő-transzplantáció során a legfontosabbak a korábbi kemoterápiás kúrák száma, a kondicionáló kezelés jellemzői, a betegség azon időszaka, amelyben a csontvelőt gyűjtötték, valamint a kolónia-stimuláló faktorok alkalmazásának módjai a transzplantáció utáni időszakban. Ezenkívül nem szabad elfelejteni, hogy a transzplantációs gyűjtést megelőző kemoterápia negatív hatással lehet a csontvelői őssejtekre.

Az allogén csontvelő-transzplantáció során jelentősen megnő a súlyos toxikus szövődmények előfordulása. E tekintetben érdekesek a talasszémiában végzett allogén csontvelő-transzplantációra vonatkozó statisztikai adatok. Az Európai Csontvelő-transzplantációs Csoport jelentései körülbelül 800 csontvelő-transzplantációt regisztráltak talasszémia majorban szenvedő betegeknél. A talasszémiában végzett allogén transzplantációt az esetek túlnyomó többségében HLA-azonos testvérektől végzik, ami súlyos szövődményekkel és magas mortalitással jár a részben kompatibilis rokon vagy kompatibilis, nem rokon donorokból származó őssejt-anyag átültetése során. A halálos kimenetelű fertőző szövődmények kockázatának minimalizálása érdekében a betegeket izolált, aszeptikus dobozokban helyezik el lamináris légáramlással, és alacsony vagy abakteriális diétát kapnak. A bél bakteriális dekontaminációjához per os nem felszívódó antibiotikum- és gombaellenes szereket írnak fel. Profilaxis céljából az amfotericin B-t intravénásan adják be. A szisztémás fertőzések megelőzését amikacinnal és ceftazidimmel erősítik, amelyeket a transzplantáció előtti napon írnak fel, és a kezelést a beteg elbocsátásáig folytatják. Minden vérkészítményt 30 Gy dózisban besugároznak a transzfúzió előtt. A parenterális táplálás a transzplantáció során szükséges feltétel, és közvetlenül a táplálékbevitel természetes módon történő korlátozása után kezdődik.

Az immunszuppresszív gyógyszerek magas toxicitásával számos szövődmény jár, amelyek gyakran hányingert, hányást és mukozitist, vesekárosodást és intersticiális tüdőgyulladást okoznak. A kemoterápia egyik legsúlyosabb szövődménye a máj veno-okkluzív betegsége, amely a transzplantáció utáni korai időszakban halálhoz vezet. A máj portális rendszerének vénáinak trombózisának kockázati tényezői közé tartozik a betegek életkora, a hepatitisz és a májfibrózis jelenléte, valamint a csontvelő-átültetés utáni immunszuppresszív terápia. A veno-okkluzív betegség különösen veszélyes talasszémiában, amelyet a máj hemosiderosisa, hepatitisz és fibrózis kísér - a transzfúziós terápia gyakori kísérői. A máj portális rendszerének vénáinak trombózisa a transzplantáció után 1-2 héttel alakul ki, és a vér bilirubin- és transzamináz-aktivitásának gyors növekedése, a hepatomegalia progressziója, az ascites, az encephalopathia és a has felső részén jelentkező fájdalom jellemzi. A szövettanilag a boncolási anyag endothelkárosodást, szubendotheliális vérzéseket, a centrilobuláris hepatociták károsodását, a máj venuláinak és központi vénáinak trombotikus elzáródását mutatja ki. Talasszémiás betegeknél leírtak citosztatikumok toxikus hatásaival összefüggő halálos szívmegállás eseteit.

A transzplantáció előtti időszakban a ciklofoszfamid és a buszulfán gyakran okoz toxikus-vérzéses húgyhólyaggyulladást, amely az uroepiteliális sejtek kóros elváltozásaival jár. A ciklosporin A csontvelő-transzplantációban történő alkalmazása gyakran nefro- és neurotoxicitással, magas vérnyomás szindrómával, folyadékretencióval és hepatocita-citolízissel jár. A szexuális és reproduktív diszfunkció gyakrabban fordul elő nőknél. Kisgyermekeknél a pubertásfejlődés általában nem érintett a transzplantáció után, de idősebb gyermekeknél a szexuális szféra fejlődésének patológiája nagyon súlyos lehet - akár a sterilitásig. A transzplantációval közvetlenül összefüggő szövődmények közé tartozik az allogén csontvelősejtek kilökődése, az ABO-inkompatibilitás, a graft-versus-host betegség akut és krónikus formái.

Az ABO-inkompatibilis csontvelő-transzplantáción átesett betegeknél a host-versus-ABO donor izoagglutinineket a transzplantáció után 330-605 napig termelik, ami elhúzódó hemolízishez vezethet, és drámaian megnövelheti a vérátömlesztés szükségességét. Ezt a szövődményt csak 0-as típusú vörösvértestek transzfúziójával előzik meg. A transzplantáció után egyes betegeknél autoimmun neutropenia, thrombocytopenia vagy pancitopénia jelentkezik, amelyek korrekciójához splenektómia szükséges.

