Vérképző őssejtek köldökzsinórvérből

A köldökzsinórvér jó forrása a vérképző őssejteknek a proliferációs potenciál és a vérképző sejtek újranépesedési képessége szempontjából. Többször kimutatták, hogy születésükre a köldökzsinórvér kellően nagyszámú, gyengén elkötelezett vérképző progenitor sejtet tartalmaz. Egyes szerzők úgy vélik, hogy a köldökzsinórvérből származó vérképző őssejt-transzplantáció előnye, hogy nem kell HLA antigénekkel kompatibilis donort keresni. Véleményük szerint az újszülött immunrendszerének éretlensége az immunkompetens sejtek csökkent funkcionális aktivitását, és ennek megfelelően a súlyos graft-versus-host betegség alacsonyabb előfordulását okozza, mint a csontvelő-transzplantáció esetén. Ugyanakkor a köldökzsinórvér-transzplantáció túlélési aránya nem alacsonyabb, mint a csontvelősejteké, még akkor sem, ha a beteg testsúlykilogrammjára vetítve kisebb számú HSC-t alkalmaznak. Véleményünk szerint azonban a recipiens szervezetébe történő hatékony beágyazódáshoz szükséges átültetett köldökzsinórvérsejtek optimális számának, immunológiai kompatibilitásuknak, valamint a köldökzsinórvérből származó vérképző őssejtek transzplantációjának problémájának számos egyéb aspektusa komolyabb elemzést igényel.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Hematopoietikus őssejtek kinyerése köldökzsinórvérből

A köldökzsinórvérből történő vérképző őssejtek kinyerésének eljárása a gyermek születése után azonnali begyűjtését és a méhlepénytől való elválasztását igényli, amikor a méhlepény méhen belül vagy méhen kívül van, valamint császármetszés során, de méhen kívül is. Kimutatták, hogy ha a születés pillanatától az újszülött méhlepénytől való leválásának időpontját 30 másodpercre csökkentjük, a kinyert köldökzsinórvér térfogata átlagosan 25-40 ml-rel nő. Ha ezt az eljárást később végzik el, ugyanennyi vérveszteséggel jár. Megállapították, hogy a gyermek korai elválasztása a méhlepénytől nem jár semmilyen negatív következménnyel az újszülöttre nézve.

Az Orosz Hematológiai és Transzfuziológiai Kutatóintézet hatékony és alacsony költségű technológiákat fejlesztett ki a köldökzsinórvér kinyerésére mind normál szülés ((70,2+25,8) ml), mind császármetszés ((73,4+25,1) ml) során. Javaslatot tettek egy olyan módszerre, amely lehetővé teszi a köldökzsinórvér elválasztását, és amely kellően magas magvas és mononukleáris sejtek hozamát biztosítja - (83,1+9,6)%, illetve (83,4+14,1)%. Továbbfejlesztettek egy módszert a köldökzsinórvér krioprezerválására, amely biztosítja a mononukleáris sejtek és a CFU-GM magas megőrzését - (96,8+5,7)%, illetve (89,6+22,6)%. Meghatározták a Kompoplast-300 tartály (Oroszország) használatával történő köldökzsinórvérgyűjtési módszer hatékonyságát. A szerzők a gyermek születése és a méhlepénytől való leválása után közvetlenül köldökzsinórvért gyűjtöttek, a méhlepény méhen belüli vagy méhen kívüli elhelyezésének körülményei között. A köldökvéna megszúrása előtt a köldökzsinórt egyszer 5%-os jódtinktúrával, majd kétszer 70%-os etil-alkohollal kezelték. A vér spontán áramlott a csatlakozó csöveken keresztül a tartályba. A gyűjtési eljárás nem tartott tovább 10 percnél. A drénezéssel gyűjtött 66 köldökvérminta átlagos térfogata (72+28) ml volt, a leukociták száma az átlagos teljes mintatérfogatban (1,1+0,6) x 107. A köldökvér sterilitásának (bakteriális szennyeződés, HIV-1, hepatitis B és C vírusok, szifilisz és citomegalovírus fertőzés) vizsgálatakor csak egy mintában mutattak ki hepatitis C vírus elleni IgG antitesteket. Egy másik vizsgálatban a méhlepényt a születés után közvetlenül a magzat felszínével lefelé egy speciális keretre helyezték, a köldökzsinórt 5%-os jódoldattal és 75%-os etil-alkohollal kezelték. A köldökvénát egy transzfúziós rendszerből (G16) származó tűvel drenálták. A vér spontán áramlott a tartályba. Az így gyűjtött vér átlagos térfogata (55+25) ml volt. G. Kogler és munkatársai munkájában... (1996) zárt módszerrel gyűjtöttek köldökzsinórvért, és nagy mennyiségű vért kaptak - átlagosan (79+26) ml-t. A szerzők megjegyzik, hogy az 574 köldökzsinórvérminta körülbelül 7%-a kevesebb, mint 40 ml vért tartalmazott, ami nem teszi lehetővé transzplantációra való felhasználásukat. K. Isoyama és munkatársai (1996) fecskendők segítségével aktív exfúzióval vettek köldökzsinórvért, és átlagosan 69,1 ml vért kaptak (a köldökzsinórvér térfogata 15 és 135 ml között változott). Végül A. Abdel-Mageed PI és munkatársai (1997) átlagosan 94 ml köldökzsinórvért (56 és 143 ml között) sikerült nyerniük a köldökvéna katéterezésével.

Az iatrogén fertőzés és az anyai váladékkal való szennyeződés kockázatának csökkentése érdekében egy zárt vérvételi rendszert fejlesztettek ki, amely a Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA) széles körben használt transzfúziós rendszerén alapul, és 62,5 ml CPDA-t (citrát-foszfát-dextróz adeninnel) tartalmaz antikoagulánsként. Az anyag kinyerésének technológiája elsődleges fontosságú a kiváló minőségű minta előállításához a sejtszuszpenzió térfogata, tartalma és tisztasága szempontjából. A köldökzsinórvér gyűjtésére szolgáló meglévő módszerek közül, amelyeket hagyományosan zárt, félig nyitott és nyitott rendszerekre osztanak, az elsőt kell előnyben részesíteni, mivel a zárt rendszer jelentősen csökkenti az anyag mikrobiális szennyeződésének, valamint a sejtszuszpenzió anyai sejtekkel való szennyeződésének kockázatát.

A. Nagler és munkatársai (1998) összehasonlító elemzést végeztek a köldökzsinórvér gyűjtésére szolgáló mindhárom rendszer hatékonyságáról. Az első változatban az eljárást zárt rendszerben végezték, a vért közvetlenül egy tartályba szívva. A második változatban a köldökzsinórvért MP1 fecskendővel történő aktív vérexfúzióval nyerték, majd a méhlepényi vénákat átmosták, és egyidejűleg a vért egy tartályba engedték (nyílt módszer). A harmadik változatban a vért félig nyitott rendszerben gyűjtötték, fecskendőkkel történő aktív vérexfúzióval, majd a köldökartérián keresztül átöblítették, és egyidejűleg egy tartályba engedték. Az első változatban a szerzők (76,4+32,1) ml térfogatban vettek köldökzsinórvért, amelynek leukocita-tartalma (10,5+3,6) x 106 volt ¹ ml vérben. A második változatban a megfelelő mutatók (174,4+42,8) ml és (8,8+3,4) x 106 ^/ ml voltak; a harmadikban - (173,7+41,3) ml és (9,3+3,8) x 106 ^/ ml. A köldökzsinórvérminták leggyakoribb fertőzését nyílt rendszer használatakor figyelték meg. Közvetlen összefüggést állapítottak meg a méhlepény tömege és a kivett vér térfogata között - a méhlepény tömegének növekedésével a begyűjtött vér mennyisége is nő.

