A sárgatest vérképző őssejtjei

Nyilvánvaló, hogy a hematopoietikus őssejtek különféle proliferációs és differenciálódási potenciáljait ontogenetikus fejlődésük sajátosságai határozzák meg, mivel az emberben az ontogenezis során még a vérképzés fő területeinek lokalizációja is megváltozik. A magzati petezsák hematopoietikus progenitor sejtjei kizárólag eritropoietikus sejtvonal képzésére kötelezik el magukat. Az elsődleges HSC-knek a májba és a lépbe történő migrációja után az elkötelezettségi vonalak spektruma kibővül ezen szervek mikro-környezetében. Különösen a hematopoietikus őssejtek szereznek képességet limfoid eredetű sejtek létrehozására. A prenatális időszakban a hematopoietikus progenitor sejtek elérik a végső lokalizáció zónáját, és benépesítik a csontvelőt. Az intrauterin fejlődés során a magzati vér jelentős számú hematopoietikus őssejtet tartalmaz. Például a terhesség 13. hetében a HSC-szint eléri a mononukleáris vérsejtek teljes számának 18%-át. Ezt követően tartalmuk fokozatos csökkenése figyelhető meg, de már a születés előtt is a köldökzsinórvérben lévő HSC-k mennyisége alig különbözik a csontvelőben lévő mennyiségüktől.

A klasszikus elképzelések szerint az emlősök embrionális fejlődése során a vérképzés lokalizációjának természetes változását a pluripotens vérképző őssejtek migrációja és új mikro-környezetbe történő bejuttatása végzi - a szikzacskóból a májba, a lépbe és a csontvelőbe. Mivel az embrionális fejlődés korai szakaszában a vérképző szövet nagyszámú őssejtet tartalmaz, amelyek száma a magzat érésével csökken, a vérképző őssejtek kinyerésére a legígéretesebbnek az embrionális máj vérképző szövetét tekintik, amelyet az 5-8. terhességi héten abortált anyagból izolálnak.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Kérdések a hematopoietikus őssejtek eredetéről

Kétségtelen, hogy az eritrociták embrionális képződése a szikzacskó vérszigeteiben indul ki. A szikzacskó vérképző sejtjeinek in vitro differenciálódási potenciálja azonban nagyon korlátozott (főként eritrocitákká differenciálódnak). Meg kell jegyezni, hogy a szikzacskó vérképző őssejtjeinek átültetése hosszú ideig nem képes helyreállítani a vérképzést. Kiderült, hogy ezek a sejtek nem a felnőttkori HSC-k prekurzorai. Az igazi HSC-k korábban, az intrauterin fejlődés 3-5. hetében jelennek meg, a gyomorszövet és az erek endotéliumának képződési zónájában (paraaortikus splanchnopleura, P-SP), valamint az aorta, az ivarmirigyek és az elsődleges vesék helyén - a mezonefroszban vagy az úgynevezett AGM régióban. Kimutatták, hogy az AGM régió sejtjei nemcsak a HSC-k, hanem az erek endotélsejtjeinek, valamint a csontképződési folyamatokban részt vevő oszteoklasztoknak is forrásai. A terhesség 6. hetében az AGM régió korai vérképző progenitor sejtjei a májba vándorolnak, amely a születésig a magzat fő vérképző szerve marad.

Mivel ez a pont rendkívül fontos a sejtátültetés szempontjából, a HSC-k eredetének problémája az emberi embriogenezis folyamatában részletesebb bemutatást érdemel. A klasszikus elképzelések, miszerint az emlősök és madarak vérképző őssejtjei extraembrionális forrásból származnak, Metcalf és Moore tanulmányain alapulnak, akik elsőként alkalmazták a HSC-k és a petezsákból izolált leszármazottaik klónozásának módszereit. Munkájuk eredményei szolgáltak a migrációs elmélet alapjául, amely szerint a petezsákban először megjelenő HSC-k egymást követően benépesítik az átmeneti és a végleges vérképző szerveket, ahogy a megfelelő mikro-környezet kialakul bennük. Így alakult ki az a nézet, hogy a petezsákban kezdetben lokalizálódó HSC-k keletkezése a végleges vérképzés sejtes alapjaként szolgál.