A recipiensek 35-40%-ánál az allogén HLA-azonos csontvelő-transzplantációt követő 100 napon belül akut graft-versus-host betegség alakul ki. A bőr, a máj és a bélrendszer érintettségének mértéke a kiütéstől, hasmenéstől és mérsékelt hiperbilirubinémiától a bőr hámlásáig, bélelzáródásig és akut májelégtelenségig terjed. Talasszémiában szenvedő betegeknél az I. fokú akut graft-versus-host betegség előfordulása csontvelő-transzplantáció után 75%, a II. és magasabb fokúaknál pedig 11-53%. A krónikus graft-versus-host betegség, mint szisztémás többszervi szindróma, általában az allogén csontvelő-transzplantációt követő 100-500 napon belül alakul ki a betegek 30-50%-ánál. A bőr, a szájüreg, a máj, a szem, a nyelőcső és a felső légutak érintettek. Megkülönböztetjük a krónikus graft-versus-host betegség korlátozott formáját, amikor a bőr és/vagy a máj érintett, és a széles körben elterjedt formáját, amikor a generalizált bőrelváltozások krónikus agresszív hepatitisszel, a szem, a nyálmirigyek vagy bármely más szerv elváltozásaival kombinálódnak. A halált gyakran súlyos immunhiányból eredő fertőző szövődmények okozzák. Talasszémiában a krónikus graft-versus-host betegség enyhe formája az allogén HLA-kompatibilis csontvelőt kapók 12%-ánál, közepes formája 3%-ánál, súlyos formája pedig 0,9%-ánál fordul elő. A csontvelő-transzplantáció súlyos szövődménye a graft kilökődése, amely a műtét után 50-130 nappal alakul ki. A kilökődés gyakorisága a kondicionáló kezeléstől függ. Különösen a talasszémiában szenvedő betegeknél, akik az előkészítési időszakban csak metotrexátot kaptak, a csontvelő-transzplantáció kilökődését az esetek 26%-ában, metotrexát és ciklosporin A kombinációjával - az esetek 9%-ában, és csak ciklosporin A adagolásával - az esetek 8%-ában figyelték meg (Gaziev et al., 1995).

A csontvelő-transzplantáció utáni fertőző szövődményeket vírusok, baktériumok és gombák okozzák. Kialakulása a kemoterápiás gyógyszerek által a kondicionáló időszak alatt kiváltott mély neutropéniával, a citosztatikumok által okozott nyálkahártya-károsodással és a graft-versus-host reakcióval jár. A kialakulás idejétől függően a fertőző szövődményeknek három fázisa van. Az első fázisban (a transzplantáció utáni első hónapban alakul ki) a nyálkahártya-károsodás és a neutropenia dominál, amelyet gyakran vírusfertőzések (herpesz, Epstein-Barr vírus, citomegalovírus, Varicella zoster), valamint Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok, Candida gombák, aspergillusok okozta fertőzések kísérnek. A transzplantáció utáni korai időszakban (a transzplantáció utáni második és harmadik hónapban) a legsúlyosabb fertőzés a citomegalovírus, amely gyakran a fertőző szövődmények második fázisában lévő betegek halálához vezet. Talasszémiában a csontvelő-transzplantáció utáni citomegalovírus-fertőzés a recipiensek 1,7-4,4%-ánál alakul ki. A harmadik fázis a transzplantáció utáni késői időszakban (a műtét után három hónappal) figyelhető meg, és súlyos kombinált immunhiány jellemzi. Ebben az időszakban gyakoriak a Varicella zoster, a streptococcus, a Pneumocystis carinii, a Neisseria meningitidis, a Haemophilus influenzae és a hepatotrop vírusok okozta fertőzések. Talasszémiában a csontvelő-transzplantáció utáni betegek halálozása bakteriális és gombás szepszissel, idiopátiás intersticiális és citomegalovírus okozta tüdőgyulladással, akut légzési distressz szindrómával, akut szívelégtelenséggel, szívtamponáddal, agyvérzéssel, veno-okkluzív májbetegséggel és akut graft-versus-host betegséggel jár.

Jelenleg bizonyos sikereket értek el a vérképző őssejtek tiszta populációinak csontvelőből történő izolálására szolgáló módszerek fejlesztésében. Fejlesztették a köldökzsinórból történő magzati vér kinyerésének technikáját, és kidolgozták a vérképző sejtek köldökzsinórvérből történő izolálására szolgáló módszereket. A tudományos sajtóban megjelentek olyan jelentések, hogy a vérképző őssejtek képesek szaporodni, ha citokineket tartalmazó táptalajon tenyésztik őket. Ha speciálisan tervezett bioreaktorokat használnak a vérképző őssejtek tenyésztésére, a csontvelőből, perifériás vagy köldökzsinórvérből izolált vérképző őssejtek biomasszája jelentősen megnő. A vérképző őssejtek tenyésztésének lehetősége fontos lépés a sejttranszplantáció klinikai fejlesztése felé.

