A tuberkulózis laboratóriumi diagnózisa

A tuberkulózis olyan betegség, amely könnyen diagnosztizálható a modern körülmények között és a tudományos eredményekben. A tuberkulózis laboratóriumi diagnózisa központi szerepet játszik más diagnosztikai módszereknél, csak a röntgensugaras kutatási módszerek mellett.

[1], [2], [3], [4],

Klinikai vérvizsgálat

A tuberkulózisban szenvedő betegeknél a vér általános analízisében bekövetkező változások nem patognomonikusak. A tuberkulózis korlátozott és inaktív formáival a vörösvérsejt normális mennyiségben hipokróm. Amikor hatalmas beszűrődés vagy sajtos tüdőgyulladás, míg prevalenciája sajtos nyirokcsomó-specifikus bélrendszeri bántalmak, valamint a nagy tüdő vagy a posztoperatív vérzés és tudomásul erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. A makrocitózis, különösen a poikilotsitoz kevésbé gyakran találkoznak, általában súlyos vérszegénységgel. Retikulociták száma lépésben tuberculosis kompenzált tartományok 0,1-0,6%, a subcompensated - 0,6-1,0%, és 1% jellemzi dekompenzált retikulociták.

Amikor a tuberkulózis bizonyos esetekben előfordulhat, hogy egy mérsékelt leukocytosis (akár 15 ezer leukociták.), Kevesebb sugárzást, amelyek előfordulnak 2-7% betegek korlátozott és egyszerű folyamat előforduló formájában és 12,5% - roncsolásos és progresszív tüdő tuberkulózis .

A leggyakoribb eltolódások a leukocyta képletben fordulnak elő. Jelölje meg mind a relatív, mind a abszolút neutrofilit, a leukocita formula mérsékelt eltolódását balra a promyelociták előtt. A myelocyták nagyon ritkák a nem szövődményes tuberkulózis esetén. Számának növelése neutrofil rendellenes gabona vérkép TBC-s betegek mindig jelzi az az eljárás időtartama: súlyos tuberkulózis szinte minden neutrofil tartalmaz kóros gabonát. Amikor a tuberkulózis kitörése megszűnik, a nukleáris eltolódás viszonylag gyorsan megközelíti a normális értéket. A neutrofilek kóros granularitása általában hosszabb, mint a hemogram más változásai.

Az eozinofilok tartalma a perifériás vérben is változik a folyamat fázisától és a szervezet allergiás állapotától függően. Számuk addig csökken, amíg aneozinofiliya súlyos és tartós betegség kitörése, és fordítva, növekszik a reszorpciós beszűrődését és mellhártyaizzadmány, valamint a korai formái primer tuberkulózisban.

Az elsődleges tuberkulózis legtöbb formáját lymphopenia kíséri, amelyet néha évek óta megfigyelnek, még bizonyos változások hegesedését követően is. A másodlagos tuberkulózis a súlyosbodás fázisában a folyamat súlyosságától függően normális számú limfocitával vagy lymphopeniával járhat együtt.

Ez különleges helyet foglal el meghatározó vörösvértest-süllyedés további vizsgálatok értékelésére gümőkóros folyamat (ESR), amelynek értéke mozgásának értékelésénél tuberculosis folyamatot, és azonosítja az aktív formában. Növekedése ESR jelenlétét jelzi a kóros folyamat (a fertőző-gyulladásos, gennyes szeptikus, hemoblastosis, Hodgkin és mtsai.), És jelzi annak súlyosságától, de a normál szintek ESR nem mindig hiányát jelzi patológia. Gyorsítását vérsejtsüllyedés hozzájárulnak emelkedik a vér szintje globulinok, fibrinogén, a koleszterin, és csökkenti a vér viszkozitását. Lassú vérsejtsüllyedés jellemző járó állapotok hemokoncentrációt, tartalom növekedésével az albumin és az epesavak.

A tuberkulózisban szenvedő betegek hemogrammája a kezelés alatt megváltozik. A hematológiai eltolódások eltűnnek, annál gyorsabban, annál sikeresebb a terápiás beavatkozás. Mindazonáltal figyelembe kell venni a különböző antibakteriális szerek hemopoezisére gyakorolt hatását. Gyakran okoznak eozinofilit, néhány esetben - leukocytosis, és gyakrabban leukopenia az agranulocytosisig és a limfoid-retikuláris reakcióig. A szisztematikus hematológiai kontroll és a kapott adatok helyes elemzése alapvető fontosságú a beteg klinikai állapotának, a folyamat dinamikájának és az alkalmazott kezelés hatékonyságának értékeléséhez.

[5], [6], [7], [8], [9],

A vizelet klinikai vizsgálata

A vizeletrendszer tuberkulózisával a vizeletvizsgálat a fő laboratóriumi diagnosztikai módszer. Leukocyturia, erythrocyturia, proteinuria, hypoisostenuria, tuberculosis mycobacterium, nem specifikus bakteriuria figyelhető meg.

Leukocyturiában - a leggyakoribb tünet a tuberkulózis a húgyutak, a kemoterápia előtt és nincs külön, csak kivételes esetekben, mint a teljes elzáródását lumen a húgyvezeték. Nyecsiporenko teszt (meghatározása leukociták számának 1 ml vizelet) segít objektívebben mértékének értékelésére leukocyturia nefrotuberkuloze az, és bizonyos esetekben az azonosítást normál vizeletvizsgálat. Figyelembe kell venni azonban, hogy akut és krónikus pyelonephritis, cystitis, urethritis, vese és ureter kövek leukocyturia előfordulhat.

Eritrotsiturii. Valamint a leukocyturia. Az urogenitális rendszer tuberkulózisának egyik leggyakoribb laboratóriumi jele. A hematuria gyakorisága a folyamat előfordulási gyakoriságától függ, és nő a veseben a destruktív tuberkulózis kialakulása. A leukocyturia nélküli eritrocituria tipikusabb a vese tuberkulózis korai szakaszában. A leukocyturia fölött uralkodó hematuria fontos érv a vese tuberkulózis javára a nemspecifikus pyelonephritisben való megkülönböztetésében.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biokémiai vérvizsgálat

A tuberkulózissal a biokémiai paraméterek megváltozása elsősorban a folyamat fázisában, a szövődményekben és a különböző egyidejű betegségekben múlik. A tüdők és más szervek inaktív tuberkulózisában szenvedő betegeknél a vérszérum teljes fehérje és fehérje frakciói változatlanok és meghatározzák a normál tartalmat.

A betegség akut formáiban, valamint a tuberkulózis krónikus formáinak súlyosbodásával és progressziójával az albumin-globulin koefficiens csökken.

Alapvető értékelése funkcionális állapota szervi károsodás és a máj a tuberkulózis és szövődményei a meghatározása szérum össz-és direkt bilirubin, AST (ACT), alanin-aminotranszferáz (ALT). Az aminotranszferázok szintjének dinamikus meghatározása. A bilirubin a tuberkulózisos betegek kezelésében, különösen súlyos formában, kötelező eleme a tuberkulózisos betegek biokémiai vizsgálatának, és havonta kerül sor.

A vesék funkcionális állapotának vizsgálata magában foglalja a szérum kreatinin meghatározását és a glomeruláris filtrációs ráta kiszámítását a Cockcroft-Gault képlet szerint. A glomeruláris filtrációs ráta kiszámítása Reberg minta alkalmazásával kevésbé pontos eredményeket ad.

A tuberkulózisos betegek dinamikus biokémiai vizsgálatának fő célja a folyamat lefolyása, a gyógyszerek mellékhatásainak időben történő felismerése és a keletkező homeosztatikus rendellenességek megfelelő korrekciója.

[17], [18], [19]

A biokémiai vizsgálati módszerek alkalmazása extrapulmonalis tuberculosisban

A leginkább informatív mutató a tuberkulosztearinsav tartalom a biológiai folyadékokban, de meghatározása technikai nehézségekkel jár (a gázkromatográfia és a tömegspektrometria szükségessége).

Az adenozin-deamináz aktivitásának jövőbeli mérése - folyadékban meghatározott enzim: szinoviális, perikardiális, aszcitikus vagy gerincvelő. Az adenozin-deamináz fő termelői a limfociták és monociták. Az adenozin-deamináz biológiai folyadékok aktivitásának meghatározása megkönnyíti a tuberkulózis synovitis, a nyirokcsomók tuberkulózisának, a tuberkulózis-meningitis, a tuberculosis serositis diagnózisát.

Néhány biokémiai indikátort a nem-specificitásuk miatt csak biológiai folyadékokban határoztak meg, közel a lézió fókuszához. Mérje meg a mutatók szintjét a tuberkulin szubkután vagy intradermális injekciójával szemben (általában 48 órával és 72 órával ezután). Ezt követően a markerszint növelési fokát (% -ban) a kezdeti szinthez viszonyítva számítják ki.

A transzamnidáz szervspecifikus enzim aktivitásának vizelete optimális meghatározása, amelynek megjelenése a különböző típusú vesék veszteségében figyelhető meg. A transzamidináz vizsgálat csak a tuberkulin szubkután injekciójának feltételei alapján indokolt a helyi gyulladásos folyamatok súlyosbodása érdekében. Határozza meg a transzamidin aktivitását a vizeletben kezdetben és 24-72 órával az 50 TE tuberkulin bevezetése után. A fermentia 2-szeres és nagyobb mértékben történő bővítése lehetővé teszi az esetek 82% -ában, hogy megkülönböztessék a vesék aktív tuberkulózisát a krónikus pyelonephritis súlyosbodásától.

A női nemi szervek tuberkulózisával a vérben lévő haptoglobin és malonsavdialdehid koncentrációját provokációs tuberkulin tesztben állapítják meg. A szubkután injekciózott tuberkulin 50 TE és 72 órával később egy második biokémiai vizsgálatot végzett. A tuberkulózis etiológiája esetében a haptoglobinszint növekedésének mértéke nem kevesebb, mint 28%, és a malondialdehid szintje 39% vagy több. Az adenozin-deamináz aktivitását a Douglas térből nyert peritoneális folyadékban is meghatározzák. A punctate-t 72 órával a tuberculin intradermális injekciója után, 0,1 TE és 0,01 TE dózisok után vizsgáljuk az elülső hasfal felszínén megjelenő belső nemi szervek vetületére. A tuberkulózis-folyamat javára az adenozin-deamináz aktivitásának növekedése 10% vagy annál nagyobb, mint a kezdeti.

Amikor a szem érintett, megvizsgáljuk az antigén stimulációra adott válaszreakcióban fellépő fókuszreakciót. Nemkívánatos a kifejeződő válasz kialakulása, melyet a vizuális funkciók csökkenése kísér. Mivel az értékelés a legkisebb fókusztávolsága reakciók gyakran nehéz ajánlani a következtetésre tárgyasítás párhuzamosan van elhelyezve, és a mértéke megemelkedik a szérum haptoglobin vagy adenozin.

Valamennyi biokémiai vizsgálatot más módszerekkel együtt kell elvégezni.

[20], [21], [22], [23],

Véralvadási rendszer kutatás

Relevanciája a kutatási állapotát a véralvadási rendszer TB okozza jelenlétében betegek száma tüdőtuberkulózisban haemoptysishez vagy tüdővérzés, valamint hemokoagulációs komplikációk a sebészi kezelése a tuberkulózis. Ezenkívül az intravaszkuláris hemocoaguláció látens áramlása, amely természetesen kíséri a tuberkulózist, befolyásolja a betegség lefolyását és a kemoterápia hatékonyságát.

Azoknál a betegeknél, pulmonális TBC prevalenciája a váladékos gyulladás eleme a megfigyelt csökkenése a vérben antikoaguláns aktivitását. A betegek alacsony prevalenciája adott lézió a tüdőben túlnyomórészt produktív hemokoagulációs intravaszkuláris gyulladásos komponenst kifejezve enyhén. Azoknál a betegeknél, pulmonalis tuberculosis hemoptysis és tüdővérzés állapotban véralvadási rendszer más: a betegek alacsony vérveszteség a magassága gemoptoe vagy közvetlenül annak lejárta után van egy éles növekedést véralvadási képesség miatt súlyos intenzívebbé trombinoobrazovaniya miközben megnövekedett „szerkezeti” alvadási. Masszív vérveszteségben szenvedő betegeknél a véralvadási potenciál csökkenése figyelhető meg a fibrinogén koncentrációjának csökkenése miatt. A XIII faktor aktivitása, a vérlemezkeszám. A szakaszában sebészeti kezelés betegeknél korlátozott formában tüdőtuberkulózis jelentős megsértése rendszerrel homeosztázis bekövetkezik. Betegek elterjedt eljárás végrehajtása során a pnevmon- vagy plevropnevmonektomii gyakran alakul DIC, amelyek formája lehet a „második betegség.”

Figyelemmel kísérni az állami véralvadás betegekben tüdőtuberkulózisban kell végezni meghatározását az aktivált parciális tromboplasztin idő (aPTT), fibrinogén, trombin idő, protrombin index és a vérzési idő és a véralvadási időt.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonális kutatás

A modern kísérleti és klinikai megfigyelések azt mutatják, hogy a hormonális állapotban változás következik be egy adott tuberkulózis tüdőgyulladásban. Bizonyított, hogy a korrekció a zavar a hipofízis-mellékvese, agyalapi mirigy-pajzsmirigy rendszerek és a hasnyálmirigy működését együtt az anti-TB kezelés hozzájárul a aktiválását fibrogenezis és javítási egy lókusz specifikus gyulladás.

A funkcionális állapotát a hypophysis-pajzsmirigy rendszer megítélni tartalom a vérszérumban a trijód-tironin (T ₃ ), tiroxin (T ₄ ), az agyalapi mirigy a pajzsmirigy stimuláló hormon (TSH). Azt találtuk, hogy a szubklinikai hypothyreosis észlelünk 38-45% a betegek tüdő tuberkulózis, és a legtöbb gyakran diagnosztizálnak disszeminált és fibro-barlangos formák folyamatot. Ilyen azonos formáit a legtöbb drámaian csökkent szinten mind a T ₃ és T ₄, és ott jön egyenlőtlenség Ezen hormonok formájában arányának növelésére a T ₄ / T _s.