A szikzacskóból származó hematopoietikus progenitor sejtek a legkorábbi hematopoietikus progenitor sejtek kategóriájába tartoznak. Fenotípusukat az AA4.1+CD34+c-kit+ képlet írja le. Az érett csontvelői HSC-kkel ellentétben nem expresszálnak Sca-1 antigéneket és MHC molekulákat. Úgy tűnik, hogy a marker antigének megjelenése a szikzacskó HSC-k felszíni membránjain a tenyésztés során megfelel az embrionális fejlődés során bekövetkező differenciálódásuknak, elkötelezett hematopoietikus vonalak kialakulásával: a CD34 és Thy-1 antigén expressziójának szintje csökken, a CD38 és CD45RA expressziója növekszik, és megjelennek a HLA-DR molekulák. A citokinek és növekedési faktorok által indukált ezt követő in vitro specializációval megkezdődik egy adott sejtvonal hematopoietikus progenitor sejtjeire specifikus antigének expressziója. Azonban a gerincesek három osztályának (kétéltűek, madarak és emlősök) képviselőiben az embrionális hematopoiesis vizsgálatának eredményei, és különösen a posztnatális ontogenezisben a végleges hematopoiesisért felelős HSC-k eredetének elemzése ellentmond a klasszikus elképzeléseknek. Megállapították, hogy az összes vizsgált osztály képviselőiben az embriogenezis során két független régió alakul ki, amelyekben a HSC-k keletkeznek. Az extraembrionális „klasszikus” régiót a szikzacskó vagy annak analógjai képviselik, míg a HSC lokalizációjának nemrégiben azonosított intraembrionális zónája magában foglalja a paraaortikus mesenchymát és az AGM régiót. Ma már azzal érvelhetünk, hogy kétéltűekben és madarakban a definitív HSC-k intraembrionális forrásokból származnak, míg emlősökben és emberekben a szikzacskó HSC-k részvétele a definitív vérképzésben még nem zárható ki teljesen.

A petehártyában történő embrionális vérképzés valójában primer eritropoézis, amelyet a sejtmag megőrzése jellemez az eritrocita-érés minden szakaszában, valamint a magzati típusú hemoglobin szintézise. A legújabb adatok szerint a primer eritropoézis hulláma a petehártyában az embrionális fejlődés 8. napján ér véget. Ezt követi a definitív eritroid progenitor sejtek - BFU-E - felhalmozódásának időszaka, amelyek kizárólag a petehártyában képződnek, és először a terhesség 9. napján jelennek meg. Az embriogenezis következő szakaszában már kialakultak a definitív eritroid progenitor sejtek - CFU-E, valamint a(z!) hízósejtek és a CFU-GM. Ez az alapja annak a nézetnek, hogy a definitív progenitor sejtek a petehártyában keletkeznek, a vérárammal vándorolnak, a májban telepednek le, és gyorsan megkezdik az intraembrionális vérképzés első fázisát. Ezen elképzelések szerint a szikzacskó egyrészt az elsődleges eritropoézis helyszínének, másrészt az embrionális fejlődésben a végleges hematopoietikus progenitor sejtek első forrásának tekinthető.

Kimutatták, hogy a szikzacskóból már a vemhesség 8. napján, azaz jóval az embrió és a szikzacskó érrendszerének lezáródása előtt izolálhatók nagy proliferációs potenciállal rendelkező telepképző sejtek. Ezenkívül a szikzacskóból in vitro nyert nagy proliferációs potenciállal rendelkező sejtek olyan telepeket alkotnak, amelyek mérete és sejtösszetétele nem tér el a csontvelői őssejtek tenyésztett növekedésének megfelelő paramétereitől. Ugyanakkor a szikzacskó nagy proliferációs potenciálú telepképző sejtjeinek újratranszplantációjakor szignifikánsan több leány telepképző sejt és multipotens progenitor sejt képződik, mint a vérképzés csontvelői progenitor sejtjeinek alkalmazásakor.

A szikzacskó vérképző őssejtek szerepéről a definitív vérképzésben végső következtetést vonhatnak le azok a munkák eredményei, amelyekben a szerzők egy szikzacskó endotélsejtvonalat (G166) nyertek, amely hatékonyan támogatta a HSC-k fenotípusos és funkcionális jellemzőivel (AA4.1+WGA+, alacsony sűrűség és gyenge adhéziós tulajdonságok) rendelkező sejtjeinek proliferációját. Ez utóbbiak tartalma több mint 100-szorosára nőtt, amikor 8 napig C166 sejtek tápláló rétegén tenyésztették. Makrofágokat, granulocitákat, megakariocitákat, blasztsejteket és monocitákat, valamint B- és T-limfocita prekurzor sejteket azonosítottak a C166 sejtek alrétegén növesztett vegyes telepekben. Az endotélsejtek alrétegén növekvő szikzacskósejtek képesek voltak önreprodukcióra, és a szerzők kísérleteiben akár három passzázst is kibírtak. A vérképzés helyreállítása a segítségükkel súlyos kombinált immunhiányos (SCID) érett egerekben minden típusú leukocita, valamint T- és B-limfociták képződésével járt. A szerzők azonban tanulmányaikban egy 10 napos embrió szikzacskósejtjeit használták, amelyekben az extra- és intraembrionális érrendszer már zárva van, ami nem teszi lehetővé számunkra, hogy kizárjuk az intraembrionális HSC-k jelenlétét a szikzacskósejtek között.