A hematopoietikus őssejtek in vitro szaporítása előtt azonban szükség van a hematopoietikus őssejtek homogén populációjának izolálására. Ezt általában olyan markerek segítségével érik el, amelyek lehetővé teszik a hematopoietikus őssejtek szelektív jelölését fluoreszcens vagy mágneses jelölőhöz kovalensen kötött monoklonális antitestekkel, és izolálásukat megfelelő sejtszortírozó segítségével. Ugyanakkor a hematopoietikus őssejtek fenotípusos jellemzőinek kérdése még nem oldódott meg véglegesen. A. Petrenko és V. Grishchenko (2003) a CD34, AC133 és Thyl antigénekkel rendelkező, CD38, HLA-DR vagy más differenciálódási markerekkel nem rendelkező sejteket (CD34+Liir fenotípusú sejtek) tekintik a hematopoietikus őssejtek jelöltjeinek. A leszármazási (Lin) markerek közé tartozik a glikoforin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). A CD34+CD45RalüW CD71low fenotípusú, valamint a CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low fenotípusú sejtek ígéretesnek tekinthetők transzplantációra.

A hatékony transzplantációhoz elegendő hematopoietikus őssejtek számának kérdése továbbra is problematikus. Jelenleg a hematopoietikus őssejtek forrásai a csontvelő, a perifériás és a köldökzsinórvér, valamint az embrionális máj. A hematopoietikus őssejtek szaporítását endothelsejtek és hematopoietikus növekedési faktorok jelenlétében történő tenyésztéssel érik el. Különböző protokollokban mieloproteineket, SCF-et, eritropoetint, inzulinszerű növekedési faktorokat, kortikoszteroidokat és ösztrogéneket használnak a HSC-proliferáció indukálására. Citokinek in vitro kombinációinak alkalmazása esetén jelentős növekedés érhető el a HSC-készletben, a termelés csúcspontja a tenyésztés második hetének végén jelentkezik.

Hagyományosan a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejt-transzplantációt főként hemoblasztózisok esetén alkalmazzák. A sikeres köldökzsinórvér-transzplantációhoz szükséges minimális hematopoietikus sejtadag azonban 3,7 x 107 ^magvas sejt testtömegkilogrammonként. Kisebb számú köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejt alkalmazása jelentősen növeli a transzplantátum elégtelenségének és a betegség kiújulásának kockázatát. Ezért a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejt-transzplantációt főként gyermekek hemoblasztózisainak kezelésére alkalmazzák.

Sajnos még mindig nincsenek szabványok a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek beszerzésére vagy szabványosított protokolljai a klinikai felhasználásukra. Ennek megfelelően a köldökzsinórvérből származó őssejtek maguk nem minősülnek jogilag elismert hematopoietikus sejtforrásnak transzplantációhoz. Ezenkívül nincsenek etikai vagy jogi normák a köldökzsinórvérbankok tevékenységére és szervezetére vonatkozóan, amelyek külföldön léteznének. Eközben a biztonságos transzplantáció érdekében minden köldökzsinórvérmintát gondosan ellenőrizni kell. A várandós nőtől történő vérvétel előtt be kell szerezni a beleegyezését. Minden várandós nőt meg kell vizsgálni HBsAg hordozásra, hepatitis C, HIV és szifilisz vírusok elleni antitestek jelenlétére. Minden köldökzsinórvérmintát standardként meg kell vizsgálni a magvas sejtek számának, a CD34+ és a telepképző kapacitás szempontjából. Ezenkívül elvégezik a HbA1c tipizálását, a vércsoport meghatározását ABO alapján és a Rh-faktor szerinti hovatartozás meghatározását. A szükséges vizsgálati eljárások a bakteriológiai tenyésztés a sterilitás szempontjából, valamint szerológiai vizsgálat HIV-1 és HIV-2 fertőzések, HBsAg, vírusos hepatitis C, citomegalovírus fertőzés, HTLY-1 és HTLY-II, szifilisz és toxoplazmózis kimutatására. Ezenkívül polimeráz láncreakciót is végeznek a citomegalovírus és a HIV-fertőzések kimutatására. Célszerűnek tűnik a vizsgálati protokollokat kiegészíteni a köldökzsinórvérből származó GSC elemzésével olyan genetikai betegségek kimutatására, mint az α-talasszémia, a sarlósejtes vérszegénység, az adenozin-deamináz-hiány, a Bruton-agammaglobulinémia, a Hurler- és a Ponter-betegség.

A transzplantációra való felkészülés következő szakasza a vérképző őssejtek megőrzésének kérdése. A sejtek életképességére nézve a legveszélyesebb eljárások az előkészítésük során a fagyasztás és a felolvasztás. A vérképző sejtek fagyasztásakor jelentős részük kristályképződés miatt elpusztulhat. Speciális anyagokat - krioprotektorokat - alkalmaznak a sejthalál százalékos arányának csökkentésére. Leggyakrabban a DMSO-t használják krioprotektorként 10%-os végkoncentrációban. Az ilyen koncentrációjú DMSO-t azonban közvetlen citotoxikus hatás jellemzi, amely minimális expozíció esetén is megnyilvánul. A citotoxikus hatás csökkenését az expozíciós mód nulla hőmérsékletének szigorú betartásával, valamint az anyag felolvasztás alatti és utáni feldolgozására vonatkozó előírások betartásával (minden manipuláció sebessége, többszöri mosási eljárás alkalmazása) érik el. 5%-nál kisebb DMSO-koncentrációkat nem szabad használni, mivel ez a vérképző sejtek tömeges pusztulását okozza a fagyasztás ideje alatt.

