Immunológiai vizsgálatok az urológiában

Egy urológiai betegnek immunogramot felírni azt jelenti, hogy a kezelőorvos gyanítja az immunrendszer rendellenességeinek jelenlétét. Az ismétlődő bakteriális, vírusos, gombás fertőzések, allergiás tünetek, szisztémás betegségek ezen rendellenességek jelei lehetnek, amelyeket számos szindróma (fertőző, onkológiai, allergiás, autoimmun, limfoproliferatív) jellemez. Egy betegnek több szindrómája is lehet. Például a krónikus fertőző betegségek (fertőző szindróma) immunhiányt okozhatnak, az immunhiány pedig fertőző és onkológiai betegségekre való hajlamként nyilvánulhat meg (onkológiai szindróma). A fertőzésekre való hajlam a másodlagos immunhiány hátterében is előfordulhat, amely limfoproliferatív betegség, például leukémia következtében alakult ki. Az immunrendszerben a kóros elváltozásoknak három fő csoportja van:

• az immunrendszer egyik vagy másik láncszemének mennyiségi vagy funkcionális hiányossága, ami immunhiányos állapot kialakulásához vezet;
• az immunrendszer antigének felismerésének zavara, ami autoimmun folyamatok kialakulásához vezet;
• hiperreaktív vagy "perverz" immunválasz, amely allergiás betegségek kialakulásában nyilvánul meg.

Az immundiagnosztika szűrő (1. szintű tesztek) és tisztázó (2. szintű tesztek) módszerei. Az előbbiek az immunrendszer zavarainak rögzítésére, az utóbbiak pedig a megvalósításukban részt vevő mechanizmusok megállapítására szolgálnak a további immunkorrekció céljából.

B-sejtes immunitás

Szűrési módszerek

• A B-limfociták relatív és abszolút számának meghatározása immunfluoreszcenciával vagy áramlási citofluorometriával, B-sejt antigének elleni monoklonális antitestekkel (CD19, CD20, ahol CD a differenciálódási klaszterek). A felnőtteknél a B-limfociták normál tartalma a leukociták teljes számának 8-19%-a, vagyis 190-380 sejt/μl. A B-limfociták tartalmának növekedése akut és krónikus bakteriális és gombás fertőzésekben, krónikus májbetegségekben, szisztémás kötőszöveti betegségekben, krónikus limfocitás leukémiában és mielómában fordul elő.
• Nem specifikus immunglobulinok (F, M, G, E) koncentrációjának meghatározása egyszerű radiális immundiffúzióval, nefelometriával vagy turbometriával, radioimmunassay-vel vagy enzim immunassay-vel (ELISA). Felnőttek normái: immunglobulin (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Az immunglobulinok koncentrációjának növekedése ugyanazon kóros állapotokban fordul elő, mint amelyekben a B-limfociták tartalmának növekedése következik be. Az immunglobulinok koncentrációjának csökkenése veleszületett hipogammaglobulinémia, az immunrendszer daganatai, a lép eltávolítása, fehérjevesztés, vese- vagy bélbetegségek, citosztatikumokkal és immunszuppresszánsokkal történő kezelés esetén fordul elő.

