A kristálylerakódások szerepe az osteoarthritis patogenezisében

A bázikus kalcium-foszfát (BCP) kristályok az osteoarthritisben szenvedő betegek 30-60%-ánál találhatók meg az ízületi folyadékban. A. Swan és munkatársai (1994) szerint a kalciumtartalmú kristályok sokkal nagyobb számú osteoarthritisben szenvedő beteg ízületi folyadékában találhatók; azonban a kristályok rendkívül kis mérete vagy kis számuk miatt hagyományos technikákkal nem azonosíthatók. A BCP kristályok jelenléte az ízületi folyadékban korrelál az ízületi porc degenerációjának radiológiai jeleivel, és nagyobb mennyiségű folyadékgyülemhez kapcsolódik, mint a kristályok nélküli térdízületekben lévő folyadékgyülem. A gonartrózis radiográfiai progresszióját befolyásoló tényezők vizsgálata kimutatta, hogy a kalcium-pirofoszfát-dihidrát (CPPD) kristályok lerakódása a kedvezőtlen klinikai és radiológiai kimenetel előrejelzője. Egy idős betegeken végzett vizsgálatban az osteoarthritist chondrocalcinosissal hozták összefüggésbe, különösen a térd laterális tibiofemorális rekeszében és az első három metakarpofalangeális ízületben. Nem ritka, hogy mindkét típusú kristály, az OFC és a PFC is megtalálható az osteoarthritisben szenvedő betegeknél.

Klinikailag a kalciumkristály-lerakódás okozta ízületi porcdegeneráció eltér az elsődleges oszteoarthrosisban megfigyelhetőtől. Ha a kristályok a porcdegeneráció egyszerű mellékjelenségei lennének, akkor a primer oszteoarthrosis által leggyakrabban érintett ízületekben, azaz a térdben, a csípőben és a kéz kis ízületeiben lennének megtalálhatók. Ezzel szemben a kristálylerakódásos betegségek leggyakrabban azokat az ízületeket érintik, amelyek nem jellemzőek az elsődleges oszteoarthrosisra, például a vállat, a csuklót és a könyököt. A kristályok jelenléte az ízületi (effúziós) folyadékban súlyosabb ízületi porcdegenerációval jár. Vitatott kérdés, hogy melyik az ok és melyik a következmény, a kristálylerakódás vagy a porcdegeneráció. Egy köztes álláspontot a következő feltételezés foglal el: a porc anyagcseréjének primer rendellenessége vezet a degenerációjához, a kristályok másodlagos lerakódása pedig felgyorsítja a lebomlását (az úgynevezett amplifikációs hurok elmélete).

Az ízületi porc károsodásának pontos mechanizmusa nem ismert. Elméletileg a kalciumkristályok közvetlenül károsíthatják a porcsejteket. A szövettani vizsgálat azonban ritkán mutat kristályokat a porcsejtek közelében, és még ritkábban jutnak be azok a porcsejtekbe. A legvalószínűbb mechanizmus a kristályok fagocitózisa a szinoviális bélések sejtjei által, amelyet proteolitikus enzimek felszabadulása vagy citokinek szekréciója követ, amelyek stimulálják a porcsejtek enzimfelszabadulását. Ezt a koncepciót alátámasztja a PFKD által kiváltott szinovitisz szerepének vizsgálata a pirofoszfát ízületi gyulladásban gyorsan progresszív osteoarthritis kialakulásában. Ebben a vizsgálatban kalcium-pirofoszfát-dihidrát kristályokat (1 vagy 10 mg) injektáltak hetente a részleges laterális meniscectomia által kiváltott osteoarthritisben szenvedő nyulak jobb térdébe. Kiderült, hogy 8 injekció után a jobb térdízület szignifikánsan súlyosabb elváltozásokat mutatott a balhoz képest. A szinoviális gyulladás intenzitása korrelált a kalcium-pirofoszfát-dihidrát kristályok intraartikuláris injekcióival és azok dózisával. Annak ellenére, hogy a CPPD kristályok ebben a vizsgálatban alkalmazott dózisai meghaladják az in vivo értékeket, az eredmények a CPPD által kiváltott gyulladás szerepét jelzik az osteoarthritis progressziójában pirofoszfát artropathiában.

A kalciumtartalmú kristályok által kiváltott ízületi porckárosodás lehetséges mechanizmusai összefüggésben állnak mitogén tulajdonságaikkal, az MMP-k indukálására való képességükkel és a prosztaglandin-szintézis stimulálásával.