A vérképző őssejtek szuszpenziós keverékében található eritrocita szennyeződések jelenléte inkompatibilitási reakció kialakulásának kockázatát hordozza magában az eritrocita antigénekkel szemben. Ugyanakkor, amikor az eritrociták eltávolításra kerülnek, a vérképző sejtek elvesztése jelentősen megnő. E tekintetben a vérképző őssejtek frakcionálatlan izolálásának módszerét javasolták. Ebben az esetben 10%-os DMSO-oldatot és állandó sebességű (GS/perc) hűtést alkalmaznak -80°C-ra, hogy megvédjék a magvas sejteket az alacsony hőmérséklet káros hatásaitól, majd a sejtszuszpenziót folyékony nitrogénben fagyasztják le. Úgy vélik, hogy ez a krioprezervációs módszer az eritrociták részleges lízisét eredményezi, így a vérminták nem igényelnek frakcionálást. A transzplantáció előtt a sejtszuszpenziót kiolvasztják, a szabad hemoglobintól és a DMSO-tól humán albumin oldatban vagy vérszérumban mossák. A vérképző prekurzorok tartósítása ezzel a módszerrel valóban magasabb, mint a köldökzsinórvér frakcionálása után, de az ABO-inkompatibilis eritrociták transzfúziója miatti transzfúziós szövődmények kockázata továbbra is fennáll.

Egy HLA-tesztelt és tipizált HSC-minták tárolására szolgáló banki rendszer létrehozása megoldhatná a fenti problémákat. Ehhez azonban etikai és jogi normák kidolgozása szükséges, amelyek jelenleg csak megvitatás alatt állnak. Egy banki hálózat létrehozása előtt számos szabályozást és dokumentumot kell elfogadni a HSC-k gyűjtésére, frakcionálására, tesztelésére és tipizálására, valamint krioprezerválására vonatkozó eljárások szabványosításáról. A HSC-bankok hatékony működésének kötelező feltétele egy számítógépes bázis megszervezése a Világcsontvelő-donorok Szövetségének (WMDA) és az Egyesült Államok Nemzeti Csontvelő-donor Programjának (NMDP) nyilvántartásaival való interakcióhoz.

Ezenkívül optimalizálni és szabványosítani kell az in vitro HSC-tágítás módszereit, elsősorban a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek esetében. A köldökzsinórvérből származó HSC-k tágítása szükséges a HLA-rendszerrel kompatibilis potenciális recipiensek számának növelése érdekében. A köldökzsinórvér kis térfogata miatt a benne található HSC-k száma általában nem képes biztosítani a csontvelő repopulációját felnőtt betegeknél. Ugyanakkor a nem rokon transzplantációk elvégzéséhez elegendő számú, tipizált HSC-mintához kell hozzáférni (recipiensenként 10 000-től 1 500 000-ig).

A hematopoietikus őssejtek átültetése nem szünteti meg a csontvelő-átültetéssel járó szövődményeket. Az elemzések azt mutatják, hogy a köldökzsinórvérből származó őssejt-átültetés után a recipiensek 23%-ánál súlyos akut graft-versus-host betegség, 25%-ánál pedig krónikus formák alakulnak ki. Onkohematológiai betegeknél az esetek 26%-ában figyelhető meg az akut leukémia relapszusa a köldökzsinórvérből származó őssejt-átültetést követő első évben.

Az utóbbi években intenzíven fejlődnek a perifériás hematopoietikus őssejtek transzplantációs módszerei. A HSC-k tartalma a perifériás vérben olyan kicsi (1 HSC 100 000 vérsejtenként), hogy izolálásuk speciális előkészítés nélkül nem értelmes. Ezért a donor először gyógyszeres stimulációt kap a csontvelő hematopoietikus sejtjeinek a vérbe történő felszabadulására. Erre a célra olyan korántsem ártalmatlan gyógyszereket alkalmaznak, mint a ciklofoszfamid és a granulocita-kolónia stimuláló faktor. De még a HSC perifériás vérbe történő mobilizálásának eljárása után is a CD34+ sejtek tartalma nem haladja meg az 1,6%-ot.