A köldökzsinórvér levétele után következik az elválasztási szakasz - a mononukleáris sejtek izolálása és a sejtszuszpenzió tisztítása az eritrocitáktól. Kísérleti körülmények között a magvas sejteket metilcellulózos ülepítéssel izolálják az eritrociták ammónium-kloridos lízise során. A metilcellulózt azonban nem szabad klinikai célokra használni, mivel a vérképző őssejtek vesztesége rajta eléri az 50-90%-ot. Az eritrociták lízisét a klinikán szinte soha nem végzik a munkaoldat nagy térfogata miatt, bár a CD34+ fenotípusú magvas sejtek, valamint a CFU-GM és CFU-GEMM funkciójú progenitor sejtek ilyen módon történő izolálásának százalékos aránya jelentősen magasabb. Beszámoltak egy új módszer megjelenéséről a mononukleáris sejtek sűrűséggradiensben történő izolálására, a buyant sűrűségoldatról (BDS72). Ennek az anyagnak a következő fiziológiai paraméterei vannak: pH - 7,4, ozmolalitás - 280 mOsm/kg, sűrűség - 1,0720 g/ml. A szerzők szerint a BDS72 segítségével a CD34-pozitív sejtek akár 100%-a is izolálható, és az eritrociták 98%-a eltávolítható. A BDS72-t azonban még nem alkalmazzák a klinikumban.

A magvas sejtek köldökzsinórvérből történő izolálására jóváhagyott módszerekben általában 10%-os hidroxietil-keményítő oldatot vagy 3%-os zselatinoldatot használnak. Az eritrociták ülepedésének és a magvas sejtek izolálásának hatékonysága mindkét esetben megközelítőleg azonos. Ha azonban zselatint alkalmaznak ülepítőszerként, valamivel nagyobb mennyiségű CFU-GM-et lehet nyerni, mint hidroxietil-keményítő alkalmazása esetén. Feltételezhető, hogy a CFU-GM izolálásának hatékonyságában mutatkozó különbségek a magvas sejtek egyes frakcióinak eltérő ülepedési sebességéből vagy a hidroxietil-keményítő molekulák azon képességéből fakadnak, hogy a vérképző sejtek receptorainak felületén abszorbeálódnak, és ezáltal blokkolják azok érzékenységét a CFU-GM in vitro tenyésztésében használt kolónia-stimuláló faktorokkal szemben. Mindazonáltal mindkét ülepítő alkalmas lehet a magvas sejtek izolálására nagyméretű köldökzsinórvérbankok létrehozásakor.

A köldökzsinórvér elválasztásának és krioprezervációjának módszerei alapvetően nem különböznek a felnőtt donorok perifériás véréből és csontvelőjéből származó hematopoietikus őssejtekkel végzett munkában alkalmazottaktól. Azonban nagyszámú köldökzsinórvérminta előkészítésekor a bankok számára az elválasztási módszereknek mindenekelőtt alacsony költségűeknek kell lenniük. Ezért sajnos jelenleg a klinikai igényekhez a köldökzsinórvérsejtek izolálására és krioprezerválására már bevált rutinmódszereket alkalmazzák, és a hatékonyabb, de költséges módszerek továbbra is a kísérletezők sorsára maradnak.

Általánosságban elfogadottak a vérképző sejtek számának felmérésére vonatkozó kritériumok, valamint a köldökzsinórvérből vett minták vizsgálatának követelményei a fertőző ágensek azonosítása érdekében. A köldökzsinórvérből származó vérképző sejtek transzplantációjának biztonsága érdekében minden vérmintát elsősorban hematogén úton terjedő fertőzések és genetikai betegségek kimutatására kell vizsgálni. Számos szerző további speciális módszereket javasol a köldökzsinórvér vizsgálatára olyan genetikai betegségek diagnosztizálására, mint az a-talasszémia, a sarlósejtes vérszegénység, az adenozin-deamináz-hiány, a Bruton-agammaglobulinémia, a Hurler- és a Ponter-kór.

L. Ticheli és munkatársai (1998) ajánlásai szerint minden köldökzsinórvérmintát meg kell vizsgálni magvas sejtek, CD34-pozitív sejtek és CFU-GM jelenlétére, el kell végezni a HLA-tipizálást, és meg kell határozni a vércsoportot az ABO és az Rh-faktor alapján. Ezenkívül bakteriológiai tenyésztést, valamint szerológiai vizsgálatot kell végezni HIV- és citomegalovírus-fertőzés, HBsAg, vírusos hepatitis C, HTLY-I és HTLV-II (humán T-sejtes leukémia), szifilisz és toxoplazmózis kimutatására. A citomegalovírus és a HIV-fertőzés kimutatására polimeráz láncreakció szükséges.

A köldökzsinórvér kinyerésének eljárását az orvosi bioetika alapelveinek szigorú betartásával kell végezni. A vérvétel előtt a várandós nő beleegyezését kell kérni. A várandós nővel folytatott előzetes beszélgetést, hogy tájékozott beleegyezést szerezzenek minden beavatkozáshoz, a vérvételtől a dokumentáció kitöltéséig, kizárólag egészségügyi dolgozók végezhetik. Semmilyen esetben sem megengedett, hogy ezeket az eljárásokat biológiai, kémiai, gyógyszerészeti vagy egyéb nem orvosi végzettséggel rendelkező személyzet végezze, mivel ez sérti a bioetika és az emberi jogok megállapított normáit. Pozitív HBsAg-hordozás, hepatitis C, HIV-fertőzés és szifilisz kórokozói elleni antitestek jelenléte esetén a köldökzsinórvért nem veszik le, a már levett vérmintákat pedig elutasítják és megsemmisítik. Meg kell jegyezni, hogy az újszülötteknél a látens fertőzések hordozása sokkal ritkább, mint a felnőtteknél, ezért a hematogén átvitel és a fertőző szövődmények kialakulásának valószínűsége a köldökzsinórvér hematopoietikus sejtjeinek infúziója során jelentősen alacsonyabb, mint felnőtt donor csontvelő transzplantáció esetén.

A köldökzsinórvér klinikai alkalmazásának fontos aspektusa a transzplantációs értékelés, amely a köldökzsinórvérmintában található hematopoietikus őssejtek mennyiségének és a transzplantációhoz szükséges sejtdózisoknak a meghatározásán alapul. Jelenleg még nem dolgoztak ki szabványokat a transzplantációhoz szükséges optimális köldökzsinórvérsejt-mennyiségre vonatkozóan. Még olyan rutinparaméterekre sem létezik általánosan elfogadott álláspont, mint a CD34-pozitív sejtek száma és a CFU-GM. Egyes szerzők a hematopoietikus sejtek potenciálját hosszú távú tenyészetek elemzésével értékelik, meghatározva a granulocitákra, eritrocitákra, monocitákra és megakariocitákra jellemző telepképző egységek - CFU-GEMM - tartalmát.

Klinikai környezetben azonban a köldökzsinórvér-transzplantáció standard értékelése jellemzően csak a magvas vagy mononukleáris sejtek számának meghatározását foglalja magában.

Köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek tárolása

A köldökzsinórvér vérképző sejtjeinek tárolási technológiájában is vannak problémák. A vérképző őssejtek krioprezerválásakor az optimális fagyasztási mód elérése érdekében a lehető legnagyobb mértékben csökkenteni kell a köldökzsinórvér térfogatát, valamint előzetesen el kell távolítani az eritrocitákat a hemolízis és az eritrocita antigénekkel (ABO, Rh) szembeni inkompatibilitási reakció kialakulásának kockázata elkerülése érdekében. Erre a célra a magvas sejtek izolálásának különböző módszerei alkalmasak. A múlt század 90-es éveinek elején a legszélesebb körben alkalmazott módszer a magvas sejtek izolálása volt 1,077 g/ml sűrűségű Ficoll vagy 1,080 g/ml sűrűségű Percoll alapú sűrűséggradiensben. A köldökzsinórvér sűrűséggradiensben történő elválasztása lehetővé teszi túlnyomórészt mononukleáris sejtek izolálását, de a vérképző progenitor sejtek jelentős - akár 30-50%-os - veszteségéhez vezet.

A hidroxietil-keményítő ülepedési hatékonyságát a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek izolálása során eltérően értékelik. Egyes szerzők a módszerrel végzett elválasztás alacsony minőségére mutatnak rá, míg más kutatók ezzel szemben az összes lehetséges módszer közül a köldökzsinórvérből származó HSC izolálását részesítik előnyben 6%-os hidroxietil-keményítő oldattal. Ugyanakkor hangsúlyozzák a hematopoietikus sejtek ülepedésének magas hatékonyságát, amely egyes adatok szerint eléri a 84%-ot és 90%-ot.

Egy másik nézőpont hívei úgy vélik, hogy gyakorlatilag minden frakcionálási módszer a magvas sejtek nagy veszteségével jár, és centrifugálással történő elválasztást javasolnak, a köldökzsinórvért 3 frakcióra osztva: eritrocitákra, leukocita gyűrűre és plazmára. Az ilyen módon történő sejtizolálással a szerzők azt találták, hogy a mononukleáris sejtek, a korai hematopoietikus progenitor sejtek és a CD34+ immunfenotípusú sejtek tartalma végül a kezdeti szint 90, 88 és 100%-át tette ki. Hasonló értékeket kaptak más kutatók is a módszerrel tisztított köldökzsinórvérsejtek növekedésére vonatkozóan: ülepítés után a magvas sejtek 92%-át, a mononukleáris sejtek 98%-át, a CD34-pozitív sejtek 96%-át és a telepképző egységek 106%-át izolálták.

Az 1990-es évek végén a zselatint széles körben alkalmazták ülepítőszerként. A klinikai gyakorlatban a zselatint 1994 óta használják vérképző őssejtek izolálására köldökzsinórvérből. 3%-os zselatinoldat alkalmazása esetén a magvas sejtek izolálásának hatékonysága eléri a 88-94%-ot. A zselatin nagymértékű használata köldökzsinórvérbank létrehozásában megerősítette előnyeit más ülepítőszerekkel szemben. A fenti módszerek hatékonyságának összehasonlító elemzése a magvas sejtek izolálására a vizsgált köldökzsinórvérminták mindegyikén történő egymást követő alkalmazásuk körülményei között kimutatta, hogy a 3%-os zselatinoldat az optimális ülepítőszer a CD34+/CD45+ fenotípusú mononukleáris sejtek hozama, valamint a CFU-GM és CFU-GEMM száma szempontjából. A Ficoll sűrűséggradiensen alapuló módszerek, valamint a hidroxietil-keményítő és a metilcellulóz alkalmazása szignifikánsan kevésbé hatékonyak voltak, a vérképző sejtek vesztesége elérte a 60%-ot.

A köldökzsinórvérből származó őssejt-transzplantáció mennyiségének bővülése nemcsak a beszerzési módszerek fejlesztésével, hanem a tárolásukkal is összefügg. Számos probléma kapcsolódik közvetlenül a köldökzsinórvér hosszú távú tárolásra való előkészítéséhez és a minták krioprezerválásának optimális technológiájának kiválasztásához. Ezek közé tartozik az elválasztási eljárások megvalósíthatóságának kérdése, a különböző krioprezervációs közegek használata és a felolvasztott sejtek transzplantációra való előkészítésének módszerei. A natív köldökzsinórvér minták szállítása gyakran a hematológiai központoktól távol eső régiókból történik. E tekintetben felmerül a köldökzsinórvér beszerzésétől a krioprezerváció kezdetéig elfogadható tárolási időtartamok problémája, ami különösen fontos a köldökzsinórvérbankok létrehozásakor.

A köldökzsinórvérben található vérképző sejtek funkcionális aktivitásának vizsgálata hosszú távú (akár 12 éves) folyékony nitrogénben történő tárolás után kimutatta, hogy a vérképző sejtek körülbelül 95%-a nem veszíti el magas proliferációs képességét ez idő alatt. S. Yurasov és munkatársai (1997) munkájában bebizonyosodott, hogy a köldökzsinórvér szobahőmérsékleten (22°C) vagy 4°C-on 24, illetve 48 órán át történő tárolása nem csökkenti jelentősen a vérképző sejtek életképességét, amely a kezdeti szint 92, illetve 88%-a. Ha azonban a tárolási időszakot három napra meghosszabbítják, az életképes magvas sejtek száma a köldökzsinórvérben jelentősen csökken. Ugyanakkor más tanulmányok kimutatták, hogy 2-3 napig 22 vagy 4°C-on történő tárolás esetén elsősorban az érett granulociták, és nem a vérképző sejtek életképessége szenved kárt.

A köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek életképességét negatívan befolyásolhatják a köldökzsinórvér-gyűjtőrendszerek összetevői. Különböző, kalciumion-kötésen alapuló antikoagulánsok (ACD, EDTA, XAPD-1) hematopoietikus progenitor sejtekre gyakorolt hatásának elemzése a köldökzsinórvér 24-72 órás tárolási körülményei között kimutatta negatív hatásukat a magvas sejtek életképességére. E tekintetben a szerzők 20 U/ml koncentrációjú, tartósítószer nélküli natív heparin hozzáadásával készült PBS (foszfátpufferoldat) használatát javasolják, amely véleményük szerint lehetővé teszi a frakcionálatlan köldökzsinórvér tárolási idejének 72 órára növelését, és megőrzi a telepképző egységek funkcionális aktivitását. A CFU-GM és a CFU-G biztonságosságára vonatkozó tanulmány azonban kimutatta, hogy a köldökzsinórvér krioprezerváció előtti tárolási ideje nem haladhatja meg a kilenc órát. Nyilvánvaló, hogy ebben az esetben az az elv érvényesül, hogy ellentmondó adatok esetén a köldökzsinórvérre ajánlott minimális tárolási időt kell alkalmazni, és az izolált sejtek programozott lefagyasztását a lehető leghamarabb meg kell kezdeni.

Köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek fagyasztásakor általában 10%-os DMSO-oldatot használnak krioprotektánsként. A kifejezett krioprotektív hatás mellett azonban az ilyen koncentrációjú dimetil-szulfoxid közvetlen citotoxikus hatással is rendelkezik, még a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek minimális expozíciója esetén is. A DMSO citotoxikus hatásának csökkentése érdekében nulla expozíciós hőmérsékletet alkalmaznak, minden manipuláció sebességét növelik, és a köldökzsinórvér minták felengedése után többszöri mosást végeznek.

1995 óta az Ukrán Orvostudományi Akadémia Hematológiai és Transzfuziológiai Intézete egy olyan tudományos irányt fejleszt, amelynek célja a köldökzsinórvér, mint alternatív vérképző őssejt-forrás átfogó vizsgálata. Különösen új technológiákat fejlesztettek ki a frakcionálatlan és frakcionált köldökzsinórvér vérképző sejtjeinek alacsony hőmérsékletű krioprezerválására. Krioprotektánsként kis molekulatömegű orvosi polivinil-pirrolidont alkalmaznak. A frakcionálatlan köldökzsinórvér krioprezerválásának módszere a sejtek fagyasztásra való előkészítésének eredeti technológiáján és a sejtszuszpenzió transzplantáció előtti speciális feldolgozásának módszerén alapul.