Kalciumtartalmú kristályok mitogén hatása. Kristályokkal összefüggő ízületi betegségek esetén gyakran megfigyelhető az ízületi hártya sejtjeinek proliferációja, és maguk a kristályok csak részben felelősek ezért a folyamatért. Az ízületi sejtek számának növekedését a citokinek fokozott szekréciója kíséri, amelyek elősegítik a porcszövet lebontását és proteolitikus enzimek szekrécióját indukálják. Az emberi ízületi patológiában található koncentrációkban az OFC kristályok dózisfüggően stimulálják a nyugalmi bőr fibroblaszt tenyészetek, valamint a kutya és egér ízületi fibroblasztok mitogenezisét. A kalcium-pirofoszfát-dihidrát, urát, szulfát, karbonát és kalcium-foszfát kristályai stimulálják a sejtnövekedést. Az ezen kristályok által indukált ( ^3H )-timidin beépülés kezdete és csúcsa 3 órával eltolódik a sejtek vérszérummal történő stimulálásához képest. Ez az időtartam szükséges lehet a kristályok fagocitózisához és feloldódásához. Az azonos méretű kontrollkristályok (pl. gyémántpor vagy latex részecskék) hozzáadása nem stimulálta a mitogenezist. A nátrium-urát-monohidrát kristályok gyenge mitogén tulajdonságokkal rendelkeztek, és szignifikánsan gyengébbek voltak a kalcium-uráténál, ami a kristályok kalciumtartalmának fontosságát jelzi a mitogenezisben. A szintetikus OFC kristályok ugyanolyan mitogén tulajdonságokkal rendelkeztek, mint a chondrocalcinosisban szenvedő betegektől kapott kristályok. A kalciumtartalmú kristályok mitogén hatása in vitro nem a környező táptalaj kalciumtartalmának növekedéséből eredt, mivel a bázikus kalcium-foszfát kristályok táptalajban való oldódása nem serkentette a ( ^3H )-timidin fibroblasztok általi beépülését.

Az OFC által kiváltott mitogenezis egyik javasolt mechanizmusa az, hogy az abnormális szinoviális sejtszaporodás legalább részben az endocitózisnak és a kristályok intracelluláris feloldódásának tudható be, ami növeli a citoplazmatikus Ca2 ⁺ koncentrációját és aktiválja a kalciumfüggő útvonalat, ami a mitogenezishez vezet. Ezt az elképzelést alátámasztja a közvetlen sejt-kristály érintkezés szükségessége a mitogenezis stimulálásához, mivel a sejtkultúrák kristályokkal való érintkezése sejtnövekedést indukált, míg az ilyen érintkezéstől megfosztott sejtek expozíciója nem. A sejt-kristály kölcsönhatást követő kristályfagocitózis szükségességének vizsgálatához sejteket ^45Ca -OPC-vel és ( ^3H )-timidinnel tenyésztettek. Azt találták, hogy a ^{45Ca -OPC-t tartalmazó sejtek szignifikánsan több (3H} )-timidint beépítettek, mint a bázikus kalcium-foszfát jelölés nélküli sejtek. Makrofágkultúrákban a kristály endocitózis citokalazin általi gátlása a kristályfeloldódás gátlását eredményezte, ami tovább hangsúlyozza a fagocitózis szükségességét.

A kalciumtartalmú kristályok savban oldódnak. Fagocitózis után a kristályok a makrofág fagolizoszómáinak savas környezetében oldódnak. A klorokin, az ammónium-klorid, a bafilomicin A1 és az összes lizoszomális pH-t növelő lizoszomotróp szer dózisfüggően gátolja az intracelluláris kristályoldódást és a (3H)-timidin felvételét bázikus kalcium-foszfát kristályokkal tenyésztett fibroblasztokban ^.

Az OFC kristályok hozzáadása egyrétegű fibroblaszt kultúrához az intracelluláris kalcium azonnali tízszeres növekedését okozta, amely 8 perc elteltével visszatért az alapértékre. A kalcium forrása túlnyomórészt extracelluláris ion volt, mivel a bázikus kalcium-foszfát kristályokat kalciummentes táptalajhoz adtuk. A következő intracelluláris kalciumkoncentráció-növekedést 60 perc elteltével figyeltük meg, és legalább 3 órán át tartott. Itt a kalcium forrása a fagolizoszómákban oldott fagocitált kristályok voltak.