A hematopoietikus őssejtek klinikai mobilizálására leggyakrabban az S-SEC-et alkalmazzák, amelyet viszonylag jó tolerancia jellemez, kivéve a csontfájdalom szinte természetes előfordulását. Meg kell jegyezni, hogy a modern vérszeparátorok használata lehetővé teszi a hematopoietikus őssejtek hatékony izolálását. Normál vérképzési körülmények között azonban legalább 6 eljárást kell elvégezni ahhoz, hogy elegendő számú, a csontvelő-szuszpenzióhoz hasonló repopulációs kapacitású hematopoietikus őssejtet kapjunk. Minden ilyen eljáráshoz 10-12 liter vér feldolgozására van szükség a szeparátoron, ami trombocitopéniát és leukopéniát okozhat. Az elválasztási eljárás során antikoagulánst (nátrium-citrátot) juttatnak a donorba, ami azonban nem zárja ki a vérlemezkék kontakt aktiválódását az extrakorporális centrifugálás során. Ezek a tényezők megteremtik a feltételeket a fertőző és vérzéses szövődmények kialakulásához. A módszer további hátránya a mobilizációs válasz jelentős változékonysága, ami megköveteli a donorok perifériás vérében lévő HSC-k tartalmának monitorozását, ami szükséges a maximális szintjük meghatározásához.

A hematopoietikus őssejtek autogén transzplantációja, ellentétben az allogén transzplantációval, teljesen kiküszöböli a kilökődési reakció kialakulását. A hematopoietikus őssejtek autotranszplantációjának jelentős hátránya azonban, amely korlátozza a megvalósításának indikációinak körét, a leukémiás klónsejtek transzplantációval történő reinfúziójának nagy valószínűsége. Ezenkívül az immunközvetített „graft versus tumor” hatás hiánya jelentősen növeli a rosszindulatú vérképzőszervi betegségek kiújulásának gyakoriságát. Ezért a mielodiszpláziás szindrómákban a neoplasztikus klonális vérképzés kiküszöbölésére és a normális poliklonális vérképzés helyreállítására szolgáló egyetlen radikális módszer továbbra is az allogén vérképzés transzplantációjával végzett intenzív polikemoterápia.

De még ebben az esetben is a legtöbb hemoblasztózis kezelése csak a betegek túlélési idejének növelésére és életminőségük javítására irányul. Számos nagyszabású tanulmány szerint a HSC-k allotranszplantációja utáni hosszú távú relapszusmentes túlélést az onkohematológiai betegek 40%-ánál érik el. HLA-kompatibilis testvér őssejtjeinek felhasználásával a legjobb eredményeket a betegség rövid kórtörténetével, akár 10%-os blasztsejtszámmal és kedvező citogenetikával rendelkező fiatal betegeknél figyelik meg. Sajnos a mielodiszpláziás betegségekben szenvedő betegeknél a HSC-k allotranszplantációs eljárásával kapcsolatos halálozási arány továbbra is magas (a legtöbb jelentésben - körülbelül 40%). Az Egyesült Államokbeli Nemzeti Csontvelődonor Program 10 éves munkájának eredményei (510 beteg, medián életkor - 38 év) azt mutatják, hogy a kétéves relapszusmentes túlélés 29%, a relapszus valószínűsége viszonylag alacsony (14%). A nem rokon donortól származó HSC-k allotranszplantációs eljárásával kapcsolatos halálozási arány azonban rendkívül magas, és két év alatt eléri az 54%-ot. Hasonló eredményeket kaptak egy európai vizsgálatban (118 beteg, medián életkor - 24 év, kétéves relapszusmentes túlélés - 28%, relapszus - 35%, mortalitás - 58%).

Az intenzív kemoterápiás kúrák során, melyek során allogén hematopoietikus sejtekkel helyreállítják a vérképzést, gyakran előfordulnak immunhematológiai és transzfúziós szövődmények. Ezek nagyrészt annak tudhatók be, hogy az emberi vércsoportok az MHC molekuláktól függetlenül öröklődnek. Ezért, még ha a donor és a recipiens kompatibilis is a fő HLA antigénekkel, eritrocitáik fenotípusa eltérő lehet. Különbséget tesznek a „súlyos” inkompatibilitás között, amikor a recipiensnek már meglévő antitestjei vannak a donor eritrocita antigénjei ellen, és a „kisebb” inkompatibilitás között, amikor a donornak antitestjei vannak a recipiens eritrocita antigénjei ellen. Előfordulhat a „súlyos” és a „kisebb” inkompatibilitás kombinációja is.

A csontvelő és a köldökzsinórvér hematopoietikus őssejtek allotranszplantációjának klinikai hatékonyságát vizsgáló összehasonlító elemzés eredményei hemoblasztózisokban azt mutatják, hogy a köldökzsinórvér hematopoietikus őssejtek allotranszplantációja utáni gyermekeknél a graft-versus-host reakció kialakulásának kockázata jelentősen csökken, de a neutrofilek és a vérlemezkék számának helyreállása hosszabb időt vesz igénybe, a transzplantáció utáni 100. napos mortalitás magasabb előfordulásával.

A korai halálozás okainak vizsgálata lehetővé tette az allogén HSC-transzplantáció ellenjavallatainak tisztázását, amelyek közül a legfontosabbak a következők:

• a citomegalovírus-fertőzés pozitív tesztjeinek jelenléte a recipiensben vagy a donorban (megelőző kezelés nélkül);
• akut sugárbetegség;
• a betegben gombás fertőzés jelenléte vagy akár gyanúja (szisztémás korai profilaxis nélkül fungicid szerekkel);
• hemoblasztózisok, amelyekben a betegek hosszú távú citosztatikum-kezelést kaptak (a hirtelen szívmegállás és a többszörös szerv elégtelenség nagy valószínűsége miatt);
• HLA-val nem azonos donorokból történő transzplantáció (akut graft-versus-host reakció ciklosporin A-val történő profilaxisa nélkül);
• krónikus vírusos hepatitis C (a máj veno-okklúziós betegségének kialakulásának magas kockázata miatt).