A krioprezervált hematopoietikus őssejtek funkcionális aktivitásának szintjét befolyásoló egyik legfontosabb tényező a sejtszuszpenzió hűtésének sebessége, különösen a kristályosodási fázisban. A fagyasztási sebesség és idő problémájának megoldására szolgáló szoftveres megközelítés nagyszerű lehetőségeket kínál egyszerű és rendkívül hatékony krioprezervációs módszerek létrehozására anélkül, hogy a sejtszuszpenziót a transzplantáció előtt ki kellene mosni a krioprotektorokból.

A sejtek életképessége szempontjából az előállításuk során a legveszélyesebb szakaszok a közvetlen fagyasztás és felolvasztás. A vérképző sejtek fagyasztásakor jelentős részük elpusztulhat az intercelluláris közeg folyékony fázisból szilárd fázisba való átmenetének - a kristályosodásnak - a pillanatában. A sejthalál százalékos arányának csökkentése érdekében krioprotektorokat alkalmaznak, amelyek hatásmechanizmusait és krioprotektív hatékonyságát a tudományos szakirodalom kellőképpen ismerteti.

A csontvelő és a köldökzsinórvér sejtek krioprezervációs módszereinek optimalizálásának ígéretes iránya több, eltérő hatásmechanizmusú krioprotektor alacsony koncentrációinak kombinációja egyetlen oldatban, például a sejten belüli szinten ható DMSO és a sejten kívüli védőhatású hidroxietil-keményítő vagy albumin.

A köldökzsinórvérsejtek krioprezerválásához hagyományosan 20%-os DMSO-oldatot használnak, amelyet lassan, folyamatos mechanikus keverés mellett, jégfürdőben öntenek a sejtszuszpenzióhoz, amíg a krioprotektáns és a sejtszuszpenzió térfogatának egyenlő (1:1) arányát el nem érik. A dimetil-szulfoxid végső koncentrációja 10%. A sejtszuszpenziót ezután egy programozott kriogén egységben GS/perc sebességgel -40°C-ra hűtik, majd a hűtési sebességet 10°C/percre növelik. A -100°C elérése után a sejtszuszpenziót tartalmazó tartályt folyékony nitrogénbe (-196°C) helyezik. Ezzel a krioprezervációs technikával a funkcionálisan aktív mononukleáris sejtek felolvasztás utáni tartóssága eléri az eredeti szint 85%-át.

A krioprezervációs módszerek módosításai a DMSO koncentrációjának csökkentését célozzák hidroxietil-keményítő hozzáadásával (a dimetil-szulfoxid és a hidroxietil-keményítő végső koncentrációja 5, illetve 6%). A krioprotektorok ilyen kombinációjának nagy hatékonysága figyelhető meg mieloid sejtek szuszpenziójának fagyasztásakor, és nem kisebb citoprotekcióval, mint ha csak 10%-os dimetil-szulfoxid oldatot használnánk. Az életképes magvas sejtek száma elérte a kezdeti szint 96,7%-át, funkcionális aktivitásuk pedig, a CFU-GM szám alapján becsülve, 81,8% volt.

Amikor 5-10%-os koncentrációjú dimetil-szulfoxid oldatot 4%-os hidroxietil-keményítővel (végső koncentráció) kombinálva alkalmaztak, azt találták, hogy a CD34-pozitív sejtek biztonságossága ilyen dimetil-szulfoxid tartományokban gyakorlatilag változatlan marad. Ugyanakkor, amikor a dimetil-szulfoxid koncentrációja 5%-ról 2,5%-ra csökken, a köldökzsinórvérsejtek tömeges pusztulása figyelhető meg - az életképes sejtegységek száma 85,4-ről 12,2%-ra csökken. Más szerzők is arra a következtetésre jutottak, hogy az 5 és 10%-os dimetil-szulfoxid oldatok (a szerző változatában - autológ szérummal kombinálva) biztosítják a maximális hatékonyságú citoprotekciót a köldökzsinórvér HSC-k krioprezervációja során. Ezenkívül az egymást követően fagyasztott és felolvasztott sejtek magas tartósságát figyelték meg az 5 vagy 10%-os dimetil-szulfoxid és a 4%-os hidroxietil-keményítő oldat kombinációja esetén, különösen GS/perc szabályozott hűtési sebesség mellett. Egy másik tanulmányban egy három összetevőből álló krioprotektív oldatot alkalmaztak - DMSO-t, tisztított humán albumint és RPMI táptalajt 1:4:5 arányban, amelyet egyenlő térfogatarányban adtak a sejtszuszpenzióhoz (a dimetil-szulfoxid végső koncentrációja 5%). +4 GS hőmérsékletű vízfürdőben történő felolvasztás után a CFU-GM tartóssága meghaladta a 94%-ot.

Egyes szerzők frakcionálatlan köldökzsinórvér használatát javasolják krioprezerváláshoz, mivel a vörösvértestek eltávolítása során jelentős mennyiségű vérképző sejt vész el. Ebben a változatban 10%-os dimetil-szulfoxid-oldatot használnak a mononukleáris sejtek kriokristályosítás káros hatásaitól való védelmére. A fagyasztást állandó, GS/perc sebességgel végzik -80°C-ra, majd a köldökzsinórvérsejt-szuszpenziót folyékony nitrogénbe fagyasztják. Ez a fagyasztási módszer a vörösvértestek részleges lízisét eredményezi, így a vérminták frakcionálása nem igényel. Felolvasztás után a sejtszuszpenziót humán albumin oldatban vagy a beteg autológ vérszérumában mossák ki a szabad hemoglobinból és a dimetil-szulfoxidból, és transzplantációhoz használják.

A vérképző progenitor sejtek konzerváltsága a nem frakcionált köldökzsinórvér felolvasztás után valóban magasabb, mint a frakcionált köldökzsinórvéré, azonban egyes eritrociták kriosztabilitása miatt súlyos transzfúzió utáni problémák merülhetnek fel az ABO-inkompatibilis eritrociták transzfúziója miatt. Ezenkívül a tárolt nem frakcionált vér térfogata jelentősen megnő. Klinikai szempontból továbbra is előnyösebb a korábban izolált és más sejtfrakciókból tisztított köldökzsinórvérből származó vérképző sejtek krioprezervációja.

Különösen a frakcionált köldökzsinórvérsejtek krioprezerválására szolgáló módszert fejlesztették ki, amely lehetővé teszi az eritrociták eltávolítását a fagyasztásra való előkészítés szakaszában, amelyben a "Stabizol" plazmapótló oldat részeként 6%-os hidroxietil-keményítő-oldatot használnak. Felolvasztás után az így kapott sejtszuszpenzió további manipulációk nélkül klinikai felhasználásra kész.

Így jelenleg számos meglehetősen hatékony módszer létezik a köldökzsinórvér krioprezerválására. Alapvető különbségük az, hogy a vérmintákat frakcionálatlanul fagyasztják le, vagy az előkészítési szakaszban sejtfrakciókra bontják, és eritrociták hozzáadása nélküli magvas sejteket készítenek elő.