Mellékvesekéreg funkció értékeli a kortizol szintjét a vérszérumban, és endokrin funkciója a hasnyálmirigy - koncentrációja immunreaktív inzulin. A fertőző betegség akut fázisában nő az endogén kortizol és az inzulin iránti igény. A hiperinzulinémia is fel van tüntetve a test szöveti inzulinrezisztencia, ami jellemző a bármely aktív gyulladásos folyamat, különösen a specifikus. Meghatározása glyukokortiko idnoy-mellékvese funkció aktív tüdőtuberkulózisban jelenlétét mutatja Cushing a legtöbb betegnél. Normál kortizol szintjeit vérkoncentráció a beteg fertőző gyulladás akut időszakban kell tekinteni viszonylagos kudarcát glükokortikoid funkciója a mellékvese kéreg, amely alapjául szolgálhat tartására adagok megfelelő terápia a glükokortikoidok.

Közel egyharmada betegek tüdőtuberkulózisban lehet megállapítani, hogy a szint Ince-lin meglehetősen alacsony, és közel a normál tartomány alsó szintje, míg a 13-20% tapasztalt jelentős hyperinsulinémia. Mind a relatív hypo-, mind a hiperinzulinizmus nagy kockázati tényezők a különböző mértékű szénhidrát-metabolizmusok megsértésének kialakulásában. A hasnyálmirigy B-sejtjeinek funkcionális aktivitásában bekövetkező változások a glikémiás betegek rendszeres megfigyelését igénylik tuberkulózisban szenvedő betegeknél és a cukorbetegség időben történő megelőzésében. Ezen kívül. Ez további indokolást jelent az inzulin élettani dózisának a tuberkulózis komplex terápiájában történő felhasználásának célszerűségére.

Általában az alacsonyabb szintek a pajzsmirigy hormonok és egyensúlytalanság hiperkortizolémia és hiperinzulinizmus legnagyobb REACH súlyos során gümőkóros folyamat, kiterjedt tüdőkárosodás és súlyos tuberkulózis tünetei mérgezés.

A tuberkulózis mikrobiológiai diagnózisa

Mikrobiológiai vizsgálatok szükségesek, hogy azonosítsák a tuberkulózisban, ellenőrzését a diagnózist, a monitoring és a kemoterápia korrekció értékelő kezelési eredmény, más szóval, mivel a regisztráció a beteg tuberkulózis mielőtt eltávolítaná a Registry.

Minden epidemiológiai program és projekt a bakteriális excretorok számának értékelésén alapul, ami nem végezhető laboratóriumi módszerek alkalmazása nélkül a mycobaktériumok tuberkulózisának kimutatására. Az úgynevezett szervezett lakosság felmérésében a bakteriális behatolók aránya elérte a 70-et vagy annál többet, ami a laboratóriumi módszerek számára elegendően hatékony módszert jelent a tuberkulózis-betegek azonosítására ebben a populációcsoportban.

A tuberkulózis diagnosztikájának hagyományos mikrobiológiai módszerei bakterioszkópiás és kulturális vizsgálatok. A modern módszerek a mycobacterium tuberculosis automatizált rendszerekben történő termesztését, a PCR meghatározását tekintik. Mindazonáltal ezek a módszerek szükségszerűen kombinálódnak a klasszikus bakteriológiai módszerekkel.

Diagnosztikai anyaggyűjtemény

A laboratóriumi vizsgálatok hatékonysága nagymértékben függ a diagnosztikai anyag minőségétől. A diagnosztikai anyagok gyűjtésére, tárolására és szállítására vonatkozó szabályok betartása és a beteg értékelési algoritmájának pontos végrehajtása közvetlenül befolyásolja az eredményeket és biztosítja a biológiai biztonságot.

A tuberkulózis vizsgálata során különféle anyagokat használnak. Annak a ténynek köszönhetően, hogy a TB logkih- leggyakoribb formája tuberkulózis léziók, az alapanyag kutatási fontolóra köpet és más típusú levehető tracheobronchialis: felső légúti váladék után kapott aeroszol inhalációs: bronchiális mosófolyadékot; bronchoalveolar öblítés; kapott anyag bronchoscopia, és intrapulmonáris transztracheáiis biopsziák: hörgőaspirátumok, gége tamponokat, a váladékok a sebek és kenetek al.

A kutatás hatékonysága fokozódik, ha a páciensből származó anyag ellenőrzött gyűjtése történik. Ebből a célból speciálisan felszerelt helyiséget vagy speciális fülkét vásárolnak. Az anyaggyűjtés veszélyes eljárás, ezért anyagot kell gyűjteni a kutatásra vonatkozóan, figyelembe véve a fertőző biztonság szabályait.

A mycobacterium tuberculosis tesztelésére szolgáló anyagot steril palackokba kell összeszerelni szorosan csavarozott sapkákkal, hogy megakadályozzák a környezet szennyeződését és megvédjék az összegyűjtött anyagot a szennyezettségtől.

A diagnosztikai anyaggyűjtő injekciós üvegeknek a következő követelményeknek kell megfelelniük:

• ütésálló anyagból kell készülni;
• könnyen olvad az autoklávozás során;
• legyen elegendő térfogata (40-50 ml):
• széles nyílással rendelkezzen a köpet összegyűjtésére (átmérő nem kevesebb, mint 30 mm);
• könnyen kezelhető, átlátszó vagy áttetsző, hogy felmérje a minta mennyisége és minősége a fedél kinyitása nélkül.

Az optimális kutatási eredmények eléréséhez a következő feltételeket kell figyelembe venni:

• Gyűjtse össze az anyagot a kemoterápia megkezdése előtt;
• a vizsgálathoz szükséges anyagokat az élelmiszerek és gyógyszerek reggeli bevitele előtt kell összegyűjteni;
• a kutatáshoz kívánatos, hogy legalább 3 reggeli vértestet gyűjtsünk. Összegyűjtse a köpetet 3 egymást követő napon;
• az összegyűjtött anyagot a lehető leghamarabb el kell juttatni a laboratóriumba:
• abban az esetben, ha az anyagot a laboratóriumba azonnal lehetetlen szállítani, a hűtőszekrényben 4 ° C-os levegő hőmérsékleten, legfeljebb 48 órán keresztül tárolják;
• Az anyag szállítása során szorosan figyelni kell az injekciós üvegek integritását.

A helyesen gyűjtött köpet a nyálkahártya vagy a nyálkahártya. A vizsgált köpet optimális térfogata 3-5 ml.

A köpetet orvosi felügyelet mellett gyűjtik össze. A köpetbegyűjtésért felelős személyeknek bizonyos szabályok végrehajtását kell követniük:

• meg kell magyarázni a betegnek a vizsgálat célját és annak szükségességét, hogy ne köhesse meg a nyálat vagy a nasopharyngeális nyálkat, hanem a mély légúti traktus tartalmát. Ez elérhetõ egy olyan termékeny köhögés következtében, amely több (2-3) mély lélegzet után következik be. Azt is figyelmezteti a beteget, hogy először meg kell öblítse ki a száját forralt vízzel, hogy távolítsa el a legtöbb vegetál orális mikroflóra és az élelmiszer-törmelék, akadályozva köpet;
• a köpetgyűjtésben részt vevő orvosnak, a fürdőköpeny és a kalap mellett, maszkot, gumikesztyűt és gumi kötényt kell viselnie;
• mögött álló beteg, ajánlott, hogy a palack a lehető legközelebb a száját, és azonnal elválasztjuk neki köpet köpet, ahogy, ezért biztosítani kell, hogy a levegő áramlik távol az egészségügyi szolgáltató számára:
• A köpet összegyűjtése után az egészségügyi dolgozónak óvatosan zárja le az injekciós üveget fedővel, és értékelje az összegyűjtött köpet mennyiségét és minőségét. Ezután a palackot felcímkézzük, és egy speciális bixbe helyezzük a laboratóriumba való szállításhoz.

Ha a beteg nem termel váladékot, az este és kora reggel a gyűjtés napján az anyag szükséges, hogy adjon neki köptető :. Kivonat a gyökerek pillecukor (mukaltin), brómhexin, ambroxol, stb - vagy alkalmazza irritáló inhalációs berendezés használatával helyiségben felszerelt gyűjteni köpet. Az így összegyűjtött anyag nem védett, és a gyűjtés napján meg kell vizsgálni. Annak elkerülése érdekében, hogy "selejtezés" a laboratóriumban az irányba, hogy egy különleges jelet.

Ha nem végeznek mikrobiológiai vizsgálatokat ebben a létesítményben, az összegyűjtött diagnosztikai anyagot központilag kell a laboratóriumba szállítani, feltéve, hogy az anyagot a hűtőszekrényben vagy a tartósítószer használatával történő megőrzés alatt tartják. Szállítson anyagot a laboratóriumba a szállítási dobozokban, amelyek könnyen fertőtleníthetők. Minden mintát fel kell tüntetni a megfelelő címkével, és az egész tételt ki kell tölteni kísérő formanyomtatvánnyal.

[29], [30], [31],

A betegek vizsgálatának módja és gyakorisága

A beteg tuberkulózisának kezdeti, ún. Diagnosztikai vizsgálatánál legalább 3 köpetrészt kell megvizsgálni 2 vagy 3 napig. Amelyet az orvosi személyzet felügyelete alatt gyűjtöttek össze, ami növeli a mikroszkópia hatékonyságát.

A tuberkulózis elsődleges szűrését az egészségügyi rendszer összes orvosi diagnosztikai intézményének kell elvégeznie. A kezdeti vizsgálat hatékonyságának javítása érdekében a közelmúltban klinikai diagnosztikai laboratóriumok alapján úgy szervezték az ún. Mikroszkópos mikroszkópokat, amelyek modern mikroszkópokkal és járványbiztonsági eszközökkel vannak felszerelve.

A tuberkulózis elleni beavatkozások során egy szűrővizsgálatot alkalmaznak, amely magában foglalja a köpetvizsgálatot vagy más diagnosztikai anyagot legalább háromszor 3 napig. A kezelés alatt intenzív kemoterápiás fázisban rendszeresen havonta legalább egyszer mikrobiológiai vizsgálatokat végeznek. A kezelés fázisára való áttérésnél ritkábban végeznek vizsgálatokat - 2-3 hónapos intervallummal, míg a vizsgálat gyakorisága kétszeresére csökken.

Az extrapulmonalis tuberculosis diagnosztikai anyagának gyűjteménye

Feature kórbonctani anyag extrapulmonalis formái TB - Mycobacterium tuberculosis alacsony koncentrációban benne, amely megköveteli a érzékenyebb módszerek mikrobiológiai vizsgálatok, elsősorban a vetés technikák közegben.

A húgyúti rendszer tuberkulózisával a vizelet a leginkább hozzáférhető tanulmányi anyag. A vizeletgyűjtést egy speciálisan képzett nővérnek kell elvégeznie.

A külső nemi szerveket vízzel szappannal vagy gyenge kálium-permanganát oldattal mossuk. A húgycső külső megnyitását gondosan kezelik. Egy steril injekciós üvegben a reggeli vizelet átlagos részét gyűjti össze: férfiaknál, természetesen nőknél, katéter alkalmazásával. A vesemedence vizeletét egy vagy két vesék katéterezésével steril kémcsövekben gyűjtik össze, az utóbbi esetben - feltétlenül minden víztől elkülönítve. A vizelet kis mennyiségét centrifugáljuk, az üledéket megvizsgáljuk.

A férfiakban, a spermiumban, a nyálkahártyákat, a prosztata titkát centrifugálásnak vetjük alá, hogy csapadékot kapjunk. A férfiak genitális területének specifikus folyamatának bármely lokalizációjával a prosztata masszázs elősegítheti a mycobacterium tuberculosis tartalmú váladékok szekrécióját.

A nőkben a menstruációs vér összegyűjtése szúrással vagy Kafka sapkával történik. A kapott anyagot vörösvérsejtekből szabadítják fel, desztillált vízzel mosva, majd centrifugálással. A csapadékot megvizsgáljuk.

A méh nyaki csatornájából való allokációkat Kafka kapacitásában vagy sapkájában gyűjtik össze, vagyis kívánatos 1-2 ml kórokozó anyagot felhalmozni.

A vesék, nemi szervek operatív beavatkozásaiból nyert anyagok. Biopsziákkal, kapszulákkal az endometriumból, homogenizálódnak. Ehhez steril habarcsot kell elhelyezni, és steril ollóval alaposan összetörni. Ehhez a szuszpenzióhoz hozzáadunk steril folyami homok mennyisége egyenlő annak tömegével, majd feltöltjük a 0,5-1.0 ml izotóniás nátrium-klorid-oldattal, és minden trituráltuk, amíg pasztaszerű masszát azzal a kiegészítéssel, izotóniás nátrium-klorid-oldatot (4-5 ml). Ezután a tömeget 1-1,5 percig hagyjuk ülepedni, a felülúszót megvizsgáljuk.

A csontok és az ízületek tuberkulózisa. A steril fecskendővel kapott punctátumot (tályogpor) steril edényekbe helyezzük, és azonnal a laboratóriumba szállítjuk. A steril pipettát, amelyet előzőleg steril izotóniás nátrium-klorid-oldattal nedvesítettek, 2-5 ml injekciót adjon át, átvinjen egy palack gyöngyökre és további 2-3 ml izotóniás nátrium-klorid-oldatot adjon hozzá. Az üveget parafával lezárják, és 8-10 percig rázogatják a vadászgépben. A homogenizált szuszpenziót megvizsgáljuk.

Az oszteoarticularis tuberkulózis fistuláris formáin a fistulából származó gennyet vesznek. A bőséges ürítés közvetlenül egy kémcsőbe kerül. Azokban az esetekben, sovány ínysorvadás sipoly mossuk steril, izotóniás nátrium-klorid-oldattal, és a mosófolyadékot összegyűjtöttük egy kémcsőbe, vagy a darab impregnált tampon genny elemzésre elküldeni.

Sebészeti kapott anyagot a műtét során a csontok és ízületek állhat gennyes-nekrotikus tömegek, granulátumok, heg, csontszövet ízületi hártyában és az egyéb szubsztrátok. A kezelést, mint a vesék tuberkulózisában végzik.

A szinoviális folyadék mikrobiológiai vizsgálata 3% -os nátrium-citrát-oldatban (1: 1 arány) a koaguláció megelőzésére közvetlenül a lyukasztás után történik.