Megállapították, hogy az OFC kristályok mitogén hatása hasonló a PDGF növekedési faktorként való hatásához; az utóbbihoz hasonlóan az OFC kristályok szinergizmust mutatnak az IGF-1-gyel és a vérplazmával. Az IGF-1 blokkolása csökkenti a sejtek mitogenezisét az OFC-re adott válaszként. PG Mitchell és munkatársai (1989) kimutatták, hogy a Balb/c- ₃ T3 fibroblasztokban a mitogenezis OFC kristályok _általi indukciójához szerin/treonin protein kináz C (PKC) jelenléte szükséges, amely a sejtek hormonokkal, neurotranszmitterekkel és növekedési faktorokkal történő külső stimulációja során keletkező jelek egyik fő mediátora. A PKC aktivitásának csökkenése a Balb/c-3 T3 sejtekben _gátolja a c-fos és c-myc protoonkogének _{OFC által közvetített indukcióját, de nem befolyásolja ezen onkogének PDGF által közvetített stimulációját.}

A fagocitált kristályok feloldódását követő intracelluláris kalciumszint-növekedés nem az egyetlen jelátviteli útvonal a mitogenezishez. Amikor a növekedési faktorok, mint például a PDGF, a membránreceptorukhoz kötődnek, stimulálódik a foszfolipáz C (egy foszfodiészteráz), amely hidrolizálja a foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfátot, így hozva létre az intracelluláris hírvivőket, az inozitol-3-foszfátot és a diacilglicerint. Az előbbi a kalciumot szabadítja fel az endoplazmatikus retikulumból a kalciumfüggő és kalcium/kalmodulin-függő enzimek, például a protein-kinázok és proteázok aktivitásának modulálásával.

R. Rothenberg és H. Cheung (1988) beszámoltak a foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát fokozott lebontásáról foszfolipáz C által nyúl szinoviális sejtekben OFC kristályokkal történő stimulációra adott válaszként. Ez utóbbi jelentősen megnövelte az inozitol-1-foszfát tartalmát a jelölt ( ^3H )-inozitollal rendelkező sejtekben; a csúcsot 1 percen belül érték el, és körülbelül 1 órán át tartott.

A diacilglicerin a kalcium-pirofoszfát-dihidrát potenciális aktivátora. Mivel az OFC kristályok növelik a foszfolipáz C aktivitását, ami a diacilglicerin felhalmozódásához vezet, következésképpen a PKC aktiváció növekedése várható. PG Mitchell és munkatársai (1989) összehasonlították az OFC kristályok és a PDGF hatását a Balb/c- _{3T3fibroblasztok} DNS-szintézisére. Sejtkultúrában a PKC-t inaktiválták a sejtek tumort támogató forbol-diészterrel (TPD), egy diacilglicerin analóggal történő inkubálásával. Az alacsony dózisú TPD-vel történő hosszú távú stimuláció csökkentette a PKC aktivitását, míg a nagy dózisú egyszeri stimuláció aktiválta. Az OFC kristályok általi DNS-szintézis stimulációja a PKC inaktiválása után gátolt volt, ami jelzi ennek az enzimnek a fontosságát az OFC által indukált mitogenezisben. Korábban GM McCarthy és munkatársai (1987) kimutatták az összefüggést az emberi fibroblasztok OFC kristályokra adott mitogén válasza és a PKC aktiváció között. Az OFC kristályok azonban nem aktiválják a foszfatidilinozitol-3-kinázt vagy a tirozin-kinázokat, ami megerősíti, hogy az OFC kristályok általi sejtaktiválás mechanizmusa szelektív.

A sejtszaporodást egy protoonkogénnek nevezett géncsoport szabályozza. A c-fos és c-myc protoonkogének termékei, a foe és mye fehérjék a sejtmagban lokalizálódnak és specifikus DNS-szekvenciákhoz kötődnek. A 3T3 fibroblasztok OFC kristályokkal történő stimulálása néhány percen belül c-fos expressziót eredményez, amely a stimulációt követő 30 percen belül éri el a maximumát. A c-myc transzkripció indukciója OFC kristályok vagy PDGF által 1 órán belül megtörténik, és a stimulációt követő 3 óra elteltével éri el a maximumát. A sejtek legalább 5 órán át megemelkedett c-fos és c-myc transzkripciós szintet tartanak fenn. Inaktivált PCD-vel rendelkező sejtekben a c-fos és c-myc OFC vagy TFD kristályok általi stimulációja jelentősen gátolt, míg ezen gének PDGF általi indukciója nem változik.

A mitogén-aktivált protein-kináz (MAP K) család tagjai kulcsfontosságú szabályozói a különféle intracelluláris jelátviteli kaszkádoknak. E család egyik alosztálya, a p42/p44, a sejtek proliferációját szabályozza egy olyan mechanizmuson keresztül, amely magában foglalja a protoonkogének c-fos és c-jun aktiválását. Az OFC és PFKD kristályok egy olyan protein-kináz jelátviteli útvonalat aktiválnak, amelyben mind a p42, mind a p44 részt vesz, ami arra utal, hogy ez az útvonal szerepet játszik a kalciumtartalmú kristályok által indukált mitogenezisben.