Így a HSC-transzplantáció súlyos szövődményeket okozhat, amelyek gyakran halálhoz vezetnek. A korai (transzplantációt követő 100. napon belüli) időszakban ezek közé tartoznak a fertőzéses szövődmények, az akut graft-versus-host betegség, a graft kilökődése (a donor HSC-k elégtelensége), a veno-okkluzív májbetegség, valamint a kondicionáló kezelés toxicitása okozta szövetkárosodás, amelyet magas átépülési arány jellemez (bőr, érrendszeri endotélium, bélhám). A késői poszttranszplantációs időszak szövődményei közé tartozik a krónikus graft-versus-host betegség, az alapbetegség relapszusai, gyermekeknél a növekedési retardáció, a reproduktív rendszer és a pajzsmirigy diszfunkciója, valamint a szemkárosodás.

Az utóbbi időben, a csontvelősejtek plaszticitásáról szóló publikációk kapcsán felmerült a HSC-k (vérkeringési őssejtek) szívrohamok és más betegségek kezelésében való alkalmazásának gondolata. Bár egyes állatkísérletek alátámasztják ezt a lehetőséget, a csontvelősejtek plaszticitására vonatkozó következtetéseket meg kell erősíteni. Ezt a körülményt azoknak a kutatóknak figyelembe kell venniük, akik úgy vélik, hogy az átültetett emberi csontvelősejtek könnyen átalakulnak vázizom-, szívizom- vagy központi idegrendszeri sejtekké. Az a hipotézis, miszerint a HSC-k természetes sejtes forrásai ezen szervek regenerációjának, komoly bizonyítékokat igényel.

Különösen V. Belenkov (2003) nyílt, randomizált vizsgálatának első eredményeit publikálták. A vizsgálat célja a C-SvK (azaz az autológ HSC-k vérbe juttatásának) hatásának vizsgálata volt közepesen súlyos vagy súlyos krónikus szívelégtelenségben szenvedő betegek klinikai, hemodinamikai és neurohumorális állapotára, valamint biztonságosságának értékelése a standard terápia (angiotenzin-konvertáló enzim inhibitorok, béta-blokkolók, diuretikumok, szívglikozidok) hátterében. A vizsgálat eredményeinek első publikációjában a program szerzői megjegyzik, hogy az O-SvK mellett szóló egyetlen érv egy beteg kezelésének eredménye, akinél a gyógyszerrel végzett terápia során minden klinikai és hemodinamikai paraméterben vitathatatlan javulás volt megfigyelhető. Azonban a HSC-k véráramba történő mobilizációjának és a miokardiális regenerációnak az infarktus utáni zónában történő elméletét nem erősítették meg - még egy pozitív klinikai dinamikájú betegnél sem mutatkozott meg életképes szívizom zónák megjelenése a hegterületen, a dobutaminnal végzett terheléses echokardiográfia során.

Meg kell jegyezni, hogy jelenleg egyértelműen nem áll rendelkezésre elegendő adat ahhoz, hogy a sejtpótló terápiát széles körben a mindennapi klinikai gyakorlatban javasolhassuk. Jól megtervezett és magas színvonalú klinikai vizsgálatokra van szükség a regeneratív sejtterápia különböző lehetőségeinek hatékonyságának meghatározásához, indikációk és ellenjavallatok kidolgozásához, valamint a regeneratív-plasztikai terápia és a hagyományos sebészeti vagy konzervatív kezelés kombinált alkalmazására vonatkozó irányelvek kidolgozásához. Továbbra sincs válasz arra a kérdésre, hogy a csontvelői sejtek melyik konkrét populációja (hematopoietikus őssejt vagy stromális) képes neuronokat és szívizomsejteket létrehozni, és az sem világos, hogy milyen körülmények járulnak hozzá ehhez in vivo.

Számos országban folynak munkálatok ezeken a területeken. Az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézeteinek akut májelégtelenségről szóló szimpóziumának összefoglalójában a májtranszplantáció mellett az ígéretes kezelési módszerek között említik a xeno- vagy allogén hepatociták átültetését, valamint a bioreaktorok májsejtekkel való extrakorporális összekapcsolását. Közvetlen bizonyítékok vannak arra, hogy csak az idegen funkcionálisan aktív hepatociták képesek hatékonyan támogatni a recipiens máját. Az izolált hepatociták klinikai felhasználásához sejtbankot kell létrehozni, amely jelentősen csökkenti a sejtek izolálása és felhasználása között eltelt időt. Az izolált hepatociták bankjának létrehozásának legelfogadhatóbb módja a májsejtek folyékony nitrogénben történő krioprezervációja. Az ilyen sejtek akut és krónikus májelégtelenségben szenvedő betegek klinikumában történő alkalmazásakor meglehetősen magas terápiás hatást mutattak ki.