Ugyanakkor a fejlődés korai stádiumában lévő, a petesejt és az embrió érrendszerének egyesülése előtt (a terhesség 8-8,5. napja) izolált hematopoietikus sejtek differenciálódási potenciáljának elemzése kimutatta a T- és B-sejtek prekurzorainak jelenlétét a petesejtben, de nem az embrió testében. Az in vitro rendszerben, a csecsemőmirigy epiteliális és szubepitheliális sejtjeinek egyrétegű rétegén végzett kétlépcsős tenyésztési módszerrel a petesejt mononukleáris sejtjei pre-T- és érett T-limfocitákká differenciálódtak. Ugyanezen tenyésztési körülmények között, de a máj és a csontvelő stromális sejtjeinek egyrétegű rétegén a petesejt mononukleáris sejtjei pre-B-sejtekké és érett IglVT-B-limfocitákká differenciálódtak.

E vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy az immunrendszer sejtjei a petezsák extraembrionális szövetéből fejlődhetnek ki, és az elsődleges T- és B-sejtvonalak kialakulása az embrionális vérképző szervek stromális mikrokörnyezetének tényezőitől függ.

Más szerzők azt is kimutatták, hogy a petezsák limfoid differenciálódásra képes sejteket tartalmaz, és a keletkező limfociták antigén jellemzőikben nem különböznek az ivarérett állatokétól. Megállapították, hogy egy 8-9 napos embrió petezsáksejtjei képesek helyreállítani a limfopoézist az atimocita tímuszban érett CD3+CD4+- és CD3+CD8+-limfociták megjelenésével, amelyek kialakult T-sejt receptor repertoárral rendelkeznek. Így a tímuszt extraembrionális eredetű sejtek benépesíthetik, de nem zárható ki a korai T-limfocita prekurzor sejtek valószínű migrációja az intraembrionális limfopoézis forrásokból a tímuszba.

Ugyanakkor a petezsák vérképző sejtek felnőtt, besugárzott recipiensekbe történő átültetése nem mindig eredményezi a kimerült vérképző szöveti lokalizációs zónák hosszú távú újranépesedését, és az in vitro petezsáksejtek lényegesen kevesebb léptelepet alkotnak, mint az AGM régió sejtjei. Bizonyos esetekben egy 9 napos embrió petezsáksejtjeinek felhasználásával továbbra is lehetséges a vérképző szövet hosszú távú (akár 6 hónapos) újranépesedése a besugárzott recipiensekben. A szerzők úgy vélik, hogy a CD34+c-kit+ fenotípusú petezsáksejtek nemcsak abban különböznek az AGM régióból származó sejtektől, hogy képesek újranépesíteni a kimerült vérképző szerveket, hanem hatékonyabban állítják helyre a vérképzést is, mivel a petezsák közel 37-szer többet tartalmaz belőlük.

Meg kell jegyezni, hogy a kísérletekben hematopoietikus őssejtek marker antigénjeivel (c-kit+ és/vagy CD34+ és CD38+) ellátott petesejtes vérképző sejteket használtak, amelyeket közvetlenül a vemhesség 18. napján buszulfán injekciót kapó nőstény egerek utódainak májába vagy hasi vénájába injektáltak. Az ilyen újszülött állatokban a saját mielopoézisük jelentősen csökkent a buszulfán okozta hematopoietikus őssejtek eliminációja miatt. A petesejtes vérképző őssejtek átültetése után a donor markert - glicerofoszfát-dehidrogenázt - tartalmazó képződött elemeket 11 hónapig mutatták ki a recipiensek perifériás vérében. Megállapították, hogy a petesejtes HSC-k helyreállítják a limfoid, mieloid és eritroid eredetű sejtek tartalmát a vérben, a csecsemőmirigyben, a lépben és a csontvelőben, és a kimerizmus szintje magasabb volt a petesejtes sejtek intrahepatikus, mint intravénás beadása esetén. A szerzők úgy vélik, hogy a korai stádiumú embriók (legfeljebb 10 nap) petesejtes HSC-inek előzetes kölcsönhatásra van szükségük a máj hematopoietikus mikrokörnyezetével ahhoz, hogy sikeresen benépesítsék a felnőtt recipiensek hematopoietikus szerveit. Lehetséges, hogy az embriogenezisben van egy egyedülálló fejlődési szakasz, amikor a szikzacskó sejtjei, amelyek kezdetben a májba vándorolnak, majd képesek lesznek benépesíteni az érett recipiensek vérképző szerveinek stromáját.

E tekintetben meg kell jegyezni, hogy az immunrendszer sejtjeinek kimérizmusa gyakran megfigyelhető a csontvelősejtek besugárzott érett recipiensekbe történő átültetése után - az utóbbiak vérében a donor fenotípusú sejtek meglehetősen nagy mennyiségben találhatók a recipiens B-, T-limfocitái és granulocitái között, ami legalább 6 hónapig folytatódik.