Tisztázási módszerek

• A vérben keringő immunkomplexek meghatározása szelektív polietilénglikolban történő kicsapással, majd spektrofotometriás sűrűségvizsgálattal (normál 80-20 U). A keringő immunkomplexek számának növekedése jellemző az akut bakteriális, gombás, vírusos fertőzésekre, autoimmun, immunkomplex betegségekre, szérumbetegségre, 3-as típusú allergiás reakciókra;
• Specifikus immunglobulinok meghatározása a vérben bakteriális és vírusos antigénekkel, dezoxiribonukleinsavval (DNS) autoimmun betegségekben, spermiumellenes (autoimmun meddőség) és veseellenes antitestek (pyelonephritis és glomerulonephritis) kimutatása radiális immundiffúziós vagy ELISA módszerrel.
• Spermiumellenes antitestek meghatározása spermiumban [MAR teszt (vegyes antiglobulin reakció)], normál - negatív eredmény.
• Az immunglobulinok koncentrációjának meghatározása a vizeletben a pyelonephritis és a glomerulonephritis közötti differenciáldiagnózis céljából (proteinuria szelektivitása).
• Az IgE-tartalom meghatározása a prosztata nedvében allergiás prosztatagyulladás diagnosztizálására radiális immundiffúziós módszerrel vagy ELISA-val.
• A B-limfocita blaszttranszformáció B-sejt mitogénre adott válaszának vizsgálata (körmös mitogén a B-limfocita blaszttranszformáció reakciójának stimulálására T-limfociták jelenlétében), amelynek normatív értéke 95-100%.

T-sejt kapcsolat az immunitásban

Szűrési módszerek

• Az érett CD3 T-limfociták relatív és abszolút számának meghatározása immunfluoreszcens reakcióval vagy áramlási citofluorometriával monoklonális anti-CD3 antitestek felhasználásával. A felnőtteknél a norma 58-76% vagy 1100-1700 sejt/μl. A T-limfociták számának csökkenése a sejtes immunitás elégtelenségének mutatója. Ez jellemző bizonyos másodlagos és primer immunhiányos állapotokra (krónikus bakteriális és vírusfertőzések: tuberkulózis, szerzett immunhiányos szindróma, rosszindulatú daganatok, krónikus veseelégtelenség, sérülések, stressz, öregedés, alultápláltság, citosztatikumokkal történő kezelés, ionizáló sugárzásnak való kitettség). A T-limfociták számának növekedése immunhiperaktivitás hátterében vagy limfoproliferatív betegségekben fordul elő. Gyulladás esetén a T-limfociták száma először növekszik, majd csökken. A T-limfociták számának csökkenésének hiánya krónikus gyulladásos folyamatra utal.
• A limfocita alpopulációk értékelése.
  • T-helperek (anti-CD4 antitestek) számának meghatározása. Normális esetben 36-55% vagy 400-1100 sejt/mcl. Ezen sejtek számának növekedése autoimmun betegségekben, Waldenström-kórban, transzplantáció-ellenes immunitás aktiválódásában fordul elő; a T-helperek számának csökkenése krónikus bakteriális, vírusos, protozoon fertőzésekben, tuberkulózisban, szerzett immunhiányos szindrómában, rosszindulatú daganatokban, égési sérülésekben, sérülésekben, alultápláltságban, öregedésben, citosztatikumokkal történő kezelésben, ionizáló sugárzásnak való kitettségben fordul elő.
  • A T-szupresszorok (anti-CD4 antitestek) számának meghatározása. Normális esetben 17-37% vagy 300-700 sejt/μl. A T-szupresszorok számának növekedése ugyanazon körülmények között következik be, amelyekben a T-helperek száma csökken, és csökkenésük ugyanazon körülmények között következik be, amelyekben a T-helperek tartalma nő.
  • CD4/CD8 immunregulációs index, normális esetben 1,5-2,5. Hiperaktivitás 2,5 feletti értékekkel (allergiás és autoimmun betegségek); hipoaktivitás - 1,0 alatt (krónikus fertőzésekre való hajlam). A gyulladásos folyamat kezdetén az immunregulációs index emelkedik, majd amikor alábbhagy, normalizálódik.