A nyirokcsomók tuberkulózisa. A nyirokcsomók puncturálása során kivont gént szintén megvizsgáljuk. Mint a tályogok. A műtéti beavatkozások során nyert nyirokcsomók szöveteit, a biopsziákat, a tuberkulózis más formáihoz hasonlóan vizsgálják.

A mycobacterium tuberculosis széklet tömegének vizsgálata rendkívül ritka, a pozitív eredmények szinte teljes hiánya miatt.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium microscopy

A köpetmikroszkópia viszonylag gyors, egyszerű és olcsó módszer, amelyet minden esetben gyaníthatóan tuberkulózissal kell alkalmazni. Ezenkívül ez a vizsgálat a kemoterápia hatékonyságának értékelésére és a kezelés helyreállítására vagy meghibásodására utal, ha nincs tenyésztési vizsgálat.

Kétféle mikroszkópos vizsgálati módszert alkalmaznak:

• közvetlen mikroszkópos módszer, ha a kenet közvetlenül a diagnosztikai anyagból készül;
• a dekontamináns anyaggal előállított üledék mikroszkópos vizsgálata tenyésztésre.

Az első módszert azon laboratóriumokban alkalmazzák, ahol csak mikroszkópos vizsgálatokat végeznek (az általános orvosi hálózat klinikai és diagnosztikai laboratóriuma).

A mikroszkópos vizsgálat legjobb eredményeit a diagnosztikai anyag (például centrifugálással) koncentrálásával nyerik.

A mikroszkópos vizsgálat során a mycobacterium tuberculosis 50% -os valószínűséggel történő kimutatásához 1 ml köpetnek több mint 5000 mikrobás sejtet kell tartalmaznia. A tuberkulózis tüdőformáiban szenvedő betegek köpetében általában jelentős mennyiségű savas baktérium található, amely lehetővé teszi számukra, hogy a bakterioszkópia megbízhatóan kimutatható legyen. Ennek a módszernek a diagnosztikus érzékenysége javítható egy páciens több köpetmintájának vizsgálatával. A bakterioszkópos vizsgálat negatív eredményei nem zárják ki a tuberkulózis diagnózisát, mivel egyes betegek köpetében kevesebb mikobaktérium található, mint mikroszkópos vizsgálattal. A köpet kimutatásának gyenge előkészítése a bakterioszkópos vizsgálat negatív eredményét is okozhatja.

A savas gyors mycobacteriumok kimutatásának legáltalánosabb módszere a kenetben Tsiol-Nelsen szerint. Az eljárás alapja a karbolikus fuzin mikrobiális sejtbe való behatolása egy membránon keresztül, amely viaszos lipidréteget tartalmaz, miközben a fenol fűtött és erős marató hatású. A kenet kései 25% -os kénsavval vagy 3% -os sósavoldattal való elszíneződése az összes nem saválló szerkezet elszíneződéséhez vezet. A kenet elszíneződött elemeit 0,3% metilénkék-oldattal festjük. A mycobacteriumok nem érzékelik a szokásos anilin színezékeket, aminek következtében a savas gyors mikobaktériumok karmazsinvörösre festenek, és más mikrobák és sejtelemek - kék.

A festett keneteken által Ziehl-Nelsenu használni fényt binokuláris mikroszkóp immerziós objektívvel (90- vagy 100-szeres növekedés), és a szemlencsét a 7- vagy 10-szeres nagyítással. Fedezze fel a 100 látómezõt, amely elegendõ ahhoz, hogy egyetlen kórokozót beazonosítson a kenetben. Abban az esetben, ha egy ilyen vizsgálat eredménye negatív, a megerősítéshez 200 további látómezőt kell javasolni. Jegyezzük fel az eredményeket, jelezve az észlelt savas gyors bacillák számát (KUM).

Ezen technika mellett színes fluorokrómokat használnak a lumineszcens mikroszkópiához, amely lehetővé teszi a legjobb eredmény elérését. Ennek a módszernek a használata 10-15% -kal növeli a mikroszkóp hatékonyságát. Amikor a mycobacteriumokat lumineszcens színezékekkel (auramin, rodamin stb.) Kezelik, ezek az anyagok a mikrobás sejt viaszszerű szerkezetéhez is kötődnek. Amikor a színes sejteket izgalmas fényforrással sugározzák (az ultraibolya sugárzás egy bizonyos spektruma), narancssárga vagy élénkvörös fényt sugároznak fekete vagy sötét zöld háttéren. A látható kép nagy fényereje és kontrasztja miatt a mikroszkóp általános nagyítása 4-10-szeresére csökkenthető, a látószög megnő és a készítmény megtekintési ideje csökken. Ezzel együtt, a sokkal nagyobb mélységélesség miatt növelheti a tanulmány kényelmét.

Ha fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatot végeznek ugyanazon a területen, akkor a kenet jelentősen kevesebb időt vesz igénybe, mint a Tsiol-Nelsen festés fénymikroszkópos vizsgálatával. Ha egy munkanapon egy mikroszkóp kb. 20-25 ilyen kenetet vizsgál meg, majd fluoreszcens mikroszkóppal egyszerre több mint 60-80 mintát vizsgál meg. A tapasztalt mikroszkópusok tudják, hogy az auramin és a rodamin keverékében a sejtek színezése bizonyos szempontból specifikus a savas gyors bacillusok számára, amelyek ebben az esetben aranyszínűek. A saprofiták zöldes színűek.

Egy másik fontos előnye a módszernek a fluoreszcens mikroszkóp - képes érzékelni megváltozott Mycobacterium, elveszett hatása alatt kedvezőtlen tényezők, beleértve az intenzív kemoterápia, kislotousotoychivosti tulajdon, és nem detektálható ezzel kapcsolatban festéssel Ziehl-Nelsenu.

A fluoreszcens mikroszkópos módszer hátrányai közé tartozik a mikroszkóp viszonylag magas költsége és működése. Mindazonáltal központosított vagy más nagy laboratóriumokban, ahol a terhelés meghaladja a három hagyományos mikroszkóp segítségével működő laboratóriumi technikus normáját, olcsóbb egy fluoreszcens mikroszkópot használni.

A bakterioszkópos módszerek meglehetősen magas fajlagossággal rendelkeznek (89-100%). A mikroszkópos módszerrel nyert pozitív eredmények körülbelül 97% -át egyértelmûen igazolja a vetés eredménye.

Meg kell jegyezni, hogy a mikroszkopikus vizsgálata kenetek patológiás anyag nem tudja azonosítani a faj saválló bacilusok észlelt. Mikroszkópos módszer lehetővé teszi, hogy véleményt csak a jelenléte vagy hiánya sav előállítására mikroorganizmusok, ami azzal magyarázható, a létezése a természetben számos morfológiailag hasonló tuberkulotikus mycobacteriumok komplex nontubercular saválló mikroorganizmusokat.

A mikroszkópos eredményeket félkvantitatív egységekben értékeljük.

A különböző mikroszkópos módszerek eredményeinek összehasonlítása érdekében empirikus együtthatókat vezetünk be. Például, hogy hasonlítsa össze az eredményeket a festett keneteken fluoreszcens festékekkel, az adatok kutatási fénymikroszkóp (1000-szoros nagyításban), meg kell osztani a számát saválló bacilusok által észlelt fluoreszcens mikroszkóp, a megfelelő együttható 250-szeres nagyítás - a 10, 450-szeres - 4-re, 630-szorosra - 2-re.

Az extrapulmonáris tuberkulózis mikroszkópos vizsgálata

Közvetlen mikroszkópiát végzünk, valamint a dúsítás után elkészített kenetek mikroszkópját, majd Tsiol-Nelsen festést vagy lumineszcens festékeket. A kenetek közvetlen mikroszkópos vizsgálata hatástalanná vált az anyagban lévő alacsony koncentrációjú mycobacteriumok miatt, ezért ésszerűbb a dúsítás módszereinek használata. A leghatékonyabb a centrifugálás. Ha a biológiai anyag viszkózus, centrifugálást alkalmazva egyidejű cseppfolyósító és homogenizálása az anyag, amely végezzük nagysebességű centrifugák a centrifugális erő 3000 g és hipoklorit oldatok. A dúsítás egyéb módszerei, mint például a mikro-flotáció, jelenleg nem használatosak biológiailag veszélyes aeroszolok kialakulása miatt.

[37], [38],

A tuberkulózis diagnózisának kulturális módszere

A vetés módja vagy a tenyésztési módszer érzékenyebb, mint a kenet mikroszkópiája, és számos előnye van az utóbbiaknál. Ez lehetővé teszi több tucat életképes mikobaktérium kimutatását a vizsgálati anyagban, és nagy diagnosztikai értékkel bír. Ez különösen fontos olyan újonnan diagnosztizált vagy kezelt betegek anyagának vizsgálatakor, akik kis mennyiségű mycobacteriumot bocsátanak ki.

Összehasonlítva mikroszkópia, kultúra számának növelése észlelt tuberkulózis több mint 15-25%, valamint ellenőrzését a tuberkulózis a korábbi szakaszában, amikor a betegség még mindig jól reagál a kezelésre. A tenyésztési vizsgálat nagyon fontos előnye a gerjesztő tenyészet megszerzésének lehetősége, amely azonosítható és tanulmányozható a gyógyszerérzékenység, a virulencia és más biológiai tulajdonságok tekintetében.

A termesztési módszerek hátrányai közé tartoznak az időtartamuk (az anyagok várakozási ideje eléri a 10 hetet). Magasabb költség, a diagnosztikai anyag feldolgozásának összetettsége.

A diagnosztikai anyag kezelésének alapelvei

A hagyományos mikrobiológiai módszerek nem alkalmazhatók tuberkulózisra vonatkozó vizsgálatok elvégzésére. Ez annak köszönhető. Hogy a mycobacterium tuberculosis nagyon lassan növekszik, és a legtöbb klinikai minta gyorsan növekvő pyogén és rothadó mikroorganizmusokat, gombákat tartalmaz. Gyors növekedésük a gazdag tápközegben a mycobacteriumok kifejlődését gátolja, és nem teszi lehetővé a tuberkulózis kórokozójának izolálását, így a diagnosztikai anyagot elő kell vetni a vetés előtt. Ezenkívül a páciens légutakból felszabaduló mikobaktériumokat általában nagy mennyiségű nyálka veszi körül, ami megnehezíti a koncentrálást. E tekintetben, a köpet és más hasonló anyagok ültetése előtt, cseppfolyósításukra szükség van a dekontaminálásra.

Minden detergens és dekontamin a mycobacteriumban többé-kevésbé kimondott toxikus hatást fejt ki. A feldolgozás eredményeképpen a mycobacteriumok akár 90% -a is meghal. Annak érdekében, hogy elég a mikobakteriális lakosság, megkímélve annak szükségességét, hogy feldolgozási technikák, amelyek lehetővé teszik, egyrészt, hogy elnyomja a gyorsan növekvő gennykeltő baktériumok és büdös, és a másik -, hogy megőrizze életképességét mikobaktériumok jelen az anyagban.

Attól függően, hogy az anyag, a homogenitás fokát, és a szennyezés előtti feldolgozás segítségével különböző mentesítő: köpet - 4% -os nátrium-hidroxid-oldattal, oldatok trohzameschonnogo nátrium-foszfát 10%, a benzalkónium-klorid, trinátrium-foszfát, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisztein nátrium-hidroxid) jelenlétében, a végső koncentráció 1% nátrium-hidroxid, a vizelet és más folyékony anyagok - kénsav oldat 3%, a szennyezett minták, zsír-tartalmú anyagok - oxálsav-oldattal és 5%. Ezenkívül bizonyos esetekben enzimeket, felületaktív anyagokat (detergenseket) használnak. A Tween és más detergensek használatát a mycobacterium sejtek kisebb halála kíséri (40-50% túlél). Azonban csak folyékony anyagokhoz használhatók. A világ legnagyobb eloszlása a NALC-NaOH volt. Készletekben. Ez a módszer lehetővé teszi a mycobacterium sejtek populációjának több mint 85% -át. Dekontaminálási tkanesoderzhaschih szilárd nehezebb kitalálni, mert a mértéke az anyag szétszóródása homogenizálás során nehéz. Például a nyirokcsomók biopsziájának kezelését gyakran kíséri az idegen növényzet szennyezettségének fokozott gyakorisága. Ebben az esetben 1% etónium használható.

A nem homogén anyagot üveggyöngyökkel homogenizáljuk dekontaminánsok jelenlétében. A folyékony anyagokat elő-centrifugáljuk, és csak a csapadékot kezeljük.

Vetési és inkubációs technikák

Az előkezelést követően az anyagot centrifugáljuk, ezáltal kicsapjuk a mikobaktériumokat, és növeljük az üledék tartalmát ("iszap-dúsítás"). A kapott csapadékot semlegesítjük és beoltjuk (beoltjuk) sűrű tápközeggel vagy folyékony (félig) táptalajjal ellátott csövekkel. Az üledék többi részéből a kenetek mikroszkópos vizsgálat céljából készülnek. A vetési eljárásnak meg kell akadályoznia a diagnosztikai anyag keresztszennyeződését.

A mikrobiológiai vizsgálat eredményeinek megbízható klinikai értelmezéséhez a következő szabályt kell figyelembe venni: a mikroszkópos és a tenyésztési vizsgálatokat párhuzamosan kell elvégezni a diagnosztikai anyag ugyanazon mintáján.

A beoltott csöveket egy termosztátba helyeztük 37 ^° C-on 2 napig vízszintes helyzetben. Ez biztosítja az anyag egyenletesebb felszívódását a tápközegbe. 2 nap elteltével a csöveket függőleges helyzetbe helyezzük és gumi vagy szilikondugóval hermetikusan lezárjuk, hogy megakadályozzuk a vetett közeg szárítását.

Crops inkubáltuk 37 ^kb C-on 10-12 hétig rendszeres heti megtekintésére. Az egyes előnézeteknél a következő paraméterek kerülnek rögzítésre:

• a vetésnövekedés napjától vizuálisan megfigyelt időszak;
• növekedési ráta (CFU-k száma);
• a növény idegen mikrobiológiai növényekkel vagy gombákkal való szennyezése (ilyen csövek eltávolítása);
• a látható növekedés hiánya. A csövek a termosztátban maradnak a következő megjelenésig.