Az emlősökben a vérképző sejteket morfológiai módszerekkel először az embrionális fejlődés 7. napján mutatják ki, és a petezsák erein belüli vérképző szigetek képviselik őket. A petezsákban a természetes vérképző differenciálódás azonban az elsődleges eritrocitákra korlátozódik, amelyek megtartják a sejtmagokat és szintetizálják a magzati hemoglobint. Mindazonáltal hagyományosan úgy vélték, hogy a petezsák az egyetlen forrása a HSC-knek, amelyek a fejlődő embrió vérképző szerveibe vándorolnak, és végleges vérképzést biztosítanak felnőtt állatokban, mivel a HSC-k megjelenése az embrió testében egybeesik a petezsák és az embrió érrendszerének lezárásával. Ezt a nézetet alátámasztják azok az adatok, amelyek szerint a petezsák sejtjei in vitro klónozáskor granulocitákat és makrofágokat, in vivo pedig léptelepeket hoznak létre. Ezután transzplantációs kísérletek során megállapították, hogy a szikzacskó vérképző sejtjei, amelyek magában a szikzacskóban csak primer eritrocitákká képesek differenciálódni, az újszülött és felnőtt SCID egerek májának mikrokörnyezetében, a megfogyatkozott csecsemőmirigyben vagy a stromális táplálékban képesek újra benépesíteni a vérképző szerveket az összes vérképző vonal helyreállításával, még felnőtt recipiens állatokban is. Elvileg ez lehetővé teszi számunkra, hogy valódi HSC-ként osztályozzuk őket - olyan sejtekként, amelyek a posztnatális időszakban működnek. Feltételezzük, hogy a szikzacskó az AGM régióval együtt a HSC-k forrásaként szolgál az emlősök végleges vérképzéséhez, de a vérképző rendszer fejlődéséhez való hozzájárulásuk még mindig nem tisztázott. A korai emlős embriogenezisben két hasonló funkciójú vérképző szerv létezésének biológiai jelentése sem tisztázott.

A kérdésekre válaszok keresése folytatódik. In vivo sikerült bizonyítani a 8-8,5 napos embriók szikzacskójában olyan sejtek jelenlétét, amelyek helyreállítják a limfopoézist szubletálisan besugárzott, kifejezett T- és B-limfocita-hiányban szenvedő SCID egerekben. A szikzacskó vérképző sejtjeit intraperitoneálisan és közvetlenül a lépbe és a májszövetbe injektálták. 16 hét elteltével a recipiensekben donor MHC antrxgénekkel jelölt TCR/CD34 CD4+ és CD8+ T-limfocitákat, valamint B-220+IgM+ B-limfocitákat mutattak ki. Ugyanakkor a szerzők nem találtak olyan őssejteket a 8-8,5 napos embriók szervezetében, amelyek képesek lennének az immunrendszer ilyen helyreállítására.

A szikzacskó vérképző sejtjei magas proliferatív potenciállal rendelkeznek, és képesek hosszan tartó önreprodukcióra in vitro. Egyes szerzők ezeket a sejteket HSC-ként azonosítják az eritroid progenitor sejtek elhúzódó (közel 7 hónapos) generációja alapján, amelyek az eritroid vonal csontvelői progenitoraitól hosszabb passzázsidőben, nagyobb telepméretben, növekedési faktorokkal szembeni fokozott érzékenységben és hosszabb proliferációban különböznek. Ezenkívül a szikzacskó sejtek in vitro tenyésztésének megfelelő körülményei között limfoid progenitor sejtek is képződnek.

A bemutatott adatok általánosságban lehetővé teszik számunkra, hogy a szikzacskót a HSC-k forrásának tekintsük, kevésbé elkötelezettek, és ezért nagyobb proliferatív potenciállal rendelkeznek, mint a csontvelői őssejtek. Annak ellenére azonban, hogy a szikzacskó pluripotens hematopoietikus progenitor sejteket tartalmaz, amelyek in vitro hosszú ideig fenntartják a hematopoietikus differenciálódás különböző vonalait, a HSC-k teljességének egyetlen kritériuma a recipiens hematopoietikus szerveinek hosszú távú újratelepítésére való képességük, amelynek hematopoietikus sejtjei elpusztultak vagy genetikailag hibásak. Így a kulcskérdés az, hogy a szikzacskó pluripotens hematopoietikus sejtjei képesek-e migrálni és benépesíteni a hematopoietikus szerveket, és hogy célszerű-e felülvizsgálni azokat az ismert munkákat, amelyek bizonyítják, hogy képesek az érett állatok hematopoietikus szerveinek újratelepítésére a fő hematopoietikus vonalak kialakulásával. A végleges GSC-k intraembrionális forrásait madárembriókban azonosították az 1970-es években, ami már akkor kétségbe vonta a GSC-k extraembrionális eredetével kapcsolatos kialakult elképzeléseket, beleértve a gerincesek más osztályainak képviselőit is. Az elmúlt néhány évben publikációk jelentek meg hasonló, GSC-ket tartalmazó intraembrionális területek jelenlétéről emlősökben és emberekben.