Köldökzsinórvérből származó vérképző őssejt-transzplantáció

Az 1980-as évek végén és az 1990-es évek elején megállapították, hogy a köldökzsinórvér, amely a terhesség alatt életfenntartást biztosít a magzatnak, magas vérképző őssejt-tartalommal rendelkezik. A köldökzsinórvérsejtek kinyerésének viszonylagos egyszerűsége és a nyilvánvaló etikai problémák hiánya hozzájárult a köldökzsinórvér őssejtek gyakorlati orvoslásban való alkalmazásához. Az első sikeres köldökzsinórvér-transzplantáció egy Fanconi-anémiás gyermeknél kiindulópontként szolgált a köldökzsinórvér-őssejt-transzplantációk mennyiségének bővítéséhez és egy banki rendszer létrehozásához. A köldökzsinórvérbankok világrendszerében a legnagyobb a New York-i Méhlepényvér Központ, amely az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézetének mérlegében szerepel. Az ebben a bankban tárolt köldökzsinórvérminták száma megközelíti a 20 000-et. A sikeres transzplantáción átesett recipiensek (többnyire gyermekek) száma is növekszik. Az Egyesült Államok Egészségügyi Minisztériuma szerint a köldökzsinórvér-transzplantáción átesettek transzplantáció utáni életének visszaesésmentes időszaka már meghaladja a 10 évet.

Ez nem meglepő, mivel a köldökzsinórvér vérképző potenciálját vizsgáló számos tanulmány kimutatta, hogy a legkorábbi őssejtek mennyiségét és minőségét tekintve nemcsak hogy nem marad el egy felnőtt csontvelőjétől, hanem bizonyos tekintetben meghaladja azt. A köldökzsinórvérből származó őssejtek magasabb proliferatív potenciálja a sejtes jelátvitel ontogenetikai sajátosságainak, a HSC-n található specifikus növekedési faktorok receptorainak jelenlétének, a köldökzsinórvérsejtek autokrin növekedési faktorok termelésére való képességének, valamint a telomerek nagy méretének és hosszának köszönhető.

Így a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek genomiális és fenotípusos jellemzői előre meghatározzák a transzplantátum kiváló minőségű beágyazódását, amely nagy potenciállal rendelkezik a donor hematopoézisének helyreállítására a recipiens testében.

A köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek előnyei

A köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek transzplantációhoz való felhasználásának valódi előnyei között más hematopoietikus sejtforrásokkal szemben érdemes megjegyezni a donor egészségére jelentett gyakorlatilag nulla kockázatot (ha a méhlepényt nem vesszük figyelembe), valamint az általános érzéstelenítés hiányát. A köldökzsinórvér használata kibővíti a sejtátültetés lehetőségeit a részlegesen HLA-kompatibilis transzplantációk miatt (egy-három antigén inkompatibilitása). Kifejlesztettek egy módszert a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek fagyasztott állapotban történő hosszú távú tárolására, amely növeli a ritka HLA-típusok megszerzésének valószínűségét, és csökkenti a HLA-kompatibilis transzplantátum keresésének idejét allogén transzplantációhoz. Ugyanakkor jelentősen csökken bizonyos, fertőző úton terjedő lappangó fertőzések kialakulásának kockázata. Ezenkívül a köldökzsinórvérből származó sejtek autológ transzplantációhoz való felhasználásának lehetősége miatt egy olcsó biológiai életbiztosítási forma is felmerül.

Azonban a méhlepényből gyűjthető kis vérmennyiség miatt (átlagosan legfeljebb 100 ml), előtérbe kerül a köldökzsinórvénából a lehető legnagyobb mennyiségű vér kinyerésének problémája, miközben szigorúan betartjuk a kapott köldökzsinórvérminták bakteriális szennyeződésének minimális kockázatát.

A köldökzsinórvér primitív hematopoietikus sejtjeit általában a CD34 glikofoszfoprotein felszínén való jelenléte, valamint funkcionális tulajdonságaik alapján azonosítják klonogenitásuk vagy telepképződésük in vitro vizsgálatával. Az összehasonlító elemzés kimutatta, hogy a köldökzsinórvérben és a csontvelőben a mononukleáris frakcióban a CD34-pozitív sejtek maximális tartalma 1,6%, illetve 5,0%, a CD34+ sejtalpopulációban a telepképző egységek maximális szintje 80%, illetve 25%, a CD34+ sejtek teljes klónozási hatékonysága 88%, illetve 58%, a nagy proliferációs potenciállal rendelkező telepképző sejtek (HPP-CFC a CD34+ populációban) maximális tartalma 50%, illetve 6,5%. Hozzá kell tenni, hogy a CD34+CD38 sejtek klónozásának hatékonysága és a citokinstimulációra való reagálási képesség is magasabb a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtekben.

A Thy-1, CD34 és CD45RA fenotípusos antigének kombinációja megerősíti a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek magas proliferatív potenciálját, és e három antigén expressziója a köldökzsinórvérsejtek felszínén az őssejtekhez való tartozást jelzi. Ezenkívül megállapították, hogy a köldökzsinórvér olyan CD34+ fenotípusú sejteket is tartalmaz, amelyek nem rendelkeznek lineáris differenciálódási markerekkel. A CD34+/Lin fenotípusos profilú sejtes alpopulációk szintje a köldökzsinórvérben a CD34-pozitív sejtek teljes számának körülbelül 1%-a. A köldökzsinórvér hematopoietikus progenitor sejtjeiből mind a limfoid sejtvonal, mind a lineáris sejtdifferenciálódású pluripotens mieloid sorozat keletkezik, ami szintén az őssejtekhez való tartozást jelzi.

Amint már említettük, a csontvelő és a köldökzsinórvér között jelentős különbség van az átültetéshez felhasznált vérképző sejtek mennyiségében, amelyeket egyetlen gyűjtési eljárás során nyernek. Ha a csontvelő-transzplantáció során a sejttömeg-veszteség az elválasztás, a krioprezerváció, a felolvasztás és a vizsgálat során 40-50%-on belül elfogadható, akkor a köldökzsinórvér esetében ezek a sejtveszteségek nagyon jelentősek, mivel ha nem elegendő mennyiségű HSC-t használnak fel, a transzplantáció hatástalannak bizonyulhat. G. Kogler és munkatársai (1998) szerint 10 kg-os testtömegű recipiens sejtátültetése esetén minden köldökzsinórvérminta potenciális transzplantáció lehet (a gyűjtött köldökzsinórvérminták teljes száma 2098), 35 kg-os testtömeg esetén 67%, 50-70 kg-os testtömegű betegeknél pedig a mintáknak csak 25%-a biztosíthat hatékony transzplantációt. Ez a klinikai helyzet jelzi a köldökzsinórvérsejtek gyűjtésére, reprodukálására és tárolására szolgáló meglévő módszerek optimalizálásának és hatékonyságának javításának szükségességét. Ezért a szakirodalom jelenleg széles körben tárgyalja a köldökzsinórvér gyűjtésének, vizsgálatának, elválasztásának és krioprezerválásának módszereinek szabványosításával kapcsolatos kérdéseket a vérbankok létrehozása érdekében, annak klinikai alkalmazását, valamint meghatározza a köldökzsinórvér hematopoietikus őssejtjeinek tárolásának feltételeit és feltételeit.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek felhasználása az orvostudományban

^{Általában legfeljebb 106 hematopoietikus őssejt izolálható} köldökzsinórvérből, ritkán többet. E tekintetben a mai napig nyitott kérdés, hogy vajon ilyen mennyiségű hematopoietikus sejt elegendő-e a vérképzés helyreállításához egy felnőtt recipiensben. A vélemények ebben a kérdésben megoszlanak. Egyes kutatók úgy vélik, hogy ez a mennyiség bőven elegendő a gyermekekbe történő transzplantációhoz, de túl kevés egy felnőttbe történő transzplantációhoz, akinél az optimális mennyiség a (7-10) x 106 CD34-pozitív sejt bejuttatása ^{testtömegkilogrammonként} - átlagosan 7 x 108 ^{transzplantációnként}. Ezekből a számításokból következik, hogy egy köldökzsinórvérminta 700-szor kevesebb hematopoietikus őssejtet tartalmaz, mint amennyi egy felnőtt betegbe történő transzplantációhoz szükséges. Ez a mennyiségi értékelés azonban a transzfúzióval átitatott csontvelősejtek számának analógiájára történik, és egyáltalán nem veszi figyelembe a vérképzés ontogenetikai jellemzőit.