Tápanyag

A mycobacteriumok termesztésére különféle tápanyagokat használnak; sűrű, félfolyékony, folyékony. Azonban egyik ismert tápközeg sem rendelkezik tulajdonságokkal, amelyek biztosítják a mycobacterium sejtek növekedését. Ennek kapcsán javasoljuk, hogy a különböző összetételű tápközegeket egyidejűleg használják a hatékonyság növelése érdekében.

A WHO a Levenstein-Jensen környezetet ajánlja a tuberkulózis kórokozójának elsődleges elkülönítésének és a gyógyszerérzékenység meghatározásának szabványos közegeként. Ez egy sűrű tojás környezet, amelyen a mycobacteriumok növekedését a bakterioszkópikusan pozitív anyag beültetése után 20-25. Napon érik el. A bakterioszkóposan negatív növények termése hosszabb inkubációs időt igényel (legfeljebb 10-12 hétig).

Hazánkban a javasolt E.R. Finn tojás környezet Finn-II. Ez abban különbözik, hogy az L-aszparagin helyett nátrium-glutamátot használ, ami a mycobacteriumok aminosavainak szintetizálására más módokat indít el. Növekedés jelenik meg eközegben kissé korábban, és a mycobacteriumok elosztásának gyakorisága 6-8% -kal magasabb, mint a Lowenstein-Jensen tápközegben.

Az extrapulmonalis tuberculosis bakteriológiai diagnózisának hatékonyságának javítása érdekében tanácsos a módosított Finn-II táptalajt a tápanyag-táptalaj komplexbe beépíteni. A növekedés felgyorsítása érdekében 0,05% nátrium-tioglikolátot, amely csökkenti az oxigénkoncentrációt, hozzáadódik a Finn-II táptalajhoz. A mycobacteriumok enzimrendszereinek védelme a lipid peroxidáció toxicitásától a Finn-II táptalajban 0,001 μg / ml koncentrációban adjuk hozzá az antioxidáns α-tokoferol-acetátot. A diagnosztikai anyag vetését szabványos eljárás szerint végezzük.

Az oroszországi tuberkulózis elleni laboratóriumokban a sűrű tápközeg más módosításait alkalmazzák; javasolt G.G. Mordovian táptalaj "New", amelyet V.A. Anic táptalajok A-6 és A-9 stb.

Annak a ténynek köszönhetően, hogy a folyamat a kemoterápia károsíthat számos metabolikus rendszerek mikrobiális sejtek, néhány mycobacterium populáció elveszti azt a képességét, hogy dolgozzon rendesen hagyományos tápközegekben, és előírja, ozmotikusan kiegyensúlyozott (vagy félig-folyékony) táptalajon.

A diagnosztikai anyag vetési eredményeinek értékelése és rögzítése

Egyes törzsek és fajok a mycobacteriumok lassan növekednek, a növekedés még a 90. Napig is megjelenhet. Az ilyen növények száma kicsi, de ez lehetővé teszi a növények termesztésben való elviselését 2,5-3 hónapon keresztül.

A mycobacterium tuberculosis virulens kultúrái általában különböző méretű és fajú R-formájú kolóniák sűrű tojás környezetében nőnek. A telepek szárazak, ráncosak, elefántcsontok, enyhén pigmentáltak. Más médiumokban a mycobacterium tuberculosis kolóniája nedves lehet. A kemoterápia folyamán vagy a kezelés alatt sima, nedves növekedésű (S-formájú) telepeket lehet felosztani.

A növények izolálása során speciális tanulmányok sorozatát használják a mycobacterium tuberculosis megkülönböztetésére a nem tuberkulózis mycobacteriumoktól és saválló szaprofitáktól.

Pozitív választ adnak a meggyőződött Tsiol-Nelsen-kenetről származó megfestett mikroszkopikus vizsgálat után. A mycobacteriumok kenetben való növekedése esetén világos piros pálcák találhatók, amelyek egyedül vagy olyan csoportokban találhatók, amelyek klasztereket alkotnak nemezben vagy zsinórban. Fiatal tenyészetek, különösen izolált hosszú távú kezelés a betegek kemoterápiával, mycobacteriumok különböznek az expresszált polimorfizmus, amíg a jelenléte rúd alakú, valamint a rövid, szinte coccoid vagy hosszúkás változatok, melyek hasonlítanak a micélium.

A mycobacteriumok növekedési ütemét a következő séma mutatja: (+) - 1-20 cfu in vitro (csekély bakteriális kiválasztódás); (++) - 20-100 CFU in vitro (mérsékelt bakteriális kiválasztódás); (+++) -> 100 CFU in vitro (bőséges bakteriális kiválasztódás). A tuberkulózis laboratóriumi diagnózisában nem elégséges annak megállapítása, hogy a mycobacteriumot egy vagy másik módszerrel észlelték-e. Részletesen megismertesse a mycobacterial populáció mértékét és jellegét, összetételét és tulajdonságait. Ezek az adatok lehetővé teszik számunkra, hogy helyesen értelmezzük a folyamat állapotát, tervezzünk taktikákat és korrigáljuk a kezelést.

Az utóbbi években a mycobacteriumok növekedésének felgyorsítása érdekében a táptalajokat agar alapon, különböző növekedési adalékokkal és speciális gázkeverék alkalmazásával javasoltak. A mycobacteriumok ezen médiumokon való növekedésének elérése érdekében a termesztés során nagy mennyiségű szén-dioxid (4-7%) atmoszférát hoznak létre. E célból speciális CO ₂ inkubátorokat használnak . Azonban a legfejlettebb automatizált rendszerek a mycobacteriumok termesztésére: MGIT-BACTEC-960 és MB / Bact.

Az egyik ilyen rendszer - MGIT rendszer (mycobaktériumok növekedését jelző cső), arra utal, hogy a magas technológia és a célja a gyors bakteriológiai diagnosztizálására tuberculosis és a Mycobacterium érzékenységet első vonalbeli gyógyszerekkel, és néhány második vonalbeli szerek. Az MGIT a VASTES-960 készülék részeként használja. A mikroorganizmusokat speciális csövekben tenyésztik folyékony táptalajjal a módosított Middlebrook-7H9 táptalajon alapulva. A mycobacteriumok növekedésének ösztönzése és az idegen mikroflóra növekedésének elnyomása érdekében az MGIT Growth Supplement és PANTA antibakteriális gyógyszerek keverékét alkalmazzák.

A mikroorganizmusok növekedését optikailag rögzítjük. A fluoreszcencia alapja, amely akkor következik be, amikor oxigént fogyasztanak a mycobacteriumok a növekedés alatt. Az oxigénfüggő fluorokróm festék egy speciális kémcső alján található, és szilikonnal borított. Szaporodás mikobaktériumok csökkenéséhez vezet a mennyiségű oxigént a csőben, és csökkenti a koncentrációt, amely növekedést okoz a fluoreszcencia, amely láthatóvá válik besugárzás alatt ultraibolya fény által csövek és automatikusan regisztrált fényérzékelő beépített készülék VASTES-960. A lumineszcencia intenzitását növekedési egységekben (GU-növekedési egységek) jegyzik. A növekedési adatokat a számítógép rögzíti, ahol automatikusan menthetők. Számítógépes elemzés növekedési görbék tájékoztatást tudnak nyújtani jelenléte a különböző Mycobacterium medencével, köztük nontubercular, és abban is segít, hogy értékelje a növekedési tulajdonságait mikobaktériumokra.

Ennek eredményeként a megjelenésének időpontját ilyen rendszerek mikobakteriális növekedést jelentősen csökken, átlagosan 11 nappal VASTES-960 és 19 nap MB / Bact, hogy 33 nap a standard szilárd táptalajon. Meg kell jegyezni, hogy ezek a rendszerek magasan képzett személyzetet igényelnek. Vetés anyag folyékony közeget az kíséretében vetés Löwenstein-Jensen táptalajon, a játék szerepe a beugró az esetekben, amikor más média Mycobacterium tuberculosis nem teszik lehetővé a növekedést.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

A mycobacteriumok gyógyszerérzékenységének meghatározása

A mycobacteriumok spektrumának és fokozott érzékenységének meghatározása a tuberkulózis elleni gyógyszerek számára nagy klinikai jelentőségű, valamint a tuberkulózis gyógyszeres rezisztencia terjedésének epidemiológiai értékeléséhez. Ezenkívül a kábítószer-rezisztencia nyomon követése lehetővé teszi a tuberkulózis-program egészének hatékonyságának felmérését, amely szerves mutatója a tuberkulózis elleni tevékenységek összes összetevőjének teljesítményének.

A gyógyszerérzékenység többszöröse és időzítése:

• a kezelés kezdete előtt egyszer a kezelés stratégiájának és taktikájának meghatározására:
• ha különféle anyagokból (köpet, BAL folyadék, vizelet, exudátumok, likőr stb.) származó beteg kultúrákból izolálunk, akkor minden izolált törzset megvizsgálunk:
• a kezelés intenzív fázisának végén a klinikai és radiológiai dinamika hiányában:
• ha a kezelést a következő esetekben módosítani szükséges:
  • a köpet kimutatásának hiánya;
  • a tenyészet újbóli izolálása utána a köpet-negatív;
  • a CMB számának drasztikus emelkedése a tamponban a kezdeti hanyatlás után. Ismeretes, hogy a mycobacterium tuberculosis törzsei, amelyek a gyógyszerérzékenység szempontjából heterogének, izolálják a tuberkulózisban szenvedő beteg anyagából. A törzsek érzékenysége a tuberkulózis elleni szerek esetében a gyógyszer hatókörében, fokozatosságában, gyakoriságában és az ellenállás előfordulásának sebességében különbözhet.

A mértéke gyógyszer-rezisztencia a Mycobacterium tuberculosis-t megfelelően meghatározott kritériumok szerint, amelyek középpontjában a klinikai jelentősége és a stabilitás aktivitásától függ az anti-TB hatóanyag, annak farmakokinetikai, a koncentráció a lézió. A maximális terápiás dózis és így tovább.

A mycobacteriumok gyógyszerérzékenységének meghatározása jelenleg mikrobiológiai módszerekkel történik:

• Abszolút koncentrációk (hígítási módszer sűrű vagy folyékony táptalajon),
• arányok,
• ellenállás együtthatója.

Általában a stabilitás nyilvánul vizuálisan megfigyelhető kolónia növekedési Mycobacterium tuberculosis, de vannak olyan technikák, amelyek indukálják a növekedés korai szakaszában az osztódó sejtekben a Mycobacterium formájában színreakció. Ezek a módszerek rövidítik a vizsgálati időt 3-4-ről 2 hétre.

Mivel egységes Oroszországban bővült, a WHO által ajánlott bizottság kemoterápiás módszer abszolút koncentrációk, ami módszertani szempontból a legegyszerűbb, de megköveteli a nagy pontosságú és szabványosítása laboratóriumi eljárások. A kábítószer-érzékenységi teszt egy tesztcsövekből áll, amelyek TB-ellenes szerekkel módosított tápközeggel rendelkeznek. A készlet áll 2-3 csövek különböző koncentrációjú egyes gyógyszerek használt, egy kontroll cső gyógyszer nélkül, hogy a környezet és az egyik cső, amely 1000 mcg / ml nátrium-Sali tsilovokislogo vagy 500 ug / ml paranitrobenzoynoy sav nontubercular kimutatására mycobaktériumok növekedését.

A késztermékkészlet készítéséhez egy módosított Levenstein-Jensen táptalajt használunk (keményítő nélkül), amelyet lombikba öntünk. Mindegyik lombikban hozzáadjuk az antituberkuloid készítmény megfelelő hígításának megfelelő mennyiségét. A lombik tartalmát alaposan összekeverjük, csövekbe öntjük, és ferde helyzetben, 40 percig 85 ° C-os hőmérsékleten hajtjuk. Javasoljuk, hogy a médiumot automatikus visszacsévélővel automata hőmérsékletszabályozással tekerje. Szerdán anti-TB kábítószerekkel

Az 1-es sorozat a hűtőszekrényben 2-4 ° C-on 1 hónapig tárolható, a második sor készítésére - legfeljebb 2 hétig. A médiumok szobahőmérsékleten történő előkészítésével történő tárolása elfogadhatatlan. A tuberkulózis elleni szerek oldatainak elkészítésekor figyelembe veszik azok aktivitását, kiszámítva a készítmény nem specifikus részének molekulatömegére, a tisztaságra stb. Beállított koncentrációt. A gyógyszerérzékenység meghatározásához csak kémiailag tiszta anyagokat használnak.

A módszer elve az antituberkuluszos gyógyszer koncentrációjának meghatározása, amely gátolja a mycobacterialis populáció egy jelentős részét. Ha helyesen történik, akkor ez a módszer jó megbízhatósággal bír.

A vizsgálat előtt meg kell győződni arról, hogy a mycobacterium tuberculosis izolált tenyészete nem tartalmaz idegen mikroflórt. A mikobaktériumok tenyészetéből 0,9% -os nátrium-klorid-oldatból 500 ml mikroorganizmus / ml-t tartalmazó homogén szuszpenziót állítunk elő (5 egység optikai zavarossági standard). A kapott szuszpenziót 0,9% -os nátrium-klorid-oldattal (1:10) hígítjuk, és 0,2 ml szuszpenziót adunk a tenyésztő tápközeg minden egyes csőéhez. A beoltott kémcsöveket egy inkubátorban 37 ° C-on, és tartott vízszintes helyzetben 2-3 napig, hogy a lejtős felület a táptalajt egyenletesen inokuláljuk szuszpenzió Mycobacterium tuberculosis. A csöveket ezután függőleges helyzetbe helyezzük és 3-4 hétig inkubáljuk. Az eredményeket 3-4 hét után rögzítjük.

Mivel a klinikai anyagból a táptalajon levő ürülékkiválasztás időzítése legalább 1-1,5 hónap, a módszerrel a gyógyszerérzékenység meghatározásának eredményei legkorábban 2-2,5 hónappal az anyag vetése után érhetők el. Ez a módszer egyik fő hátránya.