Tisztázási módszerek

• A természetes ölősejtek (NK-sejtek) számának meghatározása - anti-CD16 és anti-CD56 antitestek. A CD16 limfociták normája 6-26%, a CD56 - 9-19%. Az NK-sejtek számának növekedése a transzplantátum kilökődése során, csökkenése - vírusfertőzések, rák, primer és szekunder immunhiányok, égési sérülések, sérülések és stressz, citosztatikumokkal történő kezelés és ionizáló sugárzásnak való kitettség esetén következik be.
• Az interleukin-2 receptorral (aktivációs marker) rendelkező T-limfociták számának meghatározása - anti-CD25 antitestek. A norma 10-15%. Számuk növekedése allergiás betegségekben, transzplantátum kilökődésében, a tímusz-függő antigénekre adott válaszban figyelhető meg az elsődleges fertőzés akut időszakában, csökkenése pedig ugyanazon betegségekben, amelyekben az NK-sejtek száma is csökken.
• Az aktivációs marker - II. osztályú hisztokompatibilitási molekula HLA-DR - expressziójának vizsgálata. Fokozott expresszió fordul elő gyulladásos folyamatokban, hepatitis C-ben, lisztérzékenységben, szifiliszben és akut légúti betegségekben szenvedő betegeknél.
• A limfociták apoptózisának értékelése. A limfociták apoptózisra való felkészültségéről nagyjából képet kaphatunk a Fas receptor (CD95) expressziója alapján a felszínükön, valamint a bd-2 protoonkogén expressziója alapján a mitokondriumokban. A limfociták apoptózisát két fluoreszcens festékkel történő kezeléssel mérjük: propidium-jodiddal, amely a DNS-fragmentumokhoz kötődik, és annexin Y-nal, amely a foszfatidilszerinhez kötődik, és az apoptózis kezdetén jelenik meg a sejtmembránon. Az eredményeket áramlási citofluorométerrel értékeljük. Az eredményeket a különböző festékekkel festett sejtek aránya alapján számítjuk ki. A festetlen sejtek életképesek, a csak annexin Y-hoz kötődő sejtek az apoptózis korai megnyilvánulásai, a propidium-jodiddal és annexin Y-nal festődő sejtek az apoptózis késői megnyilvánulásai, a csak propidium-jodiddal történő festés nekrózist jelez.
• A T-limfocita proliferáció in vitro vizsgálata.
  • Változások a sejtek blasztogenezisében - limfocita blaszt transzformációs reakció. A leukocitákat bármilyen növényi eredetű mitogénnel (lektinekkel) inkubáljuk. A fitohemagglutinint leggyakrabban 72 órán át alkalmazzák, majd kenetet vesznek, megfestik és megszámolják a blasztok számát! A stimulációs index a transzformált sejtek százalékos aránya a kísérletben (fitohemagglutininnel töltött tenyészet) a transzformált sejtek százalékos arányához képest a kontrollban (fitohemagglutinin nélküli tenyészet). A limfocita blaszt transzformációs reakciót radioaktív jelölés (ZN-timdinum) hozzáadásával lehet értékelni a tenyésztett sejtekhez, mivel a DNS-szintézis fokozódik a sejtosztódás során. A proliferatív válasz zavarai mind primer, mind szekunder immunhiányos állapotokban előfordulnak fertőzésekkel, rákkal, veseelégtelenséggel és sebészeti beavatkozásokkal összefüggésben.
  • Ezekben a vizsgálatokban az aktivációs markerek (CD25, transzferrin receptor - CD71) és a II. osztályú fő hisztokompatibilitási komplex HLA-DR molekulájának expresszióját vizsgálják, amelyek gyakorlatilag hiányoznak a nyugalmi állapotú T-limfocitákból. A T-limfocitákat fitohemagglutininnel stimulálják, 3 nap elteltével az aktivációs markerek expresszióját direkt vagy indirekt immunfluoreszcens reakcióval, áramlási citofluorometriával elemzik, az izolált receptorok elleni monoklonális antitestek felhasználásával.
  • Az aktivált T-limfociták által szintetizált mediátorok [interleukin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon stb.] mennyiségének mérése radioimmunoassay vagy ELISA segítségével. Különösen fontos a γ-interferon és az IL-4 koncentrációjának meghatározása, mint a Th1 és Th2 markerek az aktivált tenyészetek felülúszójában és a sejten belül. Ha lehetséges, hasznos meghatározni a megfelelő citokin génexpresszióját a termelősejt mátrix ribonukleinsavszintje és a megfelelő citokinek receptorainak expressziójának intenzitása alapján.
    