Különösen figyelmen kívül hagyják azt a tényt, hogy a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek nagyobb proliferatív potenciállal rendelkeznek a csontvelőből származó hematopoietikus progenitor sejtekhez képest. Az in vitro telepképző potenciál vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy egyetlen adag köldökzsinórvér képes biztosítani a felnőtt recipiens vérképzésének helyreállítását. Másrészt nem szabad elfelejteni, hogy a köldökzsinórvérből származó őssejtek száma már az embrionális fejlődés során is csökken: a CD34-pozitív sejtek tartalma a köldökzsinórvérben lineárisan ötszörösére csökken a 20. héttől (a vizsgálathoz használt vérvétel a terhesség koraszülött megszakításakor történt) a 40. terhességi hétig (a fiziológiás vajúdás időszaka) terjedő időszakban, amelyet a lineáris citodifferenciálódási markerek párhuzamos, állandóan növekvő expressziója kísér.

Mivel a köldökzsinórvérből származó progenitor sejtek mennyiségi meghatározására nincs szabványosított megközelítés, továbbra is viták folynak a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek optimális dózisáról. Egyes kutatók úgy vélik, hogy a recipiens testtömegére újraszámított magvas sejtek és mononukleáris sejtek száma, azaz dózisuk kritériumként szolgálhat a köldökzsinórvér minták kiválasztásához. Egyes szerzők úgy vélik, hogy a CD34+ sejtek minimális mennyiségi küszöbértéke még a HSC-k autotranszplantációja esetén is 2 x 106 ^/ kg. Ugyanakkor a hematopoietikus sejtek dózisának 5 x 106 ^sejt /kg-ra (mindössze 2,5-szeresére) való emelése már biztosítja a korai transzplantáció utáni időszak kedvezőbb lefolyását, csökkenti a fertőző szövődmények előfordulását és lerövidíti a megelőző antibiotikum-terápia időtartamát.

E. Gluckman és munkatársai (1998) szerint az onkohematológiában a sikeres köldökzsinórvér-transzplantáció feltétele legalább 3,7 x 10 ⁷ magvas sejt/1 kg recipiens testtömeg bejuttatása. Amikor a hematopoietikus őssejtek dózisát 1 x 10 ⁷ vagy kevesebb magvas sejtre csökkentik/1 kg beteg testtömeg, a transzplantáció kudarcának és a vérképző rák kiújulásának kockázata meredeken megnő. Fel kell ismerni, hogy a HSC-k allotranszplantációja után a vérképzés gyors helyreállításához szükséges progenitor sejtek minimális száma még nem ismert. Elméletileg ez egyetlen sejttel is elérhető, de a csontvelő-transzplantáció klinikai gyakorlatában a gyors és stabil beágyazódást a beteg testtömeg-kilogrammjára vetített legalább (1-3) x 10 ^{8 magvas sejt transzfúziója garantálja.}

Egy nemrégiben készült részletes tanulmány, amelynek célja az onkohematológiában az optimális HSC-szám meghatározása volt, három csoportra osztották a betegeket, amelyeket a transzplantált anyag CD34-pozitív sejttartalma alapján osztottak be. Az első csoport betegei (3-5) x 106 sejt/kg dózist kaptak ^.A második csoport betegeinél a HSC dózisa (5-10) x 106 sejt/kg volt, a harmadik csoport betegei pedig több mint 10 x 106 CD34+ sejt/kg-mal kaptak transzplantációt ^. A legjobb eredményeket azoknál a recipienseknél figyelték meg, akik (3-5) x 106 ^/ kg CD34-pozitív sejtszámmal rendelkező transzplantációt kaptak. Az átültetett sejtek dózisának 5 x 106 ^/ kg fölé történő növelésével statisztikailag szignifikáns előnyöket nem mutattak ki. Ebben az esetben a transzplantátumban a HSC-k nagyon magas tartalma (> 10 x 106 ^/ kg) jelentős számú reziduális tumorsejt reinfúziójával jár, ami a betegség kiújulásához vezet. A transzplantált allogén progenitor sejtek száma és a graft-versus-host reakció kialakulása között nem állapítottak meg közvetlen összefüggést.

A köldökzsinórvér-transzplantációval kapcsolatos felhalmozott világtapasztalatok megerősítik a magas repopulációs potenciált. A köldökzsinórvér-transzplantáció beágyazódási aránya korrelál a beültetett magvas sejtek számával. A legjobb eredményeket 3 x 107 ^/ kg transzplantációval figyelték meg, míg a csontvelő esetében ez az adag 2 x 108 ^/ kg. A koordináló központok adatai szerint 2000 végén világszerte 1200 köldökzsinórvér-transzplantációt végeztek, főként rokon donoroktól (83%). Nyilvánvaló, hogy a köldökzsinórvért a csontvelő alternatívájának kell tekinteni a hemoblasztózisos betegek transzplantációja során.

Ugyanakkor a vérképző szövet köldökzsinórból származó újszülöttkori jellege optimizmusra ad okot a HSC funkcionális jellemzői miatt. Ugyanakkor csak a klinikai tapasztalat adhat választ arra a kérdésre, hogy elegendő-e egyetlen köldökzsinórvérminta a vérképzés helyreállításához egy felnőtt, vérképző apláziában szenvedő recipiensben. A köldökzsinórvérsejtek transzplantációját számos daganatos és nem daganatos betegség kezelési programjában alkalmazzák: leukémia és mielodiszpláziás szindrómák, non-Hodgkin limfóma és neuroblasztóma, aplasztikus anémia, veleszületett Fanconi- és Diamond-Blackfan-anémia, leukocita adhéziós hiány, Barr-szindróma, Gunther-kór, Hurler-szindróma, talasszémia.

A köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek transzplantációjának immunológiai vonatkozásai különös figyelmet és külön tanulmányt érdemelnek. Kimutatták, hogy a nem teljes HLA-kompatibilitású donoroktól származó köldökzsinórvérből származó őssejt-transzplantáció esetén a transzplantációs eredmények meglehetősen kielégítőek, ami a szerzők szerint a köldökzsinórvérsejtek alacsonyabb immunreaktivitását jelzi, mint a csontvelőben.

A köldökzsinórvér sejtösszetételének részletes vizsgálata feltárta az immunrendszer effektorsejtjeinek fenotípusos spektrumának és funkcionális aktivitásának jellemzőit, amelyek lehetővé tették, hogy a köldökzsinórvért a HSC-k forrásának tekintsük, viszonylag alacsony a „graft versus host” reakció kialakulásának kockázata. A köldökzsinórvér immunkompetens sejtjeinek funkcionális éretlenségének jelei között meg kell jegyezni a citokinek termelésének egyensúlyhiányát és az immunválasz citokin-szabályozásával szembeni érzékenységének csökkenését. A citotoxikus limfociták aktivitásának ebből eredő gátlását a transzplantált hematopoietikus szövettel szembeni immunológiai tolerancia kialakulásához hozzájáruló tényezőnek tekintik. A köldökzsinórvér limfocitáinak populációjában, ellentétben a felnőtt donorok perifériás vérével és csontvelőjével, az inaktív, éretlen limfociták és a szuppresszor sejtek dominálnak. Ez a köldökzsinórvér T-limfociták immunválaszra való csökkent készségét jelzi. A köldökzsinórvérsejtek monocita populációjának fontos jellemzője a funkcionálisan teljes értékű és aktív antigénprezentáló sejtek alacsony tartalma.