Értsd meg a mycobacteriumok gyógyszerérzékenységének meghatározásának eredményeit bizonyos kritériumok alapján. A szilárd táptalaj-tekinthető érzékeny a koncentrációja a gyógyszer, amely a közegben, ha a telepek számát a mycobaktériumok termesztett in vitro ez a gyógyszer nem több, mint 20, bőséges növekedés a kontroll csőbe gyógyszerek nélkül. Csak a 20 gyarmatnál jelenlévő kultúrában a kultúra a koncentrációnak ellenálló. A gyakorlatban a növekedés során a vizsgálati csövek közel 20 cfu értéket eredményeznek. A klinikai egységet értesíteni kell arról, hogy az érzékenység vagy az ellenállás ebben az esetben határvonal, mivel néha megmagyarázhatja a klinikai mutatók fuzzy dinamikáját.

Különböző gyógyszerek esetében létrejött egy bizonyos koncentráció, amelynél megfigyelhető a mikobaktérium populáció kritikus arányának reprodukálása. Ezeket a koncentrációkat "kritikusnak" nevezzük. A stabilitás kritériumaként a mycobacteriumok populációjának növekedését egy tápközegben kritikus koncentrációjú készítményben alkalmazzuk.

A hazai TB gyakorlatban a gyógyszerrezisztencia meghatározásakor nem korlátozódnak kizárólag kritikus koncentrációk meghatározására. Ez annak köszönhető. Hogy a kiterjesztett meghatározása szintje a gyógyszer-rezisztencia lehetővé teszi a klinikus számára, hogy pontosabban pozícionálja a taktikák kemoterápia segítségével ismerete potenciáló hatásának gyógyszer-kombinációk, cikkcakk várhatóan rezisztenciát, vagy alkalmazhatunk a hatékonyabb gyógyszerek csoport használt anti-TB gyógyszerek.

Az abszolút koncentráció-módszer a legegyszerűbb, de a legérzékenyebb a végrehajtás során végrehajtott hibák esetében is. Megbízhatóbb, különösen a második vonalbeli gyógyszerek érzékenységének meghatározása és az Oroszországon kívüli közösség meghatározása az arányok módszerével. Figyelembe veszi az abszolút koncentrációk módszerének hiányosságait, de végrehajtásuknál sokkal fáradságosabb.

A módszer nagyon hasonlít az abszolút koncentrációs módszerhez. A tesztcsövek gyógyszeres készítményekkel történő elkészítése ugyanúgy történik. Mint az abszolút koncentráció módszerében. A mycobacterium tuberculosis szuszpenziójának mag adagját azonban 10-szeresére csökkenti. Amely kiküszöböli a mycobacterium tuberculosis egyes törzseinek spontán rezisztenciájának gyakoriságát olyan gyógyszerekkel, mint az Etambutol, a protionamid, a capreomycin. Kontrollként 2 vagy 3 csöveket vetőmag adagban egyenlőnek kell lennie a tesztcsövekben, egymást követően 10 és 100-szoros hígítással. A stabilitás kritériuma a mycobacterium tuberculosis vizuálisan megfigyelt növekedésének aránya. Az 1. Sorozat gyógyszerei esetében a stabilitási kritérium a kezdeti populáció 1% -os növekedésének többletét jelenti a második sorban levő gyógyszerek esetében - a kezdeti érték 1 vagy több mint 10% -ának növekedése a kiválasztott kritikus koncentrációtól függően.

1997-ben egy munkacsoport WHO és a Nemzetközi Szövetség a bevált tuberculosis TB gyógyszer-rezisztencia tett kiigazításokat ezeknek a kritériumoknak, mely tekinthető ellenálló micobaktériumok amelyek nőnek a szilárd tojás média Löwenstein-Jensen a következő koncentrációkban:

• dihidrosztreptomicin - 4 μg / ml;
• izoniazid 0,2 μg / ml:
• rifampicin 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

2001-ben kritikus koncentrációkat javasoltak a következő másodlagos gyógyszerek (1% kritikus arányban):

• kapreomicin - 40 mcg / ml;
• protionamid - 40 mcg / ml;
• kanamicin - 30 μg / ml;
• viomicin - 30 mcg / ml;
• cikloszerin 40 μg / ml;
• aminosalicilsav - 0,5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

A növekedési eredményeket 4 hét elteltével, előzetes és 6 hetes termesztés után értékeljük - mint végső.

A pirazinamidra ható gyógyszerérzékenység meghatározására, amelyet a tuberkulózis modern kemoterápiájában széles körben alkalmaznak, az ajánlott kritikus koncentráció 200 μg / ml. Mindazonáltal eddig nem áll rendelkezésre általánosan elfogadott módszer a hatóanyagnak a szilárd táptalajjal szembeni ellenálló képességének meghatározására, mivel antibakteriális aktivitása csak a savas közegben (pH <6) nyilvánul meg, ami technikailag nehéz fenntartani. Ezenkívül a mycobacteria tuberculosis számos klinikai kultúrája vádolatlanul nő a tojás környezetben, savas környezetben.

Minőségének értékelésére eredményeinek gyógyszer-érzékenységi vizsgálatok a Mycobacterium, ajánlott, hogy minden új tétel közepes LJ ellenőrzik a párhuzamos meghatározása az érzékenysége a szokásos múzeumi törzs H37Rv. Ezenkívül vannak olyan mikrobiológiai kritériumok is, amelyeket fenn kell tartani, hogy a technikák jól reprodukálható és helyesen értelmezhető eredményt biztosítsanak. Ezek közé tartozik az a tenyészet életképességében a Mycobacterium tuberculosis, a szabályok homogén szuszpenziót állítunk elő, és szuszpenziós kultúrák kiválasztási szabályok Mycobacterium tuberculosis, a reprezentativitás a kiválasztott bakteriális tömeget. A gyógyszerrezisztencia meghatározásának megbízhatósága rendkívül szűkös bakteriális kibocsátással csökken.

Az utóbbi időben ígéretesnek tekintették a gyógyszerérzékenység automatizálással történő meghatározására szolgáló eljárást. Ezen a területen a legtökéletesebbek a VASTES MGIT-960 alapú fejlesztések. Ebben az esetben a mycobacterium tuberculosis gyógyszerérzékenységét módosított arányos módszer alapján határozzák meg. A meghatározás folyamán összehasonlítjuk a mycobacterium tuberculosis növekedési sebességét egy kontroll csőben és egy kábítószeres tesztcsövekben. Érzékenységének meghatározására, hogy streptomycin, isoniazid, zátony-pitsinu és ethambutolt használjuk gazdagítják adalékanyagok és antibiotikumokat tartalmazza a beállított SIRE kit. A pirazinamidra való érzékenység meghatározásához használja a PZA készletet. Ennek során a szuszpenziós vizsgálat Mycobacterium tuberculosis beoltott kémcsövek gyógyszerek, valamint a kontroll csöveket a feloldott szuszpenzióval 100-szor az összes drog esetén, kivéve a pirazinamid, ahol a szuszpenzió hígítása 10-szer. Stabilitás kritérium Mycobacteriumok jelzóként érték 100 GU, amikor a növekedés a kontroll csőbe 400 GU (cm „A tenyészet a mycobaktériumok izolálási módszerek”). Az eredmények számbavétele és értelmezése automatikusan történik, és a bemenet vagy a kiválasztott program határozza meg.

Kritikus koncentrációként a végkoncentrációkat egy folyadék tápközegben lévő kémcsőben alkalmazzák. Jelenleg kritikus koncentrációkat fejlesztettek ki mind az első, mind a második vonalbeli gyógyszerek esetében. Meg kell jegyezni, hogy a mycobacterium tuberculosis cikloszerinre és aminoszalicilsavra gyakorolt érzékenységét csak a tojás tápanyag-táptalaján határozzák meg.

Kidolgozott munka ismertetett protokoll rendszer lehetővé teszi, hogy tanulmányozza a drog iránti érzékenységet, mint dedikált kultúra (sűrű táptalaj), és az elsődleges Mycobacterium MGIT-növekedést in vitro. Az utóbbi lehetőség jelentősen csökkenti azt az időt kultúra, amely lehetővé teszi, hogy a teljes eredményt a kultúra Mycobacterium tuberculosis (beleértve a kábítószer-érzékenység) 3 hét után a gyűjtés időpontja az anyag, míg a hagyományos eljárással ez lehetséges csak a 3. Hónapban. Idővel a kapott eredmények, amikor a beteg intenzív kezelési fázisban van, kompenzálhatják a kutatás viszonylag magas költségeit.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

A mycobacteriumok differenciálódása

Figyelembe véve, hogy a használt tápközegek nem szigorúan szelektívek. Az elkülönített mikobaktériumok ezt követő differenciálását kötelezőnek tekintik. A differenciálás szükségességét a mycobaktériumok annak köszönhető, hogy számos funkcióval a kóros folyamatokat által okozott a nemzetség: eltérő utat és kimenetele a tuberkulózis és mycobacteriosis, jelenléte természetes gyógyszerrezisztencia néhány anti-TB gyógyszerek.

Felismerték, hogy a primér azonosító Mycobacterium tuberculosis komplex M. Nontubercular a mikobaktériumok végzi a következő jellemzőkkel: a növekedés üteme szilárd táptalajon, pigmentáció, telep morfológiáját, a sav jelenléte ellenállás és a hőmérséklet optimális növekedését.

Sajnos, nincs egyetlen laboratóriumi módszer megbízhatóan különbséget M. Tuberculosis komplex mycobaktériumok más saválló bacilusok, mégis a kombinációja fent leírt jellemzők a megadott eredmények az alábbiakban számos biokémiai tesztek azonosítását teszi lehetővé Mycobacterium tuberculosis komplex M. Valószínűleg 95%.

A differenciálódás Mycobacterium komplex M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii és mások) a lassan növő mycobacteriumok használt nontubercular alapvető biokémiai vizsgálatokat, hogy jelenlétének kimutatására a következő tünetek:

• a nikotinsav előállítási képessége (niacin teszt):
• nitrát reduktáz aktivitás;
• termostabil kataláz;
• nátrium-szaliciláttal való tápközeg növekedés (1 mg / ml).

További vizsgálatokként 500 μg / ml koncentrációjú paranitro-benzoesavat vagy 5% -os nátrium-kloridot tartalmazó tápközegben való növekedést is lehet alkalmazni.

Számos bakteriológiai laboratórium azonosítja ezeket a mikroorganizmusokat csak a komplexum szintjén, ami a laboratóriumok korlátozott képességeinek és a szakemberek módszertani képességeinek köszönhető.

A legtöbb esetben, a gyakorlatban azonban a differenciálódó M. Tuberculosis és M. Bovis elegendő a következő vizsgálatokat: niacin, a jelenléte nitrát, jelenlétében regisztráció és pirazinamidazy növekedési tartalmazó közegben 2 ug / ml-hidrazid tiofén-2-karbonsav. Figyelembe kell venni, hogy az M. Tuberculosis komplex mikobaktériumait a következő karakterkészlet jellemzi:

• lassú növekedés (több mint 3 hét);
• a növekedési hőmérséklet 35-37 ^° C;
• pigmentáció hiánya (elefántcsont);
• jelzett savas-gyors szín;
• pozitív niacin teszt;
• pozitív nitrát reduktáz teszt;
• a termostabil kataláz (68 ^° C) hiánya .
• A növekedés hiánya egy Levenstein-Jensen táptalajon, amely:
  • 1000 μg / ml nátrium-szalicilát,
  • 500 μg / ml paranitro-benzoesav,
  • 5% nátrium-klorid:
• növekedés 1-5 μg / ml tiofén-2-karbonsav jelenlétében.

Az izolált mikobaktériumok differenciálódásának jelentősége jelentősen megnő a tuberkulózissal vagy mycobacteriosissal összefüggő HIV / AIDS-esetek gyakoriságának növekedésével. Jelenleg nincsen abszolút bizonyosság arra nézve, hogy a gyakorlati regionális laboratóriumok készen álltak erre a munkamennyiség helyes elvégzésére.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

A tuberkulózis immunológiai diagnózisa

Számos univerzális jelenség, gyógyszer és immunológiai teszt létezik, amelyek eredetileg pontosan a tuberkulózissal vagy a mycobacteriumok elleni immunválasz modelljével rendelkeztek. Ezek közé tartozik a BCG Tuberculin, egy ilyen jelenség például kután DTH (tuberkulin - Pirquet és Mantoux reakció), a reakció, hogy a szubkután tuberkulin érzékenyített állatokat (Koch-jelenség). A fertőző betegségek egyik első ellenanyaga is kimutatható a tuberkulózisban. Természetesen a mélyebb megértéséhez jó tuberculosis immunitás mechanizmusok és azok genetikai kontroll, annál nagyobb lehet az immunológiai módszerek és gyógyszerek, amelyek befolyásolják az immunrendszert, gyakorlati problémák megoldására a TB.

A legfontosabb és legnehezebb gyakorlati probléma jelenleg a tuberkulózis kimutatása a lakosság tömeges szűrésének folyamatában. Azonban a "sikerek" (korlátozott anyag) számos beszámolója ellenére nincs megfelelő immunológiai módszer (reprodukálható "bármely karban") és a gyógyszeren.

Az immunológiai módszereket, különösen a szerológiai vizsgálatokat (antigének, antitestek meghatározása) és a tuberkulin-provokáló teszteket igen széles körben alkalmazzák a klinikai gyakorlatban.

A differenciáldiagnózisban használt immunológiai vizsgálatok közül elsősorban a szerológiai módszerek - az antigének és antitestek meghatározása a test különböző környezeteiben.

A mycobaktériumok tuberkulózisa elleni antitestek specificitása függ az immunológiai vizsgálatban alkalmazott antigénektől. Jelentős mennyiségű antigént javasolnak, amelyek közül az első a tuberkulin PPD:

• PAP és egyéb összetett készítmények a tenyésztőfolyadékból;
• ultrahangos szétesés;
• Triton kivonat és egyéb sejtfalak komplex készítményei;
• 5-antigén (Daniel);
• 60-antigén (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• kötőfaktor (trehalóz-6,6-di-mikolát);
• fenolos és más glikolipidek;
• lipopoliszacharid;
• fibronektin-kötő antigén;
• fehérjék (leggyakrabban rekombináns); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA stb.