A májsejt-transzplantáció optimista és biztató eredményei ellenére a kísérletekben és a klinikai gyakorlatban még mindig számos probléma van, amelyek messze vannak a megoldástól. Ezek közé tartozik az izolált hepatociták kinyerésére alkalmas szervek korlátozott száma, az izolálásukra szolgáló nem kellően hatékony módszerek, a májsejtek tartósítására szolgáló szabványosított módszerek hiánya, a transzplantált sejtek növekedésének és proliferációjának szabályozására vonatkozó mechanizmusokkal kapcsolatos homályos elképzelések, valamint az allogén hepatociták beágyazódásának vagy kilökődésének értékelésére szolgáló megfelelő módszerek hiánya. Ide tartozik a transzplantációs immunitás jelenléte allogén és xenogén sejtek alkalmazásakor is, bár kisebb, mint az ortotopikus májtranszplantációnál, de immunszuppresszánsok alkalmazását, az izolált hepatociták kapszulázását vagy enzimekkel történő speciális kezelését igényli. A hepatocita-transzplantáció gyakran immunkonfliktushoz vezet a recipiens és a donor között kilökődési reakció formájában, ami citosztatikumok alkalmazását igényli. Ennek a problémának az egyik megoldása lehet a polimer mikroporózus hordozók alkalmazása a májsejtek izolálására, ami javítja túlélésüket, mivel a kapszulamembrán hatékonyan védi a hepatocitákat a gazdaszervezet immunizálása ellenére.

Akut májelégtelenség esetén azonban az ilyen hepatocita-transzplantáció hatástalan, mivel a májsejteknek viszonylag hosszú időre van szükségük ahhoz, hogy új környezetbe kerüljenek és elérjék az optimális működés szakaszát. Potenciális korlátozás az epe szekréciója az izolált hepatociták ektopikus transzplantációja során, és bioreaktorok használatakor jelentős fiziológiai akadályt jelent az emberi fehérjék és a xenogén hepatociták által termelt fehérjék közötti faji eltérés.

Az irodalomban beszámolnak arról, hogy a csontvelői stromális őssejtek lokális átültetése elősegíti a csontdefektusok hatékony korrekcióját, és a csontszövet helyreállítása ebben az esetben intenzívebben zajlik, mint a spontán reparatív regeneráció esetén. Számos preklinikai vizsgálat kísérleti modelleken meggyőzően bizonyítja a csontvelői stromális sejttranszplantációk ortopédiában való alkalmazásának lehetőségét, bár további munkára van szükség ezen módszerek optimalizálásához, még a legegyszerűbb esetekben is. Különösen az oszteogén stromális sejtek ex vivo terjeszkedésének optimális feltételeit még nem találták meg, és ideális hordozójuk (mátrix) szerkezete és összetétele továbbra sem alakult ki. A térfogati csontregenerációhoz szükséges minimális sejtszámot még nem határozták meg.

Bizonyított, hogy a mezenchimális őssejtek transzgermális plaszticitást mutatnak, azaz képesek olyan sejttípusokká differenciálódni, amelyek fenotípusosan nem állnak kapcsolatban az eredeti sejtvonal sejtjeivel. Optimális tenyésztési körülmények között a poliklonális csontvelői stromális őssejtvonalak több mint 50 osztódást képesek elviselni in vitro, ami lehetővé teszi, hogy 1 ml csontvelő-aspirátumból több milliárd stromális sejtet nyerjenek. A mezenchimális őssejtek populációja azonban heterogén, ami mind a telepek méretének változékonyságában, mind képződésük eltérő sebességében, mind a sejttípusok morfológiai sokféleségében nyilvánul meg, a fibroblasztszerű orsó alakúaktól a nagy lapos sejtekig. A fenotípusos heterogenitás már 3 hét stromális őssejt-tenyésztés után megfigyelhető: egyes telepek csontszövet-csomókat, mások zsírsejt-csoportokat, ritkábban pedig porcszövet-szigeteket alkotnak.

Az embrionális idegszövet átültetését kezdetben a központi idegrendszer degeneratív betegségeinek kezelésére alkalmazták. Az utóbbi években az embrionális agyszövet helyett idegi őssejtekből nyert neuroszférák sejtes elemeit ültették át (Poltavtseva, 2001). A neuroszférák elkötelezett neuron- és neuroglia-prekurzorokat tartalmaznak, ami reményt ad az elvesztett agyi funkciók helyreállítására átültetésük után. A diszpergált neuroszféra-sejtek patkányagy striatum régiójába történő átültetése után megfigyelték azok proliferációját és dopaminerg neuronokká történő differenciálódását, ami megszüntette a motoros aszimmetriát kísérletes hemiparkinsonizmusban szenvedő patkányokban. Egyes esetekben azonban neuroszféra-sejtekből tumorok fejlődtek ki, ami az állatok pusztulásához vezetett (Bjorklund, 2002).