Egyrészt a köldökzsinórvérben található immunrendszer effektor sejtek alacsony érettsége kiterjeszti a klinikai alkalmazás indikációit, mivel ezek a tulajdonságok a donor és a recipiens sejtjei közötti immunkonfliktus intenzitásának csökkenését eredményezik. Másrészt azonban ismert a „graft versus host” reakció fejlettségi foka és a transzplantáció daganatellenes hatása, azaz a „graft versus leukémia” hatás kialakulása közötti összefüggés létezése. Ezzel kapcsolatban tanulmányt végeztek a köldökzsinórvérsejtek daganatellenes citotoxicitásával kapcsolatban. A kapott eredmények azt mutatják, hogy az immunkompetens köldökzsinórvérsejtek antigén stimulációra adott valóban legyengült válasza ellenére az elsősorban aktivált limfociták természetes ölősejtek és ölőszerű sejtek, amelyek aktívan részt vesznek a daganatellenes citotoxicitás megvalósításának mechanizmusaiban. Ezenkívül a köldökzsinórvérben CD16+CD56+ és CD16"TCRa/p+ fenotípusú limfociták alpopulációit is találták. Feltételezik, hogy ezek a sejtek aktivált formájukban valósítják meg a „graft versus leukémia” reakciót.

Az Ukrán Orvostudományi Akadémia Onkológiai Intézetében krioprezervált köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejteket adtak be kemo- és sugárterápia következtében tartós hematopoietikus hipopláziában szenvedő rákos betegeknek. Az ilyen betegeknél a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek átültetése meglehetősen hatékonyan helyreállította a csökkent vérképzést, amit a perifériás vérben az érett, formált elemek tartalmának tartós növekedése, valamint a sejtes és humorális immunitás állapotát jellemző mutatók növekedése is bizonyít. A köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek átültetése utáni repopulációs hatás stabilitása lehetővé teszi a sugár- és kemoterápia folytatását a kezelés megszakítása nélkül. Információk vannak a köldökzsinórvérből származó őssejtek allotranszplantációjának nagyobb hatékonyságáról onkohematológiai betegeknél: az alkalmazásuk során a daganatos betegség kiújulásának éves kockázata 25% volt, szemben az allogén csontvelő-átültetésen átesett betegek 40%-ával.

A krioprezervált köldökzsinórvérből származó őssejtek hatásmechanizmusát a recipiens vérképzésének humorális stimulációjának eredményének kell tekinteni, amelyet az újszülött sejtek egyedülálló képessége okoz a hematopoietikus növekedési faktorok autokrin termelésére, valamint a donorsejtek ideiglenes beágyazódásának következményeként (amit a recipiensek perifériás vérében a magzati hemoglobin tartalmának megbízható növekedése bizonyít a transzfúziót követő 7-15. napon a kezdeti adatokhoz képest). A köldökzsinórvérből származó recipienseknél a transzfúzió utáni reakciók hiánya az immunkompetens sejtek relatív toleranciájának eredménye, valamint a krioprezervált anyag biológiai megfelelőségének megbízhatósági kritériuma.

A köldökzsinórvérből származó T-limfocita gyilkos progenitor sejtek képesek aktiválódni exogén citokin stimuláció hatására, amelyet új ex vivo és in vivo módszerek fejlesztésére használnak a transzplantációs limfoid elemek daganatellenes citotoxicitásának kiváltására a későbbi immunterápia céljából. Ezenkívül a köldökzsinórvérből származó immunkompetens sejtek genomjának „éretlensége” lehetővé teszi számukra, hogy molekuláris modellezési módszerekkel fokozzák a daganatellenes aktivitást.

Napjainkban a köldökzsinórvér széles körben alkalmazható, elsősorban a gyermekhematológiában. Akut leukémiában szenvedő gyermekeknél a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek allotranszplantációja a csontvelő allotranszplantációjához képest jelentősen csökkenti a graft-versus-host betegség előfordulását. Ehhez azonban hosszabb neutro- és trombocitopénia-időszak, és sajnos magasabb 100 napos transzplantáció utáni halálozási arány társul. A perifériás vérben a granulocita- és vérlemezkeszint hosszabb helyreállási ideje a CD34-pozitív köldökzsinórvérsejtek egyes alpopulációinak elégtelen differenciálódásának tudható be, amit a radioaktív rodamin alacsony szintű abszorpciója és a CD38 antigének alacsony expressziója a felszínükön bizonyít.

Ugyanakkor a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek felnőtt betegekbe történő átültetése, melyet mind a kompatibilis, nem rokon csontvelődonor hiánya, mind az autológ HSC-k mobilizálásának lehetősége miatt végeztek, magas egyéves relapszusmentes túlélést mutatott a 30 év alatti betegek csoportjában (73%). A recipiensek életkor-tartományának kiterjesztése (18-46 év) a túlélés 53%-ra történő csökkenéséhez vezetett.

A CD34+ fenotípusú sejtek csontvelőben és köldökzsinórvérben történő kvantitatív elemzése kimutatta, hogy a csontvelőben ezek magasabb (3,5-szeres) mennyiségben vannak jelen, de a köldökzsinórvérben a CD34+HLA-DR fenotípusú sejtek jelentős túlsúlya volt megfigyelhető. Ismert, hogy a CD34+HLA-DR immunológiai markerekkel rendelkező vérsejtek aktívabban proliferálnak, mint a CD34+HLA-DR+ immunfenotípusú sejtek, amit hosszú távú hematopoietikus sejtkultúra in vitro növekedésének kísérleti vizsgálatai is megerősítettek. A CD34+CD38 fenotípusú primitív sejtprekurzorok mind a köldökzsinórvérben, mind a csontvelőben megtalálhatók, de a CD34+CD38 markerkészlettel rendelkező köldökzsinórvérsejtek nagyobb klonogén aktivitást mutatnak, mint a felnőtt donorok csontvelőjéből izolált, azonos fenotípusú hematopoietikus sejtek. Ezenkívül a CD34+CD38 immunfenotípusú köldökzsinórvérsejtek gyorsabban proliferálnak citokin stimulációra (IL-3, IL-6, G-CSF) válaszul, és hosszú távú tenyészetekben hétszer több telepet termelnek, mint a csontvelősejtek.

Köldökzsinórvér őssejtbankok

A gyakorlati orvoslás egy új területének - a köldökzsinórvér-őssejt-transzplantációnak - a megfelelő fejlődéséhez, valamint a csontvelői vérképző őssejt-transzplantációk megvalósításához kiterjedt vérbank-hálózatra van szükség, amely már létrejött az USA-ban és Európában. A hazai köldökzsinórvérbank-hálózatokat a Netcord Bank Association egyesíti. A köldökzsinórvérbankok nemzetközi szövetségének létrehozásának célszerűségét az határozza meg, hogy nagyszámú, tipizált köldökzsinórvérmintára van szükség a nem rokon transzplantációk elvégzéséhez, ami lehetővé teszi egy HLA-azonos donor kiválasztását. Csak egy olyan bankrendszer létrehozása oldhatja meg valóban a szükséges donor megtalálásának problémáját, amely különböző HLA-típusok vérmintáit tárolja. Egy ilyen köldökzsinórvérbank-rendszer megszervezése előzetes etikai és jogi normák kidolgozását igényli, amelyeket jelenleg nemzetközi szinten vitatnak meg.

Ukrajnában köldökzsinórvérbankok létrehozásához számos szabályozást és dokumentumot kell kidolgozni.