• Limfocita migráció gátlási reakció. A szenzibilizált T-limfociták antigénnel reagálva limfokineket választanak ki, beleértve a limfocita migrációt gátló faktorokat is. A gátlási jelenség akkor figyelhető meg, amikor mitogének jutnak be a sejtkultúrába. A gátlás mértékének értékelése lehetővé teszi a limfociták citokinszekréciós képességének megítélését. Normális esetben a migrációs gyakoriság, az adott mitogéntől függően, 20-80%.
• Az NK-sejtek citotoxicitásának felmérése. Meghatározzák a természetes ölősejtek azon képességét, hogy elpusztítsák a K-562 eritromieloid sejtvonal célsejtjeit. Ha antitest-függő citotoxicitást vizsgálnak, IgG antitestekkel bevont célsejteket használnak. A célsejteket 3H-uridinnal jelölik, és effektor sejtekkel inkubálják. A célsejtek pusztulását a radioaktív jelölés oldatba történő felszabadulása alapján értékelik. A citotoxicitás csökkenése rosszindulatú daganatokban jelentkezik. Bizonyos esetekben, amikor az interleukinokkal történő kezelés hatékonyságának előrejelzésére van szükség, az NK-sejtek citotoxicitását bizonyos citokinekkel történő inkubálás során értékelik.

A fagocitafunkció vizsgálata

Szűrési módszerek

A mikrobiális sejtek fagociták általi felszívódásának intenzitásának vizsgálata (latex részecskék fagocitózisa, staphylococcus, E. coli vagy a betegből izolált mikroorganizmusok tesztkultúrája). Heparinizált vér centrifugálásával izolálják a leukocita szuszpenziót, amelyhez opszonizáció céljából IV. vércsoportú szérumot adnak (az opszoninok a fagocitózist fokozó fehérjék). A mikrobiális szuszpenziót hígítják, leukocitákkal keverik és 120 percig inkubálják, az inkubáció megkezdése után 30, 90, 120 perccel elemzésre mintákat vesznek. A gyűjtött leukocita szuszpenzióból kenetet készítenek. A következő fagocitózis mutatókat határozzák meg:

• fagocita index - a sejtek százalékos aránya, amelyek az inkubációt követő 30 és 120 percen belül beléptek a fagocitózisba; a fagocita index (30) standard értéke 94%, a fagocita index (120) pedig 92%;
• fagocitaszám - az intracellulárisan elhelyezkedő baktériumok átlagos száma; a fagocitaszám (30) standard értéke 11%, a fagocitaszám (120) 9,8%;
• fagocitaszám-együttható - a fagocitaszám (30) és a fagocitaszám (120) aránya; általában 1,16;
• Neutrofil baktericid index - a fagocitákban elpusztított mikrobák számának és az elnyelt mikrobák teljes számának aránya; normális esetben 66%.

Tisztázási módszerek

• A fagociták baktericid képességének vizsgálata nitrokéke tetrazóliumos (NBT) tesztben - NBT teszt. Sárga nitrokéke tetrazóliumos festéket adnak a leukocitákhoz. Amikor a neutrofil elnyeli a festéket, redukciós folyamat játszódik le a szabad oxigéngyökök hatására, ami kék elszíneződést eredményez. A reakciót 96-lyukú lapos aljú lemezen hajtják végre. Az első három kútba Hanks-oldatot (spontán NBT) adnak NBT és leukociták keverékével, a másodikba pedig latex részecskéket; az elegyet 37°C-on 25 percig inkubálják. Az eredményeket 540 nm-en olvassák le egy leolvasón, és tetszőleges egységekben fejezik ki. A stimulációs együtthatót (K _st ) kiszámítják, amely egyenlő a stimulált kútokban lévő optikai sűrűség és a stimuláció nélküli kútokban lévő átlagos optikai sűrűség arányával. Egészséges emberekben az NBT _spontán = 90 ± 45 CU, az NBT _stimul = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78±0,36.
• Adhéziós molekula vizsgálat. Az áramlási citofluorometriát a CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18 felszíni antigének expressziójának meghatározására használják. A károsodott adhézióval járó immunhiányok visszatérő fertőzésekben, lassú sebgyógyulásban és a fertőzés gócpontjaiban lévő genny hiányában nyilvánulnak meg.