Ismét meg kell jegyezni, hogy az ezen a területen szerzett alapvető ismeretek rendkívül fontosak a gyakorlati sejttranszplantáció szempontjából, mivel nemcsak a HSC-k előnyös forrásának meghatározásában segítenek, hanem a primer hematopoietikus sejtek és a genetikailag idegen organizmus közötti kölcsönhatás jellemzőinek megállapításában is. Ismert, hogy az emberi magzati máj hematopoietikus őssejtjeinek bejuttatása egy juhembrióba az organogenezis szakaszában kiméra állatok születéséhez vezet, amelyek vérében és csontvelőjében az emberi hematopoietikus sejtek 3-5%-a stabilan meghatározható. Ugyanakkor az emberi HSC-k nem változtatják meg kariotípusukat, fenntartva a magas proliferációs rátát és a differenciálódási képességet. Ezenkívül az átültetett xenogén HSC-k nem ütköznek a gazdaszervezet immunrendszerével és fagocitáival, és nem alakulnak át tumorsejtekké, ami az alapját képezte az örökletes genetikai patológia intrauterin korrekciójára szolgáló módszerek intenzív fejlesztésének HSC-k vagy hiányos génekkel transzfektált ESC-k felhasználásával.

De az embriogenezis melyik szakaszában célszerűbb ilyen korrekciót végezni? Az emlősökben először jelennek meg a vérképzésre alkalmas sejtek közvetlenül a beágyazódás után (a terhesség 6. napján), amikor a vérképzésre alkalmas differenciálódás és a feltételezett vérképző szervek morfológiai jelei még hiányoznak. Ebben a szakaszban az egérembrió diszpergált sejtjei képesek a besugárzott recipiensek vérképzési szerveit újra benépesíteni olyan eritrociták és limfociták képződésével, amelyek a hemoglobin, illetve a glicerofoszfát-izomeráz típusában, valamint a donorsejtek további kromoszómális markerében (Tb) különböznek a gazdasejtektől. Az emlősökben, akárcsak a madarakban, a szikzaccal egyidejűleg, a közös érrendszer lezárása előtt a vérképzési sejtek közvetlenül az embrió testében jelennek meg a paraaortikus splanchnopleurában. Az AA4.1+ fenotípusú vérképzési sejteket az AGM régióból izolálták, és multipotens vérképzési sejtekként jellemezték, amelyek T- és B-limfocitákat, granulocitákat, megakariocitákat és makrofágokat képeznek. Fenotípiát tekintve ezek a multipotens progenitor sejtek nagyon közel állnak a felnőtt állatok csontvelőjében található HSC-khez (CD34+c-kit+). Az AGM régió összes sejtje között a multipotens AA4.1+ sejtek száma kicsi - a régiónak legfeljebb 1/12-ed részét teszik ki.

Az emberi embrióban is azonosítottak egy intraembrionális régiót, amely az állatok AGM régiójával homológ HSC-ket tartalmaz. Ezenkívül emberekben a nagy proliferációs potenciállal rendelkező multipotens sejtek több mint 80%-a az embrió testében található, bár ilyen sejtek a petezsákban is megtalálhatók. Elhelyezkedésük részletes elemzése kimutatta, hogy több száz ilyen sejt gyűlik össze kompakt csoportokban, amelyek a dorzális aorta ventrális falának endotéliumának közvetlen közelében helyezkednek el. Fenotipikusan CD34CD45+Lin sejtekről van szó. Ezzel szemben a petezsákban, valamint az embrió más vérképző szerveiben (máj, csontvelő) az ilyen sejtek egyedülállóak.

Következésképpen az emberi embrióban az AGM régió hematopoietikus sejtek csoportjait tartalmazza, amelyek szorosan kapcsolódnak a dorzális aorta ventrális endotéliumához. Ez a kapcsolat immunkémiai szinten is nyomon követhető - mind a hematopoietikus klaszterek sejtjei, mind az endotélsejtek expresszálják a vaszkuláris endoteliális növekedési faktort, az Flt-3 ligandot, receptoraikat, az FLK-1 és STK-1-et, valamint a leukémia őssejtek transzkripciós faktorát. Az AGM régióban a mezenchimális származékokat egy sűrű, lekerekített sejtekből álló szál képviseli, amelyek a teljes dorzális aorta mentén helyezkednek el, és tenascin C-t expresszálnak - az alapanyag glikoproteinjét, amely aktívan részt vesz az intercelluláris kölcsönhatás és migráció folyamataiban.