Először is, ezek a köldökzsinórvér gyűjtésének, frakcionálásának és fagyasztásának módszereinek szabványosításával kapcsolatos kérdések. Szükséges a köldökzsinórvér gyűjtésének szabályait a szülészeti kórházakban szabályozni az orvosi etika követelményeinek megfelelően, meghatározni a sikeres transzplantációt biztosító minimális köldökzsinórvér mennyiségét. Összehasonlítani és szabványosítani kell a hematopoietikus progenitor sejtek minőségének és mennyiségének értékelésére szolgáló különböző kritériumokat, valamint a HLA-tipizálási módszereket és a köldökzsinórvérsejtek infúziója során átvihető genetikai és fertőző betegségek diagnosztikai módszereit, hogy közös kritériumokat lehessen megállapítani az egészséges donorok kiválasztására. Érdemes megvitatni a köldökzsinórvérből nyert szérum, sejtek és DNS külön tárolóhelyiségeinek létrehozásának kérdéseit is.

Feltétlenül szükséges egy számítógépes hálózat megszervezése a köldökzsinórvér adatainak összegyűjtésére, hogy az összekapcsolódjon a csontvelő donor nyilvántartásokkal. A sejttranszplantológia további fejlesztése érdekében speciális protokollokat kell kidolgozni a HLA-azonos rokonoktól és nem rokon donoroktól származó köldökzsinórvér- és csontvelő-transzplantáció eredményeinek összehasonlítására. A dokumentáció szabványosítása, beleértve a szülők tájékoztatáson alapuló beleegyezését, valamint az anya vagy rokonok értesítését a gyermeknél kimutatott genetikai és/vagy fertőző betegségekről, segíthet megoldani a köldökzsinórvérsejtek klinikai felhasználásával kapcsolatos etikai és jogi problémákat.

A sejttranszplantológia ukrajnai fejlődésének meghatározó feltétele a Nemzeti Őssejt-donációs Program elfogadása, valamint a nemzetközi együttműködés fejlesztése más országokkal a Világcsontvelő-donorok Szövetségén (WMDA), az Egyesült Államok Nemzeti Csontvelő-donor Programján (NMDP) és más nyilvántartásokon keresztül.

Összefoglalva a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejt-transzplantáció fejlődésének még mindig rövid történetét, megjegyezzük, hogy a köldökzsinórvér klinikai alkalmazásának lehetőségével kapcsolatos első feltételezéseket, amelyeket még a 70-es évek elején fogalmaztak meg, a 80-as években megerősítették az állatkísérletek eredményei, és 1988-ban a világon elsőként végezték el a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek átültetését emberre, ezt követően pedig elkezdődött a köldökzsinórvérbankok globális hálózatának létrehozása. 10 év alatt a transzplantált köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtekkel rendelkező betegek száma megközelítette a 800-at. Köztük voltak daganatos (leukémia, limfóma, szilárd daganatok) és nem daganatos (veleszületett immunhiányos betegségek, vérszegénység, anyagcserezavarokkal összefüggő betegségek) betegségekben szenvedő betegek.

A köldökzsinórvérben a korai és elkötelezett sejtprekurzorok tartalma magasabb, mint egy felnőtt perifériás vérében. A granulocita-makrofág kolóniaképző egységek számát és proliferációs potenciálját tekintve a köldökzsinórvér jelentősen meghaladja a felnőttek perifériás vérét, még növekedési faktorok bevezetése után is. Hosszú távú in vitro sejtkultúrákban a köldökzsinórvérsejtek nagyobb proliferatív aktivitását és életképességét figyelték meg, mint a csontvelősejteké. A köldökzsinórvérből származó őssejt-transzplantáció kritikus pillanatai a magvas sejtek száma és hematopoietikus potenciálja, a citomegalovírus-fertőzés jelenléte, a donor és a recipiens HLA-kompatibilitása, a beteg testtömege és életkora.

A köldökzsinórvérből származó őssejt-transzplantációt azonban a csontvelő-transzplantáció alternatívájaként kell mérlegelni súlyos vérbetegségek kezelésében, elsősorban gyermekeknél. A köldökzsinórvér-transzplantáció klinikai problémái fokozatosan megoldódnak - már léteznek meglehetősen hatékony módszerek a köldökzsinórvérsejtek gyűjtésére, elválasztására és krioprezerválására, biztosítják a feltételeket a köldökzsinórvérbankok létrehozására, és fejlesztik a magvas sejtek vizsgálatának módszereit. A 3%-os zselatinoldatot és a 6%-os hidroxietil-keményítő oldatot optimálisnak kell tekinteni a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus őssejtek nagymértékű beszerzése során, bankok létrehozásakor.

P. Perekhrestenko és munkatársai (2001) helyesen jegyzik meg, hogy a köldökzsinórvér-őssejt-transzplantációnak meg kell foglalnia a jogos helyét a különböző eredetű vérképzőrendszeri depressziók leküzdésére irányuló terápiás intézkedések komplexumában, mivel a köldökzsinórvér-őssejtek számos jelentős előnnyel rendelkeznek, amelyek közül a legfontosabbak a beszerzésük relatív egyszerűsége, a donorra leselkedő kockázat hiánya, az újszülöttkori sejtek vírusokkal való alacsony szennyezettsége és a transzplantáció viszonylag alacsony költsége. Egyes szerzők rámutatnak, hogy a köldökzsinórvér-transzplantációt ritkábban kísérik a graft-versus-host reakcióval összefüggő szövődmények, mint a csontvelő-sejttranszplantációt, ami véleményük szerint a HLA-DR antigének gyenge expressziójának és éretlenségének köszönhető a köldökzsinórvérben. A köldökzsinórvérben található magvas sejtek fő populációját azonban a T-limfociták (CD3-pozitív sejtek) alkotják, amelyek tartalma körülbelül 50%, ami 20%-kal kevesebb, mint egy felnőtt perifériás vérében, de az ezen forrásokból származó T-sejt-alpopulációk fenotípusos különbségei jelentéktelenek.

A köldökzsinórvérből származó őssejt-transzplantáció túlélési arányát közvetlenül befolyásoló tényezők közül érdemes megjegyezni a betegek életkorát (a legjobb eredményeket az egy-öt éves recipienseknél figyelték meg), a betegség korai diagnózisát és a leukémia formáját (akut leukémia esetén a hatékonyság jelentősen magasabb). Nagy jelentőséggel bír a magvas köldökzsinórvérsejtek dózisa, valamint a recipienssel való HLA-kompatibilitásuk. Nem véletlen, hogy a köldökzsinórvérből származó HSC-transzplantáció klinikai hatékonyságának onkohematológiában történő elemzése a legjobb kezelési eredményeket a rokon transzplantációk alkalmazásakor mutatja: az egyéves relapszusmentes túlélés ebben az esetben eléri a 63%-ot, míg a nem rokon transzplantáció esetén - csak 29%-ot.

Így a köldökzsinórvérben található nagyszámú őssejt jelenléte és az újszülöttkori hematopoietikus őssejtek magas repopulációs kapacitása lehetővé teszi számukra, hogy allogén transzplantációhoz használják őket onkohematológiai betegeknél. Meg kell azonban jegyezni, hogy a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek átültetése után a vérképzés újbóli felépülése „időben elhúzódik”: a perifériás vér neutrofiltartalmának helyreállása általában a 6. hét végére figyelhető meg, a trombocitopénia pedig általában 6 hónap után eltűnik. Ezenkívül a köldökzsinórvérből származó hematopoietikus sejtek éretlensége nem zárja ki az immunológiai konfliktusokat: a recipiensek 23%-ánál súlyos akut, míg 25%-ánál krónikus graft-versus-host betegséget figyeltek meg. Az esetek 26%-ában az akut leukémia relapszusa figyelhető meg a köldökzsinórvér-transzplantációt követő első év végére.

[ 10 ], [ 11 ]