Végül, az OFC által indukált mitogenezisben részt vesz a transzkripciós faktor nukleáris faktor κB (NF-κB), amelyet először immunglobulin κ könnyűlánc (IgK) génként írtak le. Ez egy indukálható transzkripciós faktor, amely számos jelátviteli útvonalban fontos, mivel szabályozza a különböző gének expresszióját. Az NF-κB indukciója általában az IκB-nek nevezett gátló fehérjék felszabadulásával párosul a citoplazmából. Az NF-κB indukcióját az aktív transzkripciós faktor transzlokációja követi a sejtmagba. Az OFC kristályok NF-κB-t indukálnak Balb/c- _3T3 fibroblasztokban és emberi bőr fibroblasztokban.

Az NF-κB aktivációját követő jelátvitelben számos útvonal játszhat szerepet, de mindegyik protein-kinázokat foglal magában, amelyek foszforilálják (és így lebontják) az IκB-t. In vitro vizsgálatok alapján korábban úgy gondolták, hogy az IκB szubsztrátként szolgál kinázok (pl. PKC és protein-kináz A) számára. Azonban a közelmúltban azonosítottak egy nagy molekulatömegű IκB kináz komplexet. Ezek a kinázok specifikusan az IκB szerin aminosavait foszforilálják. Az NF-κB TNF-α és IL-1 általi aktiválásához az NF-κB-indukáló kináz (NIK) és az IκB kináz hatékony működése szükséges. A NIK aktiváció molekuláris mechanizmusa jelenleg ismeretlen. Bár az OFC kristályok aktiválják mind a PKC-t, mind az NF-κB-t, a két folyamat közötti összefüggés mértéke ismeretlen. Mivel a GκB kináz módosítása foszforiláción keresztül történik, a PKC szerepe az NF-κB OFC kristályok általi indukciójában a foszforiláció és a GκB kináz aktiválása révén nem zárható ki. Ezt a koncepciót alátámasztja az OFC kristályok által indukált mitogenezis és az NF-κB expresszió gátlása a PKC inhibitor staurosporin által. Hasonlóképpen, a staurosporin gátolhatja a GκB kinázt, és így gátolja a protein-kináz A-t és más protein-kinázokat.

Így az OFC-kristály által indukált mitogenezis mechanizmusa fibroblasztokban legalább két különböző folyamatot foglal magában:

• egy gyors, membránhoz kötött esemény, amely a PKC és a MAP K aktiválódását, az NF-κB és a protoonkogének indukcióját eredményezi,
• ^{a kristályok lassabb intracelluláris oldódása, ami a Ca2 +} intracelluláris tartalmának növekedéséhez, majd számos kalciumfüggő folyamat aktiválódásához vezet, amelyek stimulálják a mitogenezist.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

MMP-kalciumtartalmú kristályok indukciója

A kalciumtartalmú kristályok által okozott szövetkárosodás mediátorai az MMP-k - kollagenáz-1, stromelizin, 92 kD zselatináz és kollagenáz-3.

Az OFC kristálytartalom és az ízületi szövetek károsodása közötti összefüggés alapján felállítottak egy hipotézist, miszerint az OFC kristályokat és esetleg néhány kollagént a szinoviális sejtek fagocitálnak. A stimulált szinovociták szaporodnak és proteázokat választanak ki. Ezt a hipotézist in vitro tesztelték természetes vagy szintetikus OFC, PFCD és más kristályok hozzáadásával tenyésztett emberi vagy kutya szinovocitákhoz. A semleges proteázok és kollagenázok aktivitása dózisfüggően nőtt, és körülbelül 5-8-szor magasabb volt, mint a kristályok nélkül tenyésztett kontroll sejtkultúra aktivitása.

Kristálytartalmú táptalajon tenyésztett sejtekben kollagenáz-1, stromelizin és zselatináz-92 kDa mRNS együttes indukcióját észlelték, majd enzimek szekrécióját a táptalajba.

Az OFC kristályok a kollagenáz-1 és a kollagenáz-2 mRNS felhalmozódását is indukálták érett sertéskondrocitákban, majd az enzimek szekrécióját a táptalajba.