Ennek eredményeként több éves kutatás az orosz és külföldi tudósok feltárták az alapvető törvények és hatékonyságát az antitest szerológiai diagnosztizálására tuberkulózis: a bonyolultabb antigénnel, a nagyobb érzékenységet és kisebb sajátossága a teszt. Sajátosságai a különböző országokban függ a lakosság az M. Tuberculosis és nontubercular mycobacteria tevékenységükben BCG oltást, és mások. A gyermekek, az információ tartalma szerodiagnosztizálására alacsonyabb, mint a felnőtteknél. Az elsődleges tuberkulózisban (gyakrabban gyermekekben) az IgM meghatározása sokkal informatívabb. Másodlagos IgG-vel. A HIV-fertőzött betegeknél az antitestek meghatározásában a szerodiagnosis informatív értéke csökken. Hatékonyság antitestek meghatározására számától függ a „klinikai szempontok”: folyamat aktivitás (a jelenléte vagy hiánya „Isolation” mycobaktériumok jelenléte bomlása üregek, a peritumorális), a gyakorisága a folyamat, az ideje annak áramlását.

Az enzim immunvizsgálat (ELISA) módszerének érzékenysége körülbelül 70%. A vizsgálat elégtelen hatékonysága alacsony specifikusságának köszönhető. Korábban megvizsgálták a magas kockázatú csoportokban a szerológiai szűrés lehetőségét, különösen a tüdő utáni tuberkulózisban szenvedő személyek körében.

Hogy fokozza a specificitás ELISA folytatja a keresést több specifikus antigének, ideértve a géntechnológiai úton előállított: ESAT-6 és mások (lásd fent). .. Szigorúan specifikus antigének (38 kDa, ESAT) alkalmazása növeli a specifitást. De jelentősen csökkenti az elemzés érzékenységét. Együtt IFA (kísérleti laboratórium vizsgálati rendszerek. Pl Pathozyme ELISA kit) kitekre is oldalsó immunkromatográfiás szűréssel (Mycodot), valamint más hasonló vizsgálatokat (dot-elemzést a membrán) egy vizuális értékelést a vizsgálati eredmény. E vizsgálatok során az elemzést 10-30 percig végezzük; nem igényelnek speciális felszerelés szükséges vizuális értékelést, amely kapcsolatban van egy bizonyos szubjektivitás. Ezek a módszerek hozzávetőleg azonos érzékenység és specificitás jellemzők (70% és 90-93%, sorrendben), mint a hagyományos ELISA.

Az immunelemzési módszerek használata meghatározó érték, mint kiegészítő, figyelembe véve az alkalmazott módszerek komplexét, a tuberkulózis differenciál diagnózisában, különösen az extrapulmonáris formák diagnózisában. A leghatékonyabb ELISA módszer a tuberkulózis meningitis diagnózisa a cerebrospinális folyadék vizsgálatában. Ebben az esetben az elemzés érzékenysége 80-85%, a specificitás pedig 97-98%. Vannak adatok a tuberkulózis uveitis diagnózisában a mycobacterium tuberculosis antitestek kimutatásának hatékonyságára tear fluidumban.

A gamma interferon szintézis indukciója in vitro

A gamma interferon (IFN-γ) egy specifikus immunvédő faktor, melyet makrofág enzimrendszerek aktiválásával valósítanak meg. A szenzitizált T-limfociták IFN-γ szintézisének indukciója kölcsönhatásba hozható a mycobacteriumok antigénjeivel.

Mint a tuberkulin PPD-ként használt antigének. és a specifikus antigének, előállíthatjuk géntechnológiai módosítást, különösen antigének ESAT-6 (korai szekretált antigén, amelynek a molekulatömege 6 kDa) és CFP-10 (tenyészet szűrlet fehérje 10 kDa). Genetikai vagy rekombináns antigének hiányoznak a BCG vakcina és más mikobaktériumok sejtjeiben. Tuberkulin alkalmazása esetén az IFN-γ indukciós teszt eredményei összehasonlíthatóak a tuberkulózis bőrvizsgálatának eredményeivel (közvetlen korreláció). Genetikailag módosított antigének alkalmazása esetén a vizsgálati eredmények pontosabbak és nem függenek a BCG korábbi vakcinációjától. A tuberkulózisfertőzést nem tapasztalt vakcinázott személyek vizsgálata során a teszt fajlagossága 99%. A vizsgálat érzékenysége a tuberkulózisban szenvedő betegek körében 81-89% között változik.

Vizsgálatok és diagnosztikai eszközök kerültek kifejlesztésre alapuló rövid távú sejtek tenyésztésére vagy teljes vér mononukleáris sejtek véréből izolált antigénekkel Mycobacterium tuberculosis in vitro ezt követő meghatározása IFN-γ koncentrációját vagy megszámoljuk a T-limfociták, amelyek szintetizálása IFN-γ. A kémcsőben szintetizált interferon koncentrációját ELISA-val határoztuk meg, az IFN-γ-et kötő monoklonális antitestek alkalmazásával. Ezután a standard IFN-γ kalibrálásával koncentrációját a lemez kémcsőjében vagy lyukaiban határozzuk meg.

Az Elispot teszt végrehajtásakor az IFN-y szintetizáló T-limociták száma. Az IFN-γ antitestekkel bevont lemez felületén számolják.

Fejlesztők Diagnosticum az IFN-γ in vitro indukció, amelyet az ügynökség által jóváhagyott Gyógyszerek és amerikai termékek, azt állítják, hogy a teszt nem lehet különbséget tenni a latens TBC-fertőzés aktív tuberkulózis. Ezért a magas fertőzést mutató területeken a vizsgálat nem közvetlenül diagnosztizál. Hazánkban azonban alkalmazható a tuberkulózis-fertőzés megkülönböztetésére a gyermekeknél a vakcinázás utáni allergiától, valamint a kezelési folyamat specifikus immunitásának felmérésére.

Jelenleg az in vitro specifikus tuberkulózis antigének indukálásának meghatározására szolgáló hazai tesztrendszert vizsgálják.

Az immunállapot és a tuberkulózis folyamata, az immunhiányosság

A tuberkulózis kezelésének folyamata emberekben változások vannak az antigémiában és az immunrendszer állapotában.

Az elváltozások és szövetek változásaira vonatkozó adatok nagymértékben ellentmondásosak. Az egyetlen dolog, amit jól meg lehet jegyezni, hogy a tuberkulózis granulomákban, rendszerint jelentős számú aktivált T-limfocitát mutatnak ki.

Két további rendelkezés megfogalmazására van szükség, amelyek szükségesek ahhoz, hogy megértsük az immunológiai mechanizmusok szerepét az emberben a tuberkulózis kezelésében:

• Az AIDS-betegek különösen magas a többszörös gyógyszerrezisztencia gyakoriságában;
• több gyógyszerrezisztenciával (és HIV-fertőzés hiányában) az immunitás zavarai (különösen a T-sejtek kapcsolata) különösen jelentősek.

Amikor a tuberkulózis széles körben alkalmazzák különböző módszerek immunmoduláció: ez elsősorban ható gyógyszerek elsősorban a T-sejtes immunitás és a rendszer a mononukleáris fagociták (timusz hormonok, izoforon, likopid, polioksidony et al.). Valamint az egész (enyhített) mikobaktériumok és azok komponensei.

A tuberkulózis molekuláris-biológiai diagnózisa

A molekuláris biológiai eljárások a diagnózis az fertőző betegségek közé tartozik, főleg, módszerek alapján manipulálni a genom anyagának bakteriális és virális patogének azonosítani különleges genetikai anyag - DNS-szegmenseket, amelynek a nukleotidszekvenciája specifikusak egy adott típusú vagy kórokozó törzsek elemezni konkrét DNS-szekvenciák gének, amelyek meghatározzák az érzékenységet a kórokozó bizonyos gyógyászati anyagok, hanem hogy elemezze a funkcionális a kórokozó bizonyos génjeinek aktivitását. Molekuláris biológiai módszerek voltak széles körben a tudományos kutatás és gyakorlati alkalmazása a diagnózis és ellenőrzés a különböző bakteriális és vírusos fertőzések megnyitása után 1985-ben, Carrie Myullisom (Nobel-díjat. 1989) polimeráz-láncreakció.

A polimeráz láncreakciós módszer elvei és lehetőségei

A PCR lehetővé teszi, hogy in vitro amplifikálják (szaporodjanak) a nukleotidszekvenciát (a kórokozó DNS-fragmensét) több órán keresztül, több millió alkalommal. Az egyedi DNS-láncok jelenlétében végzett reakció meghatározza a vizsgálat rendkívül nagy érzékenységét.

A DNS-lánc egyes régióinak nukleotidszekvenciája meghatározza a mikroorganizmus genetikai azonosságát, ami magyarázza a PCR nagyfokú specifitását.

Ennek értéke a technika kimutatására és vizsgálat a jellemzők Mycobacterium tuberculosis által okozott biológiai jellemzői mikroorganizmust nagyon lassú növekedés: megkettőződési ideje Mycobacterium tuberculosis DNS, amikor a tenyésztést 12-24 órán át.

A PCR módszer elve az amplifikációból áll - többször, több millió alkalommal. Egy adott DNS-szekvencia szekcióinak egy tubus-mikrovolumban való szaporítása a következő három reakciószakasz ciklikus megismétlése során, amelyek mindegyike különböző hőmérsékleti rendszerben halad:

• I. Fázis - a kettős szálú DNS denaturálása melegítéskor, a láncok divergenciájával;
• II. Szakasz - láncindítók (primer oligonukleotidok) komplementer kötődése (hibridizáció), szigorúan specifikus láncok terminális szakaszaihoz, amelyeket a DNS-fragmens szaporítására választottak;
• III. Lépés - a DNS-fragmens lánc befejezése egy termostabil DNS-polimeráz segítségével.

Az in vitro amplifikációhoz a mátrix DNS-molekuláknak kell lenniük. Négyféle deoxinukleozid-trifoszfát (nukleotid), amely a megfelelő nitrogénbázisokat tartalmazza: adenin (A), timin (T), guanin (D), citozin (C); mesterségesen szintetizált alapozó oligonukleotidok (láncindítók), amelyek 18-20 bázispárból állnak; termostabil DNS polimeráz enzim, amely hőmérséklet-optimuma 68-72 ^a C, és magnézium-ionok.

A PCR specifitása a DNS-fragmens választásától függ. Ennek megfelelően szintetizáló szárnyas oligonukleotidokat állítanak elő. A hibridizáció specifikussága és a DNS-lánc befejezése a következő nitrogénbázisok komplementaritásának elve alapján következik be: adenin-timin, guanin-citozin.

Ahhoz, hogy meghatározzuk a genomi tuberkulotikus mikobaktériumok komplex leghatékonyabb célpont amplifikációs a legtöbb vizsgálati rendszerek választott DNS-fragmens IS6110, amely a legtöbb törzsben a Mycobacterium tuberculosis-genom jelentős számú (10-20) az ismétlések, amely együtt specificitás, magas a vizsgálat érzékenységét. Ugyanakkor, a Mycobacterium tuberculosis törzsek leírt kis számú ismétlés, vagy nincs IS6110 fragmens.

A DNS-molekulák izolálása biológiai mintából

A PCR végrehajtásához a kórokozó DNS-molekuláit minimális térfogatban kell elkülöníteni a biológiai anyagtól, minimális mennyiségű nem-specifikus DNS-t és az enzim-DNS-polimeráz különböző inhibitorait.

A minták elkészítését olyan körülmények között kell elvégezni, amelyek megakadályozzák a minták keresztszennyeződését az izolált DNS-molekulákkal. Ehhez a klór tartalmú oldatokkal a helyiség ultraibolya, padló és munkalapok előkezelése szükséges. A tiszta kesztyűk, az eldobható kémcsövek és a tippek kötelező automatikus tisztítása az automatikus pipettákhoz.

Ahhoz, hogy izoláljuk a DNS-t Mycobacterium tuberculosis klinikai mintákból (cerebrospinális folyadék, bronchiális mosás), amely nem tartalmaz nagyszámú sejt, sejttörmelék, vagy ezek sói, elegendő ahhoz, hogy centrifugáljuk a minta 3-4 ezer. Rpm, hozzá az iszap 20-30 ul 2% -os oldat Triton X-100 és a-ra melegítjük 90 ^kb C-on 30 percig.

Előállításához a köpet mintákat kell hatékony cseppfolyósító, amelyet általában egy 4% -os nátrium-hidroxid és az N-acetil-L-cisztein (NALC) mennyiségben 50-80 mg mintánként - attól függően, minta viszkozitása. A NALC oldatot ex tempore kell elkészíteni, vagy a NALC por közvetlenül hozzáadható a mintához. Cseppfolyósodás után a mintákat 15 percen át 3000-4000 fordulat / perc sebességgel centrifugáljuk 50 ml-es injekciós üvegekben, pl. Ugyanolyan feltételek mellett, amelyeket a váladék előkészítéséhez ajánlott.

Az extrakcióhoz való DNS üledéket módszert alkalmazzák leggyakrabban alapján a használata egy 5-6 mólos guanidin-izotiocianát lizáló reagenst, mint a mikroporózus részecskék és a szilícium-oxid ( „diatomaföld”) szorbeáló DNS-molekula. A nem-specifikus anyagok, beleértve inhibitorok lehetséges, mossuk, majd 2,5 mólos guanidinium-izotiocianát és etanolos oldat, amely után a DNS-molekula deszorpciója vízben, és ezeket a mintákat végrehajtásához használt PCR. Az egyszerűség kedvéért a technológia DNS izolálás „diatómaföld” helyett gyakran mágneses mikrorészecskék bevont szilícium-oxid. Így részecskék lerakódása használunk, centrifugálás helyett különleges mágneses állvány mikrocsövekbe.

Oroszországban a mycobacteriumok immunmágneses elválasztásának eredeti módszerét fejlesztették ki a kórokozó DNS extrakciójával. A Mycobacterium tuberculosis immunomagnetikus elválasztást ferroparticles mérete 3-5 mikron, bevont szilícium-dioxid, amelyhez kapcsolódnak kémiai kötéssel poliklonális (nyúl) antitestek Mycobacterium tuberculosis. A lúgos lízist követően a köpet utáni mintákat semlegesítjük savas trisz-HCl-oldattal, és immunmágneses szorbenssel inkubáljuk. Ezután az immunoferroszemcséket egy mágneses rúddal gyűjtjük össze, cserélhető csúcsmal, mikrocsövön át, és kicsapjuk. 20-30 így ul 2% -os oldatának a Triton X-100 és 30 percig melegítjük 90 ^° C-on A felülúszót alkalmaztunk DNS-templátként a PCR-analízis.