Az AGM régió multipotens őssejtjei a transzplantáció után gyorsan helyreállítják a vérképzést érett, besugárzott egerekben, és hosszú ideig (akár 8 hónapig) hatékony vérképzést biztosítanak. A szerzők nem találtak ilyen tulajdonságokkal rendelkező sejteket a petezsákban. A vizsgálat eredményeit egy másik munka adatai is megerősítik, amely kimutatta, hogy a fejlődés korai szakaszában lévő embriókban (10,5 nap) az AGM régió az egyetlen olyan sejtforrás, amely megfelel a HSC definíciójának, helyreállítva a mieloid és limfoid vérképzést érett, besugárzott recipiensekben.

Az AGM-S3 stromális sejtvonalat az AGM régióból izolálták, melynek sejtjei támogatják az elkötelezett CFU-GM, BFU-E, CFU-E progenitor sejtek és vegyes típusú telepképző egységek tenyészetben történő létrehozását. Ez utóbbiak tartalma az AGM-S3 sejtvonal tápláló alrétegén történő tenyésztés során 10-ről 80-szorosára nő. Így az AGM régió mikrokörnyezete olyan stromális bázissejteket tartalmaz, amelyek hatékonyan támogatják a vérképzést, így maga az AGM régió is működhet embrionális vérképző szervként - a definitív HSC-k, azaz a felnőtt állat vérképző szövetét alkotó HSC-k forrásaként.

Az AGM régió sejtösszetételének kiterjesztett immunfenotípus-vizsgálata kimutatta, hogy nemcsak multipotens hematopoietikus sejteket tartalmaz, hanem mieloid és limfoid (T- és B-limfociták) differenciálódásra elkötelezett sejteket is. Az AGM régióból származó egyes CD34+c-kit+ sejtek polimeráz láncreakcióval végzett molekuláris elemzése azonban csak a béta-globin és a mieloperoxidáz gének aktivációját mutatta ki, a CD34, Thy-1 és 15 szintézisét kódoló limfoid gének aktivációját nem. A vonalspecifikus gének részleges aktivációja jellemző a HSC-k és progenitor sejtek keletkezésének korai ontogenetikai szakaszaira. Figyelembe véve, hogy egy 10 napos embrió AGM régiójában az elkötelezett progenitor sejtek száma 2-3 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a májban, azzal érvelhetünk, hogy az embriogenezis 10. napján az AGM régióban a vérképzés éppen csak elkezdődik, míg a magzat fő hematopoietikus szervében ebben az időszakban a hematopoietikus vonalak már kifejlődtek.

Valójában, a korábbi (9-11 napos) petesejtes őssejtekkel ellentétben, amelyek az újszülött hematopoietikus mikrokörnyezetét, de a felnőtt szervezetet nem benépesítik, a 12-17 napos embrionális máj hematopoietikus progenitor sejtjei már nem igényelnek korai posztnatális mikrokörnyezetet, és egy felnőtt állat hematopoietikus szerveit nem rosszabb módon benépesítik, mint egy újszülöttét. Az embrionális máj HSC-k átültetése után a besugárzott felnőtt recipiens egerek vérképzése poliklonális jellegű volt. Ezenkívül jelölt telepek segítségével kimutatták, hogy a beágyazódott klónok működése teljes mértékben a felnőtt csontvelőben megfigyelhető klonális szukcessziónak van alávetve. Következésképpen a legkíméletesebb körülmények között, exogén citokinekkel történő előzetes stimuláció nélkül jelölt embrionális máj HSC-k már rendelkeznek a felnőtt HSC-k főbb tulajdonságaival: nem igényelnek korai posztembrionális mikrokörnyezetet, a transzplantáció után mély nyugalmi állapotba kerülnek, és a klonális szukcessziós modellnek megfelelően szekvenciálisan mobilizálódnak klonális képződésbe.

Nyilvánvaló, hogy a klonális szukcesszió jelenségét részletesebben kell tárgyalni. Az eritropoézist hematopoietikus őssejtek végzik, amelyek magas proliferációs potenciállal rendelkeznek, és képesek a vérsejtek összes elkötelezett prekurzor sejtvonalává differenciálódni. A hematopoietikus őssejtek normál intenzitása mellett a legtöbb hematopoietikus őssejt nyugalmi állapotban van, és mobilizálódik a proliferációra és a differenciálódásra, egymást követően klónokat képezve, amelyek egymást helyettesítik. Ezt a folyamatot klonális szukcessziónak nevezik. A hematopoietikus rendszerben a klonális szukcesszió kísérleti bizonyítékát retrovirális génátvitellel jellemzett HSC-kkel végzett vizsgálatokban szerezték. Felnőtt állatokban a hematopoietikus rendszert számos, egyidejűleg működő hematopoietikus klón, a HSC-k származéka tartja fenn. A klonális szukcesszió jelensége alapján kidolgoztak egy repopulációs megközelítést a HSC-k azonosítására. Ezen elv szerint különbséget tesznek a hosszú távú hematopoietikus őssejtek (LT-HSC) között, amelyek képesek a hematopoietikus rendszer egész életen át történő helyreállítására, és a rövid távú HSC-k között, amelyek ezt a funkciót korlátozott ideig látják el.