GM McCarty és munkatársai (1998) a sejten belüli kristályoldódás szerepét vizsgálták a kristályok által kiváltott MMP-termelésben. A lizoszomális pH bafilomicin A-val történő emelése gátolta a sejten belüli kristályoldódást, és csökkentette az emberi fibroblasztok OFC-kristályokra adott proliferatív válaszát is, de nem gátolta az MMP szintézisét és szekrécióját.

Sem a bázikus kalcium-foszfát, sem a PFCD kristályok nem indukáltak IL-1 termelést in vitro, de a nátrium-urát kristályok igen.

A jelenlegi adatok egyértelműen arra utalnak, hogy a fibroblasztok és a porcsejtek közvetlenül stimulálják az MMP-termelést kalciumtartalmú kristályokkal való érintkezéskor.

Az osteoarthritis tünetei az MMP jelentős szerepére utalnak a betegség progressziójában. A kalciumtartalmú kristályok jelenléte fokozza az érintett ízületek szöveteinek degenerációját.

A prosztaglandin szintézis stimulálása

A sejtnövekedés és az enzimek szekréciójának stimulálása mellett a kalciumtartalmú kristályok prosztaglandinok, különösen PGE2 felszabadulását okozzák emlős sejtkultúrákban _. A PGE2 felszabadulása minden _esetben a sejtek kristályokkal való érintkezését követő első órán belül történik. R. Rothenberg (1987) megállapította, hogy a PGE2 szintéziséhez szükséges arachidonsav fő forrásai a _{foszfatidilkolin} és a foszfatidiletanol-amin, és azt is megerősítette, hogy a foszfolipáz A2 _{és a NOX a PGE2termelésének} domináns útvonalai.

A PGE1 OFA kristályokra adott válaszként is felszabadulhat. GM McCarty és munkatársai (1993, 1994) a PGE2 _, a PGE és analógja, a misoprosztol hatását vizsgálták az emberi fibroblasztok OFA kristályokra adott mitogén válaszára. Mindhárom szer dózisfüggő módon gátolta a mitogén választ, a PGE és a misoprosztol kifejezettebb gátló aktivitást mutatott. A PGE2 és a misoprosztol, de nem a PGE2 _, gátolta a kollagenáz mRNS felhalmozódását OFA kristályokra adott válaszként.

MG McCarty és H. Cheung (1994) vizsgálták a PGE által kiváltott OFC-közvetített sejtaktiváció mechanizmusát. A szerzők kimutatták, hogy a PGE, amely a PGE2-nél és a PGE2-nél erősebb intracelluláris cAMP induktora _, gátolja az OFC által indukált mitogenezist és MMP-termelést egy cAMP-függő jelátviteli útvonalon keresztül. Lehetséges, hogy az OFC kristályok által indukált PGE-termelés növekedése egy visszacsatolási mechanizmuson keresztül gyengíti azok egyéb biológiai hatásait (mitogenezist és MMP-termelést).

Kristály okozta gyulladás

A kalciumtartalmú kristályok gyakran megtalálhatók az oszteoartrózisban szenvedő betegek ízületi folyadékában, azonban az akut gyulladásos epizódok leukocitózissal ritkák mind az oszteoartrózisban, mind a kristályokkal összefüggő ízületi betegségekben (például Milwaukee váll szindróma). A kristályok gyulladáskeltő potenciálját számos gátló tényező módosíthatja. R. Terkeltaub és munkatársai (1988) kimutatták, hogy a vérszérum és a plazma képes jelentősen gátolni a neutrofil granulociták válaszát a bázikus kalcium-foszfát kristályokra. Az ilyen gátlást okozó tényezők a kristálykötő fehérjék. Ezen fehérjék egyikének, egy ₂ -HS glikoproteinnek (AHSr) a vizsgálata kimutatta, hogy az AHSr a neutrofil granulociták OFC kristályokra adott válaszának legerősebb és legspecifikusabb inhibitora. Az AHSr egy máj eredetű szérumfehérje; Ismert, hogy más szérumfehérjékhez képest viszonylag magas koncentrációban található meg a csontokban és az mineralizáló szövetekben. Ezenkívül az AHSr jelen van a "nem gyulladt" ízületi folyadékban, és a natív ízületi folyadék bázikus kalcium-foszfát kristályain is kimutatták. Így nem zárható ki annak a lehetősége, hogy az AHSr in vivo modulálja a bázikus kalcium-foszfát kristályok flogogén potenciálját.

A fentiek összegzésére bemutatjuk az osteoarthritis patogenezisének két sémáját, amelyet WB van den Berg és munkatársai javasoltak. (1999) és M. Carrabba és mtsai. (1996), amelyek mechanikai, genetikai és biokémiai tényezőket kombinálnak.