A komplementrendszer vizsgálata

Szűrési módszerek

A komplement hemolitikus aktivitásának meghatározása a komplement aktiváció klasszikus útját vizsgálja. Beteg és egészséges személy szérumának különböző hígításait adják antitestekkel bevont eritrocitákhoz. A hemolitikus aktivitás mértéke a szérum azon hígításának reciproka, amelynél az eritrociták 50%-a elpusztul. A hemolízis mértékét fotometriásan becsülik meg a hemoglobin oldatba történő felszabadulása alapján. A komplement hemolitikus aktivitásának csökkenése figyelhető meg vesekárosodással járó szisztémás lupus erythematosusban, akut glomerulonephritisben, kombinált immunhiányos betegségekben, myasthenia gravisban, vírusos hepatitiszben, limfómákban, növekedése pedig obstruktív sárgaságban, Hashimoto-pajzsmirigy-gyulladásban, reumában, reumatoid artritiszben, noduláris periarteritisben, dermatomyositisben, miokardiális infarktusban, fekélyes vastagbélgyulladásban, Reiter-szindrómában és köszvényben.

Tisztázási módszerek

• Komplement komponensek meghatározása. A mennyiségi meghatározást radiális immundiffúzióval és nefelometriával végzik.
  A vizsgálat nem informatív, kivéve, ha a komplement komponensek antigén tulajdonságai megváltoznak.
• Megállapították, hogy a komplement Clq komponense fokozza a fagocitózist és közvetíti a sejtes citotoxicitást. Csökkenése immunkomplex betegségekben, szisztémás lupus erythematosusban, gennyes fertőzésekben és daganatokban fordul elő.
• A C3 komponens részt vesz a klasszikus és alternatív komplement útvonalak aktiválásában. Koncentrációjának csökkenése krónikus bakteriális és gombás fertőzésekkel, keringő vagy szöveti immunkomplexek jelenlétével jár.
• A C4 komponens részt vesz a klasszikus útvonal aktiválásában. Koncentrációjának csökkenése az immunkomplexek általi komplement aktiváció elhúzódó folyamatával és a klasszikus komplement útvonal aktiválódását szabályozó C1 inhibitor koncentrációjának csökkenésével jár. A C4-hiány szisztémás lupus erythematosusban fordul elő, a C4 szintjének emelkedése vesebetegségben, transzplantátum-kilökődésben, akut gyulladásban és gyomor-bélrendszeri betegségekben jelentkezik.
• A C5a a C5 molekula egy kis fragmentuma, amely a komplementrendszer aktiválódása következtében válik le róla. Koncentrációja gyulladás, szepszis, atópiás és allergiás betegségek során megnő.
• A Cl-gátló egy multifunkcionális faktor. Szabályozza a komplement C1 komponens aktiválódását, gátolja a kallikrein, a plazmin és az aktivált Hageman faktor, a Cls és az Or proteázok aktivitását. A C1-gátló hiánya angioödémához vezet.
• A komplement funkcionális vizsgálata. A tesztszérumot egy komplementkomponenst nem tartalmazó standard szérumhoz adják, és meghatározzák a komplement hemolitikus aktivitását. Ha a hemolitikus aktivitás nem normalizálódik, akkor a tesztszérumban lévő komplementkomponens aktivitását csökkentnek tekintik.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]