Ha a hematopoietikus őssejteket a repopulációs megközelítés szempontjából vizsgáljuk, akkor az embrionális máj hematopoietikus sejtjeinek sajátossága, hogy képesek olyan telepeket létrehozni, amelyek mérete lényegesen nagyobb, mint a köldökzsinórvérből vagy csontvelőből származó HSC-k növekedésében lévők, és ez minden típusú telepre vonatkozik. Ez a tény önmagában is az embrionális máj hematopoietikus sejtjeinek nagyobb proliferációs potenciálját jelzi. Az embrionális máj hematopoietikus progenitor sejtjeinek egyedülálló tulajdonsága a rövidebb sejtciklus más forrásokhoz képest, ami nagy jelentőséggel bír a hematopoietikus szervek repopulációjának hatékonysága szempontjából a transzplantáció során. Az érett szervezet forrásaiból származó hematopoietikus szuszpenzió sejtes összetételének elemzése azt mutatja, hogy az ontogenezis minden szakaszában a nukleáris sejteket túlnyomórészt véglegesen differenciálódott sejtek képviselik, amelyek száma és fenotípusa a hematopoietikus szövet donorának ontogenetikai korától függ. Különösen a csontvelő és a köldökzsinórvér mononukleáris sejtjeinek szuszpenziói több mint 50%-ban érett limfoid sorozatú sejtekből állnak, míg az embrionális máj hematopoietikus szövete kevesebb mint 10%-ban tartalmaz limfocitákat. Ezenkívül az embrionális és magzati májban a mieloid vonal sejtjeit főként az eritroid sorozat képviseli, míg a köldökzsinórvérben és a csontvelőben a granulocita-makrofág elemek dominálnak.

Az is fontos, hogy az embrionális máj tartalmazza a legkorábbi hematopoietikus prekurzorok teljes készletét. Ez utóbbiak közül meg kell említeni az eritroid, granulopoietikus, megakariopoietikus és többvonalas kolóniaképző sejteket. Primitívebb prekurzoraik - az LTC-IC - képesek in vitro 5 hétig vagy tovább proliferálni és differenciálódni, és a recipiens szervezetébe történő allogén, sőt xenogén transzplantáció során is megtartják funkcionális aktivitásukat immunhiányos állatokba.

Az eritroid sejtek embrionális májban való túlsúlyának biológiai célszerűsége (a hematopoietikus elemek teljes számának akár 90%-a is lehet) annak köszönhető, hogy a fejlődő magzat gyorsan növekvő vérmennyiségét eritrocita-tömeggel kell ellátni. Az embrionális májban az eritropoézist különböző érettségi fokú nukleáris eritroid prekurzorok képviselik, amelyek magzati hemoglobint (a2u7) tartalmaznak, amely az oxigén iránti nagyobb affinitása miatt biztosítja az utóbbi hatékony felszívódását az anyai vérből. Az eritropoézis intenzívebbé válása az embrionális májban az eritropoetin (EPO) szintézisének lokális növekedésével jár. Figyelemre méltó, hogy az eritropoetin jelenléte önmagában elegendő a hematopoietikus sejtek hematopoietikus potenciáljának megvalósításához az embrionális májban, míg a csontvelői és köldökzsinórvér HSC-k eritropoézishez való elköteleződéséhez citokinek és növekedési faktorok kombinációja szükséges, amelyek EPO-ból, SCF-ből, GM-CSF-ből és IL-3-ból állnak. Ugyanakkor az embrionális májból izolált korai hematopoietikus progenitor sejtek, amelyek nem rendelkeznek EPO-receptorokkal, nem reagálnak az exogén eritropoetinre. Az embrionális máj mononukleáris sejtjeinek szuszpenziójában az eritropoézis indukciójához fejlettebb, eritropoetin-érzékeny, CD34+CD38+ fenotípusú sejtek jelenléte szükséges, amelyek expresszálják az EPO-receptort.

Az irodalomban még mindig nincs konszenzus a vérképzés embrionális időszakban történő fejlődéséről. A vérképző progenitor sejtek extra- és intraembrionális forrásainak létezésének funkcionális jelentőségét még nem állapították meg. Azonban kétségtelen, hogy az emberi embriogenezisben a máj a vérképzés központi szerve, és a terhesség 6-12. hetében a lépben, a csecsemőmirigyben és a csontvelőben található vérképző őssejtek fő forrásaként szolgál. A GDR-ek biztosítják a megfelelő funkciók ellátását a fejlődés pre- és posztnatális időszakában.