A klinikán két betegcsoport gondos vizsgálata – melyek során sem a betegek, sem az őket megfigyelő orvosok nem tudták (kettős vak vizsgálat), hogy az egyik betegcsoportba dopamint termelő neuronokat tartalmazó embrionális szövetet ültettek át, a második betegcsoportba pedig ál-műtétet végeztek – váratlan eredményeket hozott. Azok a betegek, akikbe embrionális idegszövetet ültettek át, nem érezték magukat jobban, mint a kontrollcsoportban lévő betegek. Ezenkívül a 33 betegből 5-nél 2 évvel az embrionális idegszövet átültetése után perzisztáló diszkinézia alakult ki, amely a kontrollcsoportban lévő betegeknél nem volt jelen (Őssejtek: tudományos fejlődés és jövőbeli kutatási irányok. Nat. Inst, of Health. USA). Az agy idegi őssejtjeinek klinikai kutatásának egyik megoldatlan problémája továbbra is a származékaik átültetésének valós kilátásai és korlátai elemzése a központi idegrendszeri rendellenességek korrekciója érdekében. Lehetséges, hogy a hippocampusban a hosszan tartó görcsrohamok által kiváltott neuronogenezis, amely a strukturális és funkcionális átszerveződéséhez vezet, tényező lehet az epilepszia progresszív kialakulásában. Ez a következtetés külön figyelmet érdemel, mivel rámutat az új neuronok érett agyban történő keletkezésének és az általuk kialakuló aberráns szinaptikus kapcsolatok lehetséges negatív következményeire.

Nem szabad elfelejteni, hogy a citokineket (mitogéneket) tartalmazó táptalajon történő tenyésztés közelebb hozza az őssejtek tulajdonságait a tumorsejtekéhez, mivel hasonló változások mennek végbe a sejtciklusok szabályozásában, meghatározva a korlátlan osztódás képességét. Meggondolatlan dolog az embrionális őssejtek korai származékait emberbe átültetni, mivel ebben az esetben nagyon magas a rosszindulatú daganatok kialakulásának veszélye. Sokkal biztonságosabb az elkötelezettebb utódaikat, azaz a differenciálódott vonalak prekurzor sejtjeit használni. Jelenleg azonban még nem fejlesztettek ki megbízható technikát a kívánt irányba differenciálódó stabil emberi sejtvonalak előállítására.

A molekuláris biológiai technológiák alkalmazása az örökletes patológiák és az emberi betegségek korrekciójára az őssejtek módosításával nagy érdeklődésre tart számot a gyakorlati orvoslás számára. Az őssejt-genom jellemzői lehetővé teszik egyedi transzplantációs sémák kidolgozását a genetikai betegségek korrekciójára. Azonban számos korlátozás van ezen a területen, amelyeket le kell küzdeni az őssejt-géntechnológia gyakorlati alkalmazása előtt. Először is optimalizálni kell az őssejt-genom ex vivo módosításának folyamatát. Ismert, hogy az őssejtek hosszú távú (3-4 hetes) proliferációja csökkenti transzfekciójukat, ezért több transzfekciós ciklus szükséges a genetikai módosításuk magas szintjének eléréséhez. A fő probléma azonban a terápiás génexpresszió időtartamával kapcsolatos. Eddig egyetlen vizsgálatban sem haladta meg a módosított sejtek transzplantációja utáni hatékony expresszió időtartama a négy hónapot. Az esetek 100%-ában az idő múlásával a transzfektált gének expressziója csökken a promóterek inaktiválása és/vagy a módosított genommal rendelkező sejtek pusztulása miatt.

Fontos kérdés a sejttechnológiák orvosi alkalmazásának költségei. Például egy olyan csontvelő-transzplantációs egység orvosi költségeinek finanszírozására szolgáló becsült éves igény, amelyet évi 50 transzplantáció elvégzésére terveztek, körülbelül 900 000 USD.

A sejttechnológiák fejlesztése a klinikai orvoslásban egy összetett és többlépcsős folyamat, amely konstruktív együttműködést foglal magában a multidiszciplináris tudományos és klinikai központok, valamint a nemzetközi közösség között. Ugyanakkor a sejtterápia területén végzett kutatások tudományos szervezésének kérdései különös figyelmet igényelnek. Ezek közül a legfontosabbak a klinikai kutatási protokollok kidolgozása, a klinikai adatok megbízhatóságának ellenőrzése, a nemzeti tanulmányi nyilvántartás létrehozása, a multicentrikus klinikai vizsgálatok nemzetközi programokba való integrációja és az eredmények klinikai gyakorlatba való átültetése.

A sejttranszplantáció problémáinak bevezetésének zárásaként szeretném kifejezni reményemet, hogy a tudomány különböző területeiről érkező vezető ukrán szakemberek erőfeszítéseinek egyesítése jelentős előrelépést biztosít a kísérleti és klinikai kutatásokban, és lehetővé teszi az elkövetkező években, hogy hatékony módszereket találjunk a szerv-, szövet- és sejtátültetésre szoruló súlyos betegek megsegítésére.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]