Nehéz probléma a mycobacterium tuberculosis DNS izolálása biopsziás mintákból. Az enzimbiopszia esetében a proteináz K enzimot 200-500 mg / l végső koncentrációban alkalmazzuk 56 ^° C- ^os hőmérsékleten egy éjszakán át. Továbbá az egyik ismert módszer alkalmazható. A biopsziák PCR-analízisében a nem specifikus DNS feleslegét gyakran okozza a reakció gátlása, ami szükségessé teszi a DNS ismételt extrakcióját.

Az eredmények kimutatására szolgáló módszerek

A reakció befejezése után a kórokozó amplifikált DNS-fragmenseit különböző módszerekkel azonosítjuk.

A gélelektroforézis módszer jól ismert. A kapott DNS-fragmenst a kívánt specifikus DNS-fragmenst tartalmazó pozitív kontrollal azonosítjuk, vagy egy ismert méretű (a nukleotidpárok száma) fragmens alapján, amelyet standard molekuláris markerként határozunk meg.

Specifikus festék jelenlétében az etidium-bromid a kétszálú DNS-ben található. A szintetizált DNS-fragmenst az ultraibolya hatása alatt sávban fényként érzékeljük.

A DNS-fragmens méretét, amelyet az elektroforézissel kell meghatározni a kezdetektől, meg kell felelnie egy ismert molekulatömeg-markernek vagy pozitív kontrollnak.

Egyéb eljárások annak meghatározására PCR eredmények alapján a hibridizációs egy egyláncú PCR termékeket egy oligonukleotiddal azokkal komplementer - DNS-próba biotinnal jelöljük, majd kimutatási enzimatikus reakciók, például kötődés sztreptavidin-biotin alkalikus foszfatáz.

Az ilyen típusú kimutatásra alapozva olyan PCR-elemzőket hoztak létre, amelyekben a PCR-eredmények kimutatása automatikusan történik, az enzimatikus reakció megnyilvánulása után a minták optikai sűrűségének olvasása eredményeként.

E módszerek hátrányai a DNS-molekulák meglehetősen rövid darabjainak intralaboratorikus szennyeződésének lehetőségei. Amikor a molekulák új mintákat adnak be, PCR-be mátrixszá válnak és hamis pozitív eredményhez vezetnek.

E tekintetben a hamis pozitív eredmények elkerülése érdekében szigorú szabályokat kell bevezetni a telepek elválasztására és elszigetelésére: a DNS DNS-ből való kinyerése biológiai mintákból; helyek az eredmények kimutatásához (elektroforézis) a tiszta zónából. Ezek a helyiségek a valószínű szennyeződés zónája. Egy másik elszigetelt terület tiszta hely a kémcsövekben vizsgálandó DNS-minták PCR-reakciókeverékkel történő bevitelére. Végül azt feltételezzük, hogy a fő eszközt - a DNS-erősítőt - külön, esetleg irodahelyiségben kell elhelyezni.

A szennyeződés elkerülése a termékek az előző reakciók - néhány Likon-Amp PCR System teszt helyett dezoksinukleozidtimidina tartalmaznak dezoksinukleoziduridin amely, amikor in vitro szintézissel áramkör beépített helyett a megfelelő helyzetben, azaz A natív DNS-ben lévő timbin nitrogénbázisát uracil helyettesíti. Uracil DNS glycosylase adunk a reakcióelegyhez, hogy az analit, elpusztítja csak szennyező töredékek deoxiuridinné bontja, de nem a DNS natív analizáltuk. . A következő 94 ^° C- ^os melegítés inaktiválja ezt az enzimet, és nem zavarja a PCR-ben történő amplifikációt.

Az rRNS izotermikus amplifikációján alapuló tesztrendszert alkalmazunk, amelyre először a DNS-molekulák fordított transzkripcióját és szintézisét végezzük. Amely viszont egy mátrix az RNS-molekulák következő szintéziséhez. Az RNS-amplikont kimutatjuk egy akridin-festéses DNS-próbával, ha egy reakciócsőoldatban hibridizáljuk. Ez a módszer, a nagy érzékenység mellett, előnyös egy csőben történő elemzéssel, amely megakadályozza a szennyeződést. A szerzők szerint ennek a módszernek a légzőminta érzékenysége 90% -kal, 99-100% -os specificitással rendelkezik.

Új detektálási módszerek valós idejű PCR-ben valósulnak meg. Ezek a módszerek elsősorban a PCR-ben különböznek egymástól, és az eredmények kimutatását egy zárt csőben egyidejűleg hajtják végre. Ez nemcsak technológiai szempontból egyszerűsíti az analízis technikáját, hanem megakadályozza a laboratóriumi helyiségek és vizsgálati minták szennyeződését a korábbi PCR-termékekkel.

Valós idejű PCR-vel az eredmények kimutatása a fluorogén DNS-próbának a PCR-ben amplifikált specifikus DNS-fragmens általi hibridizálásából származó fluoreszcencia eredménye. Szerkezet fluorogén DNS-próbák megépíteni, hogy a fluoreszcens marker szabadul fel, amely az enzimatikus reakció vagy távolságot a kioltó molekula fluoreszcencia csak a specifikus hibridizáció a kívánt DNS-molekulát az amplifikálni a PCR. A szondával hibridizált molekulák számának növekedésével a fluoreszcencia növekedése a detektálható szinthez arányos az amplifikált termék molekuláinak számával. Mivel minden egyes ciklusban számú PCR-fragmens DNS-molekula megszorozzuk a fele, a ciklus számot, amelynél fluoreszcens meghatározzuk, és növeli fordítottan arányos a száma DNS-molekulák a kiindulási minta. Ha a reakció az, hogy bevezesse a kalibrátor több különböző, ismert koncentrációjú molekulák megfelelő DNS-fragmentumot a Mycobacterium tuberculosis, a számítógépes program használatának lehet számítani, és az összeget a genomiális DNS-t a vizsgálati anyagot.

Minden standard minta duplikált. A mennyiségi kritérium a meghatározott fluoreszcencia kialakulásához és növekedéséhez szükséges PCR ciklusok minimális száma. Az abszcisszán - a ciklusok száma; az ordinát a fluoreszcenciaérték. A DNS koncentrációja fordítottan arányos a fluoreszcencia megjelenéséhez szükséges ciklusok számával. A jobb oldali oszlopban (21-32) a megfelelő koncentrációk ciklikus számát jelöljük. A DNS-fragmensek 10-szeres koncentrációja közötti különbség 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 ciklus. Két betegnél az IS6110-fragmensek koncentrációja körülbelül 10 ³ / ml és 10 ⁴ / ml volt. Figyelembe véve a Mycobacterium tuberculosis genomjában elemzett fragmensek ismétléseinek (6-20) számát, a mikobaktériumok száma a klinikai mintákban körülbelül 100 és 1000 sejt.

A PCR alkalmazása a tuberkulózis diagnózisában

A PCR módszert leginkább a tuberkulózis gyorsított diagnózisára használják - mycobacterium tuberculosis kimutatása klinikai mintákban: köpet. Hólyagos kipirulás, pleurális elváltozás, vizelet, cerebrospinális folyadék, oszteolízis punctate, női nemi szervek aspirátumai és különböző biopsziás minták. Abban a vizsgálatban, a Hollandiában körülbelül 500 köpet és bronchiális mosás mintákból származó 340 betegnél igazolt diagnózisa pulmonális tuberculosis vizsgáltuk összehasonlítani a PCR módszerek, mikroszkópia és a kultúra vizsgálatokban keneteket. Az elemzés érzékenysége 92,6,88,9, illetve 52,4% volt. Az összes módszer specifitása körülbelül 99% volt.

Összehasonlítottuk a mycobacterium tuberculosis kimutatásának hatékonyságát kenet mikroszkóppal, a Levenstein-Jensen táptalajon való vetésre, a VASTES tesztrendszerre és a PCR analízisre. A PCR 74,4% -os érzékenységet mutatott, mikroszkópiai - 33,8%, sűrű táptalajon - 48,9% és VASTES - 55,8%. A Levenstein-Jensen táptalajon végzett vetés átlagos kimutatási ideje 24 nap. VASTES - 13 nap, PCR - 1 nap.

Megbeszélik a PCR alkalmazását mint érzékeny és gyors módszert a tuberkulózis-kezelés hatékonyságának ellenőrzésére.

Kimutatása Mycobacterium tuberculosis DNS PCR hatékony kemoterápiás meghatározva hosszabb ideig - átlagosan 1,7 hónap, szemben a kenet meghatározott fluoreszcens mikroszkópia, és 2,5 hónap, szemben a bakteriológiai vizsgálat.

A tuberkulózis extrapolmonáris formáinak diagnosztizálása

Értéke, mint egy érzékeny PCR eljárás különösen nagy a tüdőn kívüli formák, mivel ez képezi alapján ezek a klinikai és radiográfiás módszerek szokásos bakteriológiai módszerek a Mycobacterium tuberculosis diagnosztikai anyagok hatástalanok.

A vizsgálat a vizelet minták PCR eredménye pozitív 16 17 betegeknél, akiknél aktív TBC és negatív vizelet 4 betegnél inaktív vese tuberkulózis és 39 beteg húgyúti rendszer betegség nontubercular.

A csontvelő-aspirátumok vizsgálata során az ismeretlen eredetű lázban szenvedő betegek PCR-analízisének hatékonysága gyanított tuberkulózis esetén bizonyítást nyert. A tuberkulózis nyirokcsomó-gyulladás diagnózisához gyermekeknél 102 szúnyog aspirátumot és 67 gyermeket ért gyomorfekélyű lymphadenitis biopsziás mintáját vizsgálták. Pozitív eredményeket kaptunk: 71,6% valós idejű PCR. Fluoreszcens mikroszkópia - 46,3%. Kultúra kutatás - 41,8%. A "macskaregés" betegségben szenvedő betegek 50 nyirokcsomó-biopszia vizsgálatában minden eredmény negatív volt. Így a PCR-analízis 100% -os specifikusságát bizonyították. Ugyanabban a munkában, a nyirokcsomók punctura biopsziájával bizonyították az M. Avium kimutatásának lehetőségét.

A női nemi szervek tuberkulózisának diagnózisa, mint ismeretes, a diagnózis egyik legnehezebb problémája. Amikor vizsgáljuk PCR-biopsziák az endometrium, endometrium aspirátumok folyékony minták Douglas tér 14 (56%) 25-vizsgált betegek laparoszkópos gyanúja tuberculosis, pozitív eredményeket kaptunk. Kenet mikroszkóppal és tenyésztéssel 1, illetve 2 eredményt kaptunk. Ezek az esetek PCR-pozitívak is voltak. A legtöbb PCR-pozitív eredményt a szövettani vizsgálat szerint a tuberkulózis jellegzetes tüneteivel kapcsolatos esetekhez kapcsolták; kisebb szám - gyanúja a tuberkulózisnak a laparoszkópiai adatok alapján. A PCR analízis csak egy pozitív eredményét eredményezte a tuberkulózis laparoszkópos adatainak hiányában.

A tuberkulózis extrapolmonáris formáinak diagnosztizálása során a klinikusok gyakran kérdőjelezik a kórokozó kimutatásának lehetőségét a vérminták PCR-módszerrel végzett vizsgálatakor. Az irodalmi adatok azt mutatják, hogy a mycobacterium tuberculosis DNS-ből való kimutatása a vérmintákból a HIV-fertőzés messzemenő formáival lehetséges. A mycobacterium tuberculosis DNS-jét csak az átültetett vese- és immunszuppresszióban szenvedő betegek különböző szervek tuberkulózisában mutatták ki.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

A mycobacteriumok fajai azonosítása

A PCR-eljárással lehet elég hatékony gyors azonosítását mycobaktériumok tuberkulózis komplex és néhány faj a mycobaktériumok nontubercular, miután megkapta a kezdeti növekedést. Ebben az esetben a PCR használata 7-10 napot takaríthat meg, ami a pozitív eredmény későbbi kulturális azonosításához szükséges. A PCR-vizsgálat technikailag nagyon egyszerű, mivel nem igényli a klinikai anyag bonyolult minta előkészítését a magas érzékenység elérése érdekében. A tanulmányban 80 pozitív ebben a vizsgálati rendszerben (MB Vasto. Organon cég) minden pozitív tenyészetek PCR szigorúan specifikus és tartott 1 napig. Azonosításához más fajok mycobaktériumok a DNS előállítása a kórokozó tenyészet hibridizáljuk specifikus DNS jelölt próbák akridin és törzsek által észlelt megjelenése kemilumineszcenciával chemiluminometer vagy nitrocellulóz csíkokat vizuális értékelést a hibridizáció után. Egy ilyen készlet segítségével korlátozott számú fajot azonosítanak: a mycobacterium tuberculosis komplex. M. Avium, M. Avium komplex, M. Kansasii és M. Gordonae.

A.Telenti és mtsai. Is kifejlesztett egy viszonylag egyszerű és olcsó eljárást fajok azonosítása klinikailag fontos mikobaktérium fajok esetén PCR-rel és az azt követő kezelés két restrikciós enzimmel (enzimekkel tulajdonságokkal rendelkező vágott egy DNS-molekula specifikus pont). A DNS-fragmenst amplifikáljuk. Kódoló hősokk-fehérje (65 kDa), majd kezeljük a kapott PCR-DNS-fragmenst 439 nukleotid-pár külön két enzim - BstEII és Hae III. Ezután elemezzük agaróz gélelektroforézissel kapott két termék, meghatározása a méretük (bázispárok számát) alkalmazásával egy szabványos DNS-fragmentumok (molekuláris DNS-markerek) hosszúságú 100-1000 bázispár. Az egyes specifikus típusú (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, fortuitum) kimutatására két vagy három DNS-fragmens a különböző méretű az egyes restrikciós enzimmel. A kapott különböző DNS-méretek kombinációja lehetővé teszi ezeknek a fajoknak a megkülönböztetését maguk között.