Ismét meg kell jegyezni, hogy az embrionális májat – más forrásokhoz képest – a HSC-k legmagasabb tartalma jellemzi. Az embrionális máj CD344+ sejtjeinek körülbelül 30%-a rendelkezik CD38 fenotípussal. Ugyanakkor a limfoid progenitor sejtek (CD45+) száma a vérképzés korai szakaszában a májban nem haladja meg a 4%-ot. Megállapították, hogy a magzat fejlődésével, a terhesség 7. és 17. hete között a B-limfociták száma fokozatosan növekszik, havi 1,1%-os „lépésekkel”, míg a HSC-k szintje tartósan csökken.

A hematopoietikus őssejtek funkcionális aktivitása a forrásuk embrionális fejlődésének időszakától is függ. Az emberi embriók májsejtjeinek telepképző aktivitásának vizsgálata a terhesség 6-8. és 9-12. hetében félfolyékony közegben, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 és EPO jelenlétében végzett tenyésztés során kimutatta, hogy a telepek teljes száma 1,5-szer magasabb, ha az embrionális máj HSC-it a fejlődés korai szakaszában oltják be. Ugyanakkor a mielopoézis progenitor sejtek, például a CFU-GEMM száma a májban az embriogenezis 6-8. hetében több mint háromszor magasabb, mint a számuk a terhesség 9-12. hetében. Általánosságban elmondható, hogy az embriók hematopoietikus májsejtjeinek telepképző aktivitása a terhesség első trimeszterében szignifikánsan magasabb volt, mint a magzati májsejteké a terhesség második trimeszterében.

A fenti adatok arra utalnak, hogy az embriogenezis kezdetén az embrionális máj nemcsak a korai hematopoietikus progenitor sejtek megnövekedett tartalmával tűnik ki, hanem hematopoietikus sejtjeit a különböző sejtvonalakba való differenciálódás szélesebb spektruma is jellemzi. Az embrionális máj hematopoietikus őssejtjeinek funkcionális aktivitásának ezen jellemzői bizonyos klinikai jelentőséggel bírhatnak, mivel minőségi jellemzőik lehetővé teszik, hogy kifejezett terápiás hatást várjunk el már kis számú, a terhesség korai szakaszában nyert sejt átültetésekor is.

Mindazonáltal a hatékony transzplantációhoz szükséges hematopoietikus őssejtek mennyiségének problémája továbbra is nyitott és aktuális. Kísérletet tesznek annak megoldására, hogy kihasználják az embrionális máj hematopoietikus sejtjeinek magas önreprodukciós potenciálját in vitro, citokinek és növekedési faktorok stimulálásával. A korai embrionális máj HSC-k bioreaktorban történő állandó perfúziójával 2-3 nap elteltével a vérképző őssejtek mennyisége a kezdeti szint 15-szörösére nő. Összehasonlításképpen meg kell jegyezni, hogy legalább két hét szükséges ahhoz, hogy azonos körülmények között az emberi köldökzsinórvérből származó HSC-k kibocsátásának 20-szorosára növekedjen.

Így az embrionális máj a vérképző őssejtek más forrásaitól abban különbözik, hogy mind az elkötelezett, mind a korai vérképző progenitor sejtek magasabb tartalmában különbözik. Növekedési faktorokkal tenyésztve a CD34+CD45Ra1 CD71l0W fenotípusú embrionális májsejtek 30-szor több telepet alkotnak, mint a hasonló köldökzsinórvérsejtek, és 90-szer többet, mint a csontvelői HSC-k. A megadott források közötti legkifejezettebb különbségek a vegyes telepeket alkotó korai vérképző progenitor sejtek tartalmában mutatkoznak - a CFU-GEMM mennyisége az embrionális májban 60-szor, illetve 250-szer meghaladja a köldökzsinórvérben és a csontvelőben található mennyiséget.

Fontos az is, hogy az embrionális fejlődés 18. hetéig (a csontvelőben a vérképzés megkezdésének időszaka) a májsejtek több mint 60%-a vesz részt a vérképző funkció megvalósításában. Mivel az emberi magzatnak a fejlődés 13. hetéig nincs csecsemőmirigye, és ennek megfelelően timocitái sincsenek, a 6-12 hetes terhességi embrionális májból származó vérképző sejtek átültetése jelentősen csökkenti a „graft versus host” reakció kialakulásának kockázatát, és nem igényli hisztokompatibilis donor kiválasztását, mivel viszonylag könnyűvé teszi a vérképző kimérizmus elérését.