A biológiai DNS-rétegek technológiáját fejlesztik. Amely egy tanulmányban több mint 100 fajta mycobacteriumot képes azonosítani.

A fajok meghatározása is elvégezhető PCR-amplifikációjával 16S rRNS variábilis régió, majd szekvenciálás amplikonok, összehasonlítva a megfelelő primer struktúra, amely lehetővé teszi azonosítását a több mint 40 mikobaktérium fajok esetén.

A PCR segítségével a mycobacterium tuberculosis komplexen belüli specifikus azonosítás is elvégezhető, beleértve az M. Bovis és az M. Bovis BCG differenciálódását. Ehhez elemezzük az RD1 genomiális régióiban lévő egyes gének jelenlétét vagy hiányát. RD9 és RD10. Az RD1 nincs jelen a M. Bovis BCG-ben, de jelen van virulens fajokban, köztük M. Bovis-ban.

A Mycobacterium tuberculosis PCR-vel történő gyógyszerérzékenységének meghatározása

Célkitűzések A molekuláris genetikai módszerek A hatóanyag érzékenységi vagy rezisztenciáját Mycobacterium tuberculosis csökkenti azonosítani mutációk specifikus nukleotidszekvenciákat ismert gének. Alapvető módszerek alapulnak akár direkt prochityvanii (szekvenálás) ezen szekvenciák az amplifikálás után, vagy hibridizációs biotin-jelzett amplifikált DNS-fragmenseket a PCR DNS-próbák. Mindkét alternatíva magukban azonosítására a nukleotid szubsztitúciók, a szekvenciák, amelyek segítségével DNS-próbák vezet hiányában vagy hiányos hibridizáció nitrocellulóz membránra enzim konjugátumot (sztreptavidin-alkalikus foszfatáz) - Módszer LIPA-Rif-TB.

Eljárás a fluoreszcencia egy lokálisan rögzített microsections komplementer DNS-próbákat ismert mutációk a PCR-rel amplifikált gén felelős régiók rezisztencia vagy a hatóanyag-érzékenység, úgynevezett mikrobiochipov módszerrel. Ennek a kutatásnak a fő algoritmusa a következő. Miután DNS-t izolálunk egy klinikai minta, vagy a kultúra a mycobaktériumok szükséges, hogy végezzen PCR-amplifikálása releváns fragmenseinek rpoB gén felelős a hatóanyag érzékenységét a rifampicin vagy katG és Inha proteineket kódoló géneket Mycobacterium felelősek érzékenység isoniazid. PCR eredményeket értékeltük agaróz gélelektroforézissel, amelyben megerősítik kézhezvételét megfelelő DNS-fragmenseket a kívánt hosszúságú. Ezt követően egy második forduló PCR-t hajtunk végre, hogy fluoreszkáló címkét juttassunk be a DNS-be. A PCR eredményeit ismételten gélelektroforézissel igazoltuk. Ezt követően, hibridizációt végeztünk (éjszakán át tartó inkubálás), majd mossuk a kapott anyagot a biochip, amely nagy számú rögzített egy kis üveglap rövid DNS-szálak (próbák), amelyek komplementerek nukieotidszekvenciát a hatóanyag-érzékeny típusú Mycobacterium tuberculosis a pontokon a lehetséges mutációk. Valamint a gyógyszerrezisztenciaért felelős mutáns szekvenciákhoz. Hely DNS-próbák a tányéron - szigorúan meghatározott, és a szint a megfigyelt fluoreszcencia való hibridizációt követően meghatározza az eredmény egy speciális olvasó berendezés van telepítve. E tekintetben az elemzés eredményeit egy speciális számítógépes program segítségével határozzák meg.

Az elmúlt években fejlesztettek alternatív módszereket a mycobacterium tuberculosis gyógyszerérzékenységének meghatározására valós idejű PCR-technika alapján, amely lehetővé teszi e vizsgálatok lezárt csöves vizsgálatának elvégzését.

Az 1. ábrán. 13-13 mutatja elemzés eredményét klinikai izolátumok Mycobacterium tuberculosis rezisztenciát meghatározó rifampicin PCR valós időben: 218 - kontroll mintában (érzékeny rifampicin); 93 - a Ser-Trp TCG-TGG mutációjának pozitív kontrollja; 4482 - pozitív kontroll Ser-Leu TCG-TTG mutációjára; 162-322 - kísérleti minták. Az amplifikáció kinetikai görbéinek kiszámítása 4 csatornán: 1. Csatorna: 393 - pozitív kontroll a Ser-Trp TCG-TGG mutációjára; 2. Csatorna: 4482 - pozitív kontroll Ser-Leu TCG-TTG mutációjára; 162, 163, 172, 295 - kísérleti minták; 4. Csatorna: a kísérletben részt vevő összes minta amplifikációjának kinetikai görbéi. Az amplifikációs reakció pozitív kontrollja. Következtetések: Az eredmények a elemzés szerint a következő mutációk, amelyek meghatározzák ellenállás rifampicin: mintákban 162.163.172.295 - Ser-Leu TCG-TTG. Ugyanezt az elvet alkalmaztuk a katG és inhA gének által az isoniazidra kifejtett rezisztencia meghatározására, amely meghatározza a leggyakoribb mutációkat.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

A mycobacterium tuberculosis törzs azonosítása

A legalaposabban tanulmányozott azonosítási eljárása a törzsek Mycobacterium tuberculosis egy technika az úgynevezett restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP RFLP,., Vagy az angol változat), és amely alapul fragmentirovanin (korlátozás) Mycobacterium tuberculosis DNS-enzim PvuII és a kapott fragmensek ezt követő hibridizáció bizonyos specifikus szekvenciákat DNS- az IS6110 ismételt eleme. Fajon belüli változékonyság valósul különböző számú ismétlések IS6110 és helyükre a DNS-t. Valamint a különböző távolságok között bizonyos támadási pontokat restrikciós enzim (restrikciós helyek) és az elem IS6110. Ez a technológia nagyon bonyolult és időigényes. Kezelés után kivont DNS-t egy kultúra Mycobacterium tuberculosis, gélelektroforézist végzünk egy restrikciós enzimmel, majd át DNS-fragmenseket különböző hosszúságú egy nitrocellulóz membránra, hibridizációt végeztünk fragmensekkel IS6110-elem és detektálható enzimatikus reakciókat. Az így kapott minta specifikus DNS sávok jellemzi a törzs a Mycobacterium tuberculosis. A számítógépes elemzés segítségével feltárják a törzsek azonosságát vagy rokonságát. Annak ellenére, hogy az RFLP módszer a legkülönbözőbb, azaz azonosítja a legnagyobb különbségek száma a vizsgált törzsek, hatástalan egy kis számú (kevesebb, mint 5) IS6110-ismétlődések megfigyelt egyes törzsek. Az 1. ábrán. A 13-14. Ábra bemutatja a törzsek RFLP-tipizálását.

Alternatív lehet a térbeli DNS-szekvenciák polimorfizmusának spoligotipizálásának analízise - a DR régió közvetlen ismétlődése közötti közbenső. A törzsek spoligotipizálása során a PCR-t a DR területet határoló primerekkei hajtják végre, majd különböző hosszúságú töredékek képződnek, amelyek hibridizálnak a DNS változó közegrészeivel. A DR régió távtartó szekvenciáinak elemzését ismertetjük. A kutatók szerint sokkal egyszerűbb, produktívabb és alkalmas a törzsek elsődleges szűrésére és az előzetes járványtani elemzésre, valamint a közvetlen klinikai anyagokra.

Nyilvánvaló, hogy egy hatékonyabb és technikailag hozzáférhető módszer a VNTR (az angol szavak rövidítése), vagy a mikobaktérium tuberkulózis DNS-ben lévő pontos tandem ismétlések változó számának meghatározására szolgáló módszer. Ez a módszer csak a PCR használatán alapul, és nem igényel további manipulációt. Mivel különbözõ törzsek és különbözõ lókuszok tandem ismétlõdései különböznek egymástól, a különbözõ méretû fragmenseket meghatározzák és elemzik a PCR-termékek keletkezõ elektroforge- ramán. A kutatók szerint a VNTR alkalmazásával a törzsek nagyobb megkülönböztetése érhető el, mint az RFLP módszerrel.

Az utóbbi években nagy figyelmet fordítottak a W-Beijing család (a pekingi törzs) Mycobacterium tuberculosis törzseinek eloszlására, amelyek nagyrészt gyógyszerrezisztensek.

Alapvető követelmények a molekuláris biológiai kutatás minőségére

[72], [73], [74], [75],

A PCR alapvető szabályozási dokumentuma

Megrendelések az orosz Egészségügyi Minisztérium: №45 származó 2000/07/02 g .. Szám 109 g 2003/03/21 .. Szám a 64 2000/02/21 Az iránymutatás: 1.3.1888-04 „munkaszervezési vizsgálatok PCR anyag fertőzött kórokozó biológiai a patogenitás III-IV. Csoportjának hatóanyagai "; 1.3.1794-03 "Az I-II. Patogenitású csoportok mikroorganizmusával fertőzött PCR anyag vizsgálata". 2003.; 3.5.5.1034-01 „Dekontaminálás az anyag, a fertőzött baktériumokat I-IV patogenitási csoportok Amikor PCR,” 2001 11. Függeléke egységes utasításokat mikrobiológiai vizsgálati módszerek azonosítása, diagnózis és a kezelés a tuberkulózis.

[76], [77], [78]

A személyzet

Végrehajtása molekuláris biológiai kutatások tarthat az orvosok a klinikai laboratóriumi diagnosztika, az orvosok bakteriológus, virológusokat, orvosok, biológusok, klinikai diagnosztikai laboratórium, valamint a szakemberek középfokú egészségügyi oktatás, telt specializáció és magas szintű képzés az előírt módon.

Laboratóriumi helyiségek elrendezése

A következő laboratóriumi helyiségek szükségesek:

• A mintakezelési terület olyan laboratórium, amely a III-IV. Patogenitási csoport fertőző ágenseivel foglalkozik a 13.1888-04. Módszertani utasítás szerint.
• Zóna a reakcióelegyek előállításához PCR - laboratóriumi terem, amely védelmet nyújt a belső laboratóriumi szennyeződéstől - "tiszta" zónától.
• • Ha elektroforézist vagy hibridizációt alkalmaznak a PCR termékek elemzéséhez. Laboratóriumi helyiség, amelyben a megszorzott DNS-fragmenseket kivont csövek és amplifikáció, sorrendben, hogy a környezetbe, a követelményeknek megfelelően a PCR laboratóriumok (1.3.1794-03 iránymutatás Orientációs 1.3.1888-04) teljes mértékben meg kell elkülönül az előző bekezdésekben feltüntetett helyektől. Meg kell zárni a mozgás zóna zónaelektroforézis minta kezelése és a „tiszta” területén a teljes személyzet, felszerelések, olyan anyagok és tárgyak, valamint az átadása levegőt a szellőztető rendszer, illetve ennek eredményeként a huzat. Ez a zóna nem szükséges a PCR-termékek fluorimetriás kimutatásához.
• A dokumentáció és az eredmények feldolgozásának helyszíne számítógépek és szükséges irodai berendezések. Ez a hely olyan berendezéseket tartalmazhat, amelyek a csövek kinyitása nélkül érzékelik a PCR-termékeket. - fluoreszkáló PCR detektorok és hőciklusok valós idejű PCR-hez.

A köpet elsõdleges kezelésére vonatkozó egészségügyi és epidemiológiai követelmények hasonlóak a mikobaktériumok tuberkulózisával való munkavégzés standard mikrobiológiai követelményeihez.

[79], [80], [81], [82],

PCR diagnosztikai laboratóriumi berendezések befejezése

A laboratórium felszereléseket tartalmaz a következő helyiségekben.

• A mintaelőkészítés helyiségei a következő felszerelést tartalmazzák: II. Osztályú "SP-1.2" védőfólia: "Eppendorf" típusú tesztcsövek fűtő burkolatával ellátott szilárd állapotú termosztát; mikrocentrifuga 13 000 fordulat / perc sebességgel; centrifuga (Vortex); hűtőszekrény -20 ^és C 10- ^{körülbelül} C; a "Rroline" sorozat változó térfogatú pipere; OM-1 csapdákkal ellátott szivattyú; pipetta állvány; állvány munkaállomás 200x0,5 ml; állvány munkaállomás 50x1,5 ml; A tesztcsövek 80x1,5 ml-es tárolására szolgáló állványok;
• Reakciókészítő előkészítő helyiség: Védőkamra PCR-doboz ("Laminar-C 110 cm"); centrifuga - Vortex; A Proline sorozat változó térfogatú pipettái; pipetta állvány; állvány munkaállomás 200x0,2 ml; A tesztcsövek 80x1,5 ml-es tárolására szolgáló állványok; hűtőszekrény -20 ^a C és + 10 ^a C;
• helyiség elektroforézishez: kamera vízszintes elektroforézishez; tápegység; átvilágító;
• DNS-erősítő vagy nukleinsav elemző (PCR valós időben) számítógép és szoftver; elhelyezhető bármilyen tartalék helyiségben. Ha valós idejű PCR technológiát használ. Nincs szükség elektroforézisre.

[83], [84], [85], [86]

Külső minőségellenőrzés

Az objektíve megbízható eredmények megszerzése érdekében a laboratóriumoknak részt kell venniük a laboratóriumi kutatás minőségének külső értékelésében.

A minőségirányítási rendszerben résztvevők; 12 ampulla fagyasztva szárított baktérium sejt szuszpenziókat, melyek közül kettő tartalmazzák az E. Coli E. Coir, 3 flakon Mycobacterium tuberculosis (avirulens törzs) 10 ² / ml; 3 ampulla hasonló törzs sejtjeivel 10 ⁴ / ml koncentrációban ; 2 ampulla a nem tuberkulózis mycobacteriummal M. Avium-intracellulare és M. Kansasii 10 ⁵ / ml koncentrációban .

A külsõ minõségértékeléssel kapcsolatos elosztott teszteket két független laboratóriumban tesztelték, amelyek széleskörû tapasztalattal rendelkeznek ezen a területen.

[